专利名称：一种测定中药抗氧化活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种以伏安法测定中药抗氧化活性的方法。
背景技术：
(1)常用的抗氧化模型根据作用机理，天然抗氧化剂一般可分为四类1)氧自由基清除剂直接清除氧自由基；2)酶抑制剂抑制参与氧自由基产生的酶的活性；3)金属离子螯合剂络合在氧自由基产生过程中起重要作用的过渡金属；4)其他。目前，评价中药抗氧化活性的方法有很多，主要有自由基清除法，如l，l-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)法、Oxygen radical absorbance capacity (ORAC)法、超氧阴离子清除法、羟基自由基清除法和脂质自由基清除法等。由于诱导剂的不同，自由基的产生机理不同，抗氧化试验结果极易受实验条件的影响，尤其是那些以生物实验为基础的方法，由于操作烦琐，加上生物实验不确定因素相对增加，使得实验结果往往对实验条件有很强的依赖性。中药中不乏优良的抗氧化剂，但其化学成分的复杂性使得很难用现有方法对其抗氧化活性进行评价。(2)伏安法评价中药抗氧化活性的理论基础及实验数据氧自由基清除剂的抗氧化作用多是通过电子转移清除氧自由基，给电子的能力越强，其抗氧化活性应越强，氧化电位是物质给电子能力的指标，也应是其清除氧自由基能力的指标。已有文献报道，黄酮类化合物及酚酸类化合物的电位与其抗氧化活性密切相关。 如van Acker等以循环伏安法测定了黄酮化合物在2. 5%二甲基亚砜缓冲溶液中的氧化电位，同时以鼠肝及脑微粒体脂质过氧化体系为模型，以dOXOrUbiCin&i^27aSCOrtate为诱发剂，评估了这些黄酮类化合物对脂质过氧化的抑制率，结果表明黄酮类化合物脂质过氧化抑制率与氧化电位之间有较好的定性关系，即氧化电位较低的物质其脂质过氧化抑制率较高(van Acker S. Α. B. Ε. , van den Berg D. -J. , Tromp Μ. N. J. L. , et al. , Free Radic. Biol. Med.，1996，20，331)。其后，他们以 azobisamidinopropane (ABAP)为诱发剂诱发脂质过氧化，结果在黄酮类化合物脂质过氧化抑制率与氧化电位之间也得到了良好的线性关系 (van Acker S. Α. B. Ε.，van Balen G. P.，van den Berg D. -J.，et al. Biochem. Pharmacol.， 1998,56,935).杨滨等采用流动柱电极电解体系对四个常见于中药中的黄酮化合物进行了研究，考察了它们在生理PH值范围内的电极反应类型，测定了氧化电位及电子转移数(Bin Yang，Kensuke Arai, and Fumiyo Kusu. Electrochem.，2001，69，519)，同时建立了以Fe3+/ADP-NADra为诱导剂的鼠肝微粒体脂质过氧化模型，评价了这些黄酮化合物在此模型中的抗氧化活性(Bin Yang，Akira Kotani，Kensuke Arai，and Fumiyo Kusu Chem. Pharm. Bull. ,2001,49, 747, Bin Yang，Kensuke Arai, and Fumiyo Kusu. Anal. Sci. , 2001, 17，599)，结果表明，黄酮类化合物脂质过氧化抑制率与氧化电位之间有良好的线性关系。 Peyrat-Maillard等采用HPLC-库仑阵列检测技术，对酚酸类化合物的电位值进行了测定， 同时考察了它们抑制甲基亚油酸酯在无水十二烷中的加速自氧化能力及消除DPPH自由基的能力，结果表明电位与清除自由基之间有良好的线性关系(M. N. Peyrat-Maillard, etal.，Talanta，2000，51，709)。
发明内容
不同于单体化合物，中药是由无数个单体化合物组成的，正是由于中药成分复杂， 目前未见将伏安法直接用于中药抗氧化活性的研究。本发明经过大量研究表明，氧化电位值反映了所测中药中化合物给电子的能力，氧化电流值则代表能给出电子的化合物的量， 因此，采用伏安法测定中药的氧化电位和电流值，将两者结合起来测定中药的抗氧化活性。 下面进一步详述本发明。(1)以伏安法对十种中药的抗氧化活性进行预测，并与它们清除DPPH自由基的活性进行对比。十种实验中药为槐米、贯叶金丝桃、金荞麦、山楂、山楂叶、黄芩、木蝴蝶、金银花、 红花和茶叶，分别以4-16倍量70%乙醇回流提取^1X 2，滤液减压回收，残渣蒸干，得提取物。其中，槐米和红花分别由两种和三种不同的提取方法提取。具体步骤为槐米加入5倍量的70%乙醇回流提取lhX4，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，残渣蒸干，得槐米乙醇回流提取物；槐米加入4倍量70%乙醇冷浸24hX5，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，残渣蒸干， 得槐米乙醇冷浸提取物。红花加入15倍量蒸馏水，超声提取lh，滤过，滤液浓缩，加入AB-8 大孔树脂柱中，用10%乙醇洗脱后，收集50 %乙醇洗脱液，蒸至尽可能干，再冷冻干燥证， 得红花大孔树脂纯化物；红花加入8倍量的乙醇，加热回流lh，滤过，减压回收乙醇，残渣蒸干，得红花乙醇提物；红花加入12倍量的蒸馏水，加热回流lh，滤过，滤液蒸干，得红花水提物。采用伏安法对上述十种中药在生理pH值范围内的氧化电位和氧化电流值进行测定，同时参考文献方法(Brand Williams W, Cuvelier M Ε, Berset C. Lebensm Wiss U Technol, 1995，28，25)，对上述中药的DPPH自由基清除率进行了评估(每个样品配制7_10 个浓度)，结果见表1，以matlab数据处理软件处理上述数据，结果表明，氧化电位、氧化电流与DPPH清除率之间有良好的相关性，见附
图1，Z = 0. 349/X+O. 579Y-0. 106，r2 = 0. 9243， 其中Z为十种中药清除DPPH自由基的IC5tl值，X为氧化电流值，Y为氧化电位值，氧化电流值越高，电位值越低，IC50值越小，清除DPPH自由基能力越强。以Trolox为阳性对照，同时参照文献数据，抗坏血酸清除DPPH自由基的IC5tl 值为 0.132mg · mL_1(Avijeet Jain, Manish Soni, Lokesh Deb, et al. Journal of Ethnopharmacology，2008，115，61)，本实验样品均有较好的抗氧化活性，由此推知当样品的氧化电位值低于0. 232V，氧化电流值大于0. ZSZyAAigmL-1时，它们的抗氧化活性较强。(2)以伏安法对九种中药的抗氧化活性进行预测，并与它们在Oxygen radical absorbance capacity(ORAC)模型中的抗氧化活性进行对比。九种实验中药为除山楂外的上述十种中药，采用伏安法对这九种中药在生理pH 值范围内的氧化电位和氧化电流值进行测定，同时测定它们在ORAC模型中的抗氧化活性， 方法同文献(续洁琨，姚新生，栗原博.中国药理学通报，2006，22 (8) 1015 ；H. Kurihara, H. Fukami, S. Asami, et al. Biol. Pharm. Bull. 2004，27 (7)，1093-1098)，以 ORAC值(样品相当于Trolox的量)为指标，结果见表2。以matlab数据处理软件处理数据，结果表明，氧化电位、氧化电流与AAPH自由基清除率之间有良好的相关性，见附图2，Z = 0. 299X+0. 195/
6γ-ο. 002/Y2-0. 08，r2 = 0. 830，其中Z为9种中药提取物的ORAC值，X为