专利名称：一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法。
背景技术：
鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)起源于西亚、地中海沿岸，现全球播种面积已有1. 5 亿亩，是目前世界上第二大食用豆类作物，维吾尔族名为诺胡提，在新疆有2500年的生长 历史，是维吾尔医常用药材，已收载在中华人民共和国卫生部《药品标准》维吾尔药分册和 《维吾尔药志》，具有清除异常体液，开通体液闭阻，调节机体等作用。用于身体瘦弱，性欲低 下，食欲不振，皮肤瘙痒及糖尿病等疾病。鹰嘴豆中富含皂苷类成分，P. A. Ireland等研究表明鹰嘴豆中含有0. 23_6%的总 皂苷。鹰嘴豆中皂苷类主要是三萜类大豆皂苷。皂苷具有多种药理作用，如抗癌、防治心 血管疾病、抗病毒、保肝以及抗血栓等作用，研究发现，B类和DDMP类大豆皂苷具有很强的 α _葡萄糖苷酶抑制作用，且表现为非竞争性抑制作用。鹰嘴豆皂苷被认为与降血脂作用有 关。可能因与食物中的胆固醇结合(Gestener et al. 1972)阻止吸收，也可能与胆汁酸结 合干扰肝肠循环，增加粪排(Sidhu & Oakenful，1986).而且胆汁酸的粪排增加就会引起肝 内补偿性胆汁酸合成，消耗胆固醇，从而降低血浆胆固醇。鹰嘴豆抗癌作用的有效成分可能 是三萜皂苷。因此对鹰嘴豆总皂苷进行纯化研究，使其在保健和医药行业中得到应用。传统的皂苷分离精制方法有分段沉淀法、铅盐沉淀法、胆留醇沉淀法、吉拉尔试剂 法和色谱分离法。分段沉淀法、铅盐沉淀法、胆留醇沉淀法和吉拉尔试剂法纯化皂苷，均需 使用大量的化学试剂，不适用于工业化生产，且皂苷纯度较低。目前常用色谱分离法有吸附 色谱法、分配色谱法、高效液相色谱法、液滴逆流色谱法(DCCC)和大孔树脂法。吸附色谱 法、分配色谱法、高效液相色谱法、液滴逆流色谱法(DCCC)等方法可纯化出纯度很高的皂 苷和单一化合物，但其操作复杂，费用高，也不适用于工业化生产。利用大孔树脂纯化皂苷， 该法具有耗费溶剂量少，回收率较高的特点，且大孔树脂价格便宜，可反复使用，适用于生 产化需求。因此，本研究采用大孔树脂纯化鹰嘴豆提取物，可以提高皂苷活性成分纯度，使 其在保健和医药行业中得到应用。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，该方法是将鹰嘴豆粉 碎，过筛，加溶剂油，加热回流脱脂，加热回流提取，收集提取液，减压回收乙醇，浓缩，再将 浓缩液用大孔树脂进行纯化，真空干燥，即可得到鹰嘴豆总皂苷的质量含量达到22-25%的 纯化产品。通过本发明所述方法获得的鹰嘴豆总皂苷产品经体外降糖实验——对蛋白酪氨 酸磷酸酶IB的抑制作用，结果表明有很好的活性。同时，本发明所述方法重现性好，树脂可 重复使用。本发明所述的一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，按下列步骤进行a、将鹰嘴豆粉碎，过40-50目筛，取粉碎的鹰嘴豆，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热回流脱脂，加热温度40-70°C，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比5-15倍量的30% -80% 乙醇采用电热套加热回流提取1-4次，时间l_3h，收集提取液，减压回收乙醇；b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0.87g生药/mL，再将浓缩液用大孔树脂进行纯 化，上样时间为l_6h，水洗脱体积为1-3BV，水洗流速为l_4BV/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙 醇浓度为50% -80%，乙醇洗脱量为1-4BV，乙醇洗脱速度为l_4BV/h ；C、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度30_45°C，即可得到 鹰嘴豆总皂苷质量含量22-25%产品。步骤b 中的大孔树脂为 HPD100、HPD300、SA-l、SA-3、DM131、D101、XAD-2 或 ADS-7型。本发明所述的一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，该方法经过对不同型号大孔树脂对 纯化物总皂苷含量的影响；大孔树脂不同上样浓度对纯化物总皂苷含量的影响；大孔树脂 柱径高比对纯化物总皂苷含量的影响；大孔树脂不同吸附速度对纯化物总皂苷含量的影 响；大孔树脂解吸剂对纯化物总皂苷含量的影响；80%乙醇的动态解吸；水洗脱用量和吸 附泄露的测试如下八种大孔树脂对鹰嘴豆总皂苷的静态吸附与解析试验取不同型号的抽干树脂各lg，分别装入30mL—定质量浓度的提取液中，恒温震 荡(37°C，250r/min)13. 5h，测上清液的平衡皂苷质量浓度P e (mg/mL)，滤去提取液后树脂 经50mL纯水清洗，再放入50mL80%乙醇中，于相同条件下解吸，测定解析液的皂苷质量浓 度P d(mg/mL)，分别按下式计算吸附量、解析量、解析率，从中筛选出性能最好的树脂进行 后续实验，结果见图1 ；吸附量(mg/g干树脂)=(P0-Pe)X V0/m解析量(mg/g干树脂)=PdX Vd/m解析率=解析量X 100/吸附量其中P ^提取液中皂苷质量浓度(mg/mL)，V0-提取液体积(mL)，Vd-解析液体积 (mL)，m-树脂质量(g)。结果显示(图1)，8种大孔树脂中，吸附量和解析量都较高的是XAD-2，但XAD-2大 孔树脂价格昂贵，不适于生产用，HPDlOO大孔树脂解析量较XAD-2次之，解析率最高，但吸 附量较少，SA-3大孔树脂吸附量较HPDlOO大孔树脂高，但解吸量次之，HPDlOO大孔树脂皂 苷纯度(22% )比SA-3大孔树脂(19% )高，比较后选择HPDlOO型号大孔树脂。上样溶液的浓度筛选试验取20mL树脂，湿法装柱(柱长径比8 1)，将质量浓度为0. 29,0. 58,0. 87、1. 16 和1. 74g生药/mL的提取物溶液以3. OBV/h的流速分别过柱，分别吸附4、6、8、12、24倍柱 体积后，用60mL纯水洗树脂至流出液无色，再用SOmL体积分数70%的乙醇溶液以2BV/h洗 柱，收集解吸液，测定其Pd。结果见图2:如结果显示(图2)，不同浓度，上样量相同的情况下，上样液浓度为0. 87g生药/ mL的解析量最大，浓度继续减小其解析率开始降低，这可能是因为上样液浓度太低，上样体 积加大，吸附时间过长，导致先吸附的皂苷被洗脱下来，所以，选择浓度0. 87g生药/mL为最 佳上样浓度。树脂柱径高比例的考察试验
分别装树脂床径高比为1 2、1 4、1 6、1 8的大孔树脂(柱长径比8 1)， 以3BV/h流速上样(总皂苷浓度为0. 199mg/mL)，吸附后用5BV水快速洗脱，以2BV/h流速 4BV70%乙醇洗脱，收集解吸液，测定其Pd。结果见图3 从图3可以看出，径高比在1 4时解析量最多，径高比从1 6开始解析量开始 下降，这是因为树脂柱过高，随之吸附时间过长，导致先吸附的皂苷被洗脱下来。因此，径高 比选择为1:4。吸附速率的筛选装填树脂床径高比为1 4的大孔树脂，湿法装柱(柱长径比8 1)，以1. OBV/ h、2. 0BV/h、3. OBV/h和4BV/h的流速上样(总皂苷浓度为0. 199mg/mL)，12倍柱体积吸附 后，用5BV纯水洗树脂，再用体积分数70%的乙醇溶液以2BV/h洗柱4BV，收集解吸液，测定 其Pd。结果见图4:结果显示(图4)，吸附速率为lBV/h时，总皂苷解析量最大，2BV/h和3BV/h解析 量无太大差异，当吸附速率为4BV/h，树脂解吸量明显减少，考虑到工作效率，因此，选择吸 附率为3BV/h。解吸剂的筛选试验取20mL大孔树脂，湿法装柱(柱长径比8 1)，将一定浓度的提取物溶液(总皂 苷浓度为0. 199mg/mL)，以3. OBV/h流速过柱，饱和吸附后，用IOOmL纯水洗树脂至流出液无 色，再依次用体积分数20%、40%、60%、80%和100%的乙醇溶液以2BV/h洗柱，收集解吸 液，测定其Pd。结果如图5:从图5结果可以看出，皂苷洗脱主要集中在20% -60%乙醇之间，再分别用20%、 50%、60%、70%、80%乙醇洗脱饱和吸附提取液的大孔树脂，测各洗脱液中皂苷纯度，80% 洗脱液中皂苷纯度最高，因此，洗脱剂选择80%乙醇。 解吸剂用量体积的筛选试验以一定质量浓度的提取液上样，30mL树脂柱达饱和吸附后，以体积分数80%的乙 醇溶液洗脱，每IOmL解析液收集一次，3倍体积后每30mL收集一次，其动态解吸曲线见图 6 结果显示，体积分数80%的乙醇溶液洗脱液中皂苷纯度最高，且洗脱峰窄且集中， 无拖尾，被解吸的皂苷主要集中于0. 7-1. 8BV段，解吸剂用量为3BV时，皂苷的洗脱率达到 平衡，故此解吸剂具有洗脱效率高、用量少和安全性高的特点其作为适宜的解吸剂。水洗脱用量体积的考察试验将吸附饱和的树脂用纯净水快速洗脱树脂，洗去树脂间未吸附的提取液和蛋白、 糖等杂质，测定皂苷含量。结果见图7:从图7可以看出，当水洗至3BV时，将树脂未吸附的提取液都被洗脱下来，而流出 液接近无色，因此，水洗量选择为3BV。提取液上样量考察试验取鹰嘴豆提取液(总皂苷质量浓度为0. 53mg/mL,即0. 87g生药/mL)，上 30mLHPD100大孔树脂上，以3BV/h流速进行吸附后，收集流出液，测定中皂苷含量，结果见 图8 从图8泄露曲线来看，上样量从14BV开始，泄露趋于稳定，即9-16BV之间达到一个动态平衡，从17BV开始，泄露曲线由直线上升，因此，确定上样量为16BV时，树脂柱达到 吸附饱和。本发明所述的一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，鹰嘴豆脱脂用的6#溶剂油，是目前 市场上生产食用油所用的萃取溶剂，提取物使用食用乙醇提取，无毒，真空干燥，对活性成 分损害小。本发明得到的总皂苷产品经体外降糖实验——对蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制 作用，结果表明有很好的活性。本发明所述的一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，具有以下优点所述方法中以乙醇 为溶剂和洗脱剂，价廉、无毒；脱脂采用的溶剂为目前市场上生产食用油用的萃取剂6#溶 剂油，安全、价廉；采用的大孔树脂价格较低，且安全性较高，是目前国内药品行业常用的大 孔树脂。通过本发明所述方法获得的鹰嘴豆总皂苷的质量含量可达22-25%。
图1为本发明不同型号大孔树脂对纯化物总皂苷含量的影响，其中□为吸附率， 園为解析率。图2为本发明大孔树脂不同上样浓度对纯化物总皂苷含量的影响图。图3为本发明大孔树脂柱径高比对纯化物总皂苷含量的影响图。图4为本发明大孔树脂不同吸附速度对纯化物总皂苷含量的影响图。图5为本发明大孔树脂解吸剂对纯化物总皂苷含量的影响图。图6为本发明80%乙醇的动态解吸曲线图。图7为本发明水洗脱用量图。图8为本发明吸附泄露曲线图。
具体实施例方式本发明将结合具体实施例作进一步说明，但不限于本实施例范围。实施例1a、将鹰嘴豆粉碎，过40目筛，取500g鹰嘴豆粉，加6#溶剂油，采用水浴锅加热回 流脱脂，加热温度40°C，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比5倍量的30%乙醇采用电热套加 热回流提取1次，时间lh，收集提取液，减压回收乙醇；b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0. 87g生药/mL，再将浓缩液用HPD100大孔树 脂进行纯化，装填树脂床径高比为1 4，上样时间为lh，控制流出液流速为3BV/h，静置 2h，让其充分吸收，用IBV纯净水洗树脂床，水洗流速为lBV/h，除去未被树脂吸附部分和杂 质，用3BV的浓度80%乙醇洗脱，流速为lBV/h ；C、收集乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，真空度20Pa，加热温度为30°C，即得干 燥的鹰嘴豆纯化产物209. 4mg,总皂苷质量含量为22%。实施例2a、将鹰嘴豆粉碎，过50目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热 回流脱脂，加热温度55°C，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比10倍量的50%乙醇采用电热 套加热回流提取3次，时间2-3h，收集提取液，减压回收乙醇；b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0. 87g生药/mL，再将浓缩液用HPD300大孔树脂进行纯化，装填树脂床径高比为1 4，上样时间为3h，控制流出液流速为lBV/h，静置 2h，让其充分吸收，用3BV纯净水洗树脂床，水洗流速为3BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂 质，用IBV的浓度50%乙醇洗脱，流速为3BV/h ；C、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度40°C，即可得到干 燥的鹰嘴豆纯化产物209. 4mg,总皂苷质量含量23%。实施例3a、将鹰嘴豆粉碎，过40目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热 回流脱脂，加热温度70°C，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比15倍量的80%乙醇采用电热 套加热回流提取4次，时间3h，提取温度95°C，收集提取液，减压回收乙醇；b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0. 87g生药/mL，再将浓缩液用SA_3大孔树脂 进行纯化，装填树脂床径高比为1 4，上样时间为6h，控制流出液流速为4BV/h，静置2h， 让其充分吸收，用3BV纯净水洗树脂床，水洗流速为4BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质， 用4BV的浓度80%乙醇洗脱，流速为4BV/h ；C、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度45°C，即可得到干 燥的鹰嘴豆纯化产物209. 4mg,总皂苷质量含量25%产品。实施例4a、将鹰嘴豆粉碎，过50目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热 回流脱脂，加热温度50°C，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比8倍量的40%乙醇采用电热套 加热回流提取2次，时间lh，收集提取液，减压回收乙醇；b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0. 87g生药/mL，再将浓缩液用SA-I大孔树脂 进行纯化，装填树脂床径高比为1 4，上样时间为2h，控制流出液流速为lBV/h，静置2h， 让其充分吸收，用3BV纯净水洗树脂床，水洗流速为3BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质， 用4BV的浓度40%乙醇洗脱，流速为2BV/h ；C、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度32°C，即可得到干 燥的鹰嘴豆纯化产物209. 4mg,总皂苷质量含量23%产品。实施例5a、将鹰嘴豆粉碎，过40目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热 回流脱脂，加热温度60°C，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比12倍量的50 %乙醇采用电热 套加热回流提取3次，时间2h，收集提取液，减压回收乙醇；b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0. 87g生药/mL，再将浓缩液用DM131大孔树脂 进行纯化，装填树脂床径高比为1 4，上样时间为5h，控制流出液流速为2BV/h，静置2h， 让其充分吸收，用IBV纯净水洗树脂床，水洗流速为2BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质， 用2BV的浓度60%乙醇洗脱，流速为2BV/h ；C、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度30°C，即可得到干 燥的鹰嘴豆纯化产物209. 4mg,总皂苷质量含量24%产品。实施例6a、将鹰嘴豆粉碎，过50目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热 回流脱脂，加热温度55°C，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比14倍量的65%乙醇采用电热 套加热回流提取4次，时间2h，收集提取液，减压回收乙醇；
b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0. 87g生药/mL，再将浓缩液用DlOl大孔树脂 进行纯化，装填树脂床径高比为1 4，上样时间为4h，控制流出液流速为3BV/h，静置2h， 让其充分吸收，用IBV纯净水洗树脂床，水洗流速为lBV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质， 用2BV的浓度70%乙醇洗脱，流速为4BV/h ；C、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度38°C，即可得到干 燥的鹰嘴豆纯化产物209. 4mg,总皂苷质量含量25%产品。实施例7a、将鹰嘴豆粉碎，过40目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热 回流脱脂，加热温度65°C，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比6倍量的70%乙醇采用电热套 加热回流提取1次，时间3h，收集提取液，减压回收乙醇；b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0. 87g生药/mL，再将浓缩液用XAD-2大孔树脂 进行纯化，装填树脂床径高比为1 4，上样时间为5h，控制流出液流速为2BV/h，静置2h， 让其充分吸收，用2BV纯净水洗树脂床，水洗流速为2BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质， 用3BV的浓度75%乙醇洗脱，流速为3BV/h ；C、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度40°C，即可得到干 燥的鹰嘴豆纯化产物209. 4mg,总皂苷质量含量25%产品。实施例8a、将鹰嘴豆粉碎，过40目筛，取500g鹰嘴豆粉，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热 回流脱脂，加热温度45°C，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比9倍量的75%乙醇采用电热套 加热回流提取3次，时间3h，收集提取液，减压回收乙醇； b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0. 87g生药/mL，再将浓缩液用ADS-7大孔树脂 进行纯化，装填树脂床径高比为1 4，上样时间为6h，控制流出液流速为lBV/h，静置2h， 让其充分吸收，用4BV纯净水洗树脂床，水洗流速为3BV/h，除去未被树脂吸附部分和杂质， 用4BV的浓度80%乙醇洗脱，流速为3BV/h ；C、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度42°C，即可得到干 燥的鹰嘴豆纯化产物209. 4mg,总皂苷质量含量24%产品。实施例9鹰嘴豆总皂苷提取物降糖体外筛选一蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)抑制实验纯化的总皂苷提取物溶于DMS0，初始浓度为IOOmMX L—1，DMSO稀释，分别配成浓度 为 10，1,0. 1,0. OlmmXL-1 的样品溶液，阳性对照药=NaVO3, IC50 :4μ gXmlA蛋白酪氨酸磷酸酶IB活性测定采用微量法。测试反应体系样品溶液1 μ L，再加 入179yL含(XOgymolXL-1蛋白酪氨酸磷酸酶IB的缓冲液OOmmolXL—1 4-羟乙基哌嗪 乙磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N，-2-乙烷磺酸，lSikimolXI^NaCl，和lmmol X Γ1乙二胺四 乙酸，PH = 7. 0)，室温孵育lOmin，然后加入20 μ L 35mmol X L—1对硝基苯磷酸二钠盐，总体 积为200 μ L，室温孵育30min后，用10 μ L 3mol X L—1的NaOH溶液终止反应，在405nm处测 定吸收值，以不含酶的溶液体系为空白。按上述活性测试方法，化合物样品按不同剂量加入，405nm处测定吸收值，每个实 验重复3次，抑制率=(0D405空白-0D405样品)/0D405空白X 100%。表3鹰嘴豆提取物和纯化物对蛋白酪氨酸磷酸酶IB抑制活性筛选
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权利要求
一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，其特征在于按下列步骤进行a、将鹰嘴豆粉碎，过40 50目筛，取粉碎的鹰嘴豆，加入6#溶剂油，采用水浴锅加热回流脱脂，加热温度40 70℃，脱脂后的鹰嘴豆粉，用质量体积比5 15倍量的30％ 80％乙醇采用电热套加热回流提取1 4次，时间1 3h，收集提取液，减压回收乙醇；b、将步骤a提取液浓缩至质量浓度0.87g生药/mL，再将浓缩液用大孔树脂进行纯化，上样时间为1 6h，水洗脱体积为1 3BV，水洗流速为1 4BV/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为50％ 80％，乙醇洗脱量为1 4BV，乙醇洗脱速度为1 4BV/h；c、收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，真空度20Pa，加热温度30 45℃，即可得到鹰嘴豆总皂苷质量含量22 25％产品。
2.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于步骤b中的大孔树脂为HPD100、 HPD300、SA-l、SA-3、DM131、D101、XAD-2 或 ADS-7 型。
全文摘要
本发明涉及一种鹰嘴豆总皂苷的制备方法，该方法是将鹰嘴豆粉碎，过筛，加溶剂油，加热回流脱脂，加热回流提取，收集提取液，减压回收乙醇，浓缩，再将浓缩液用大孔树脂进行纯化，真空干燥，即可得到鹰嘴豆总皂苷的质量含量达到22-25％的纯化产品。通过本发明所述方法获得的鹰嘴豆总皂苷产品经体外降糖实验——对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制作用，结果表明有很好的活性。同时，本发明所述方法重现性好，树脂可重复使用。
文档编号A61P3/10GK101991635SQ20101052306
公开日2011年3月30日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者吕俏莹, 程珍, 窦君, 阿吉艾克拜尔·艾萨, 阿布力米提·伊力 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所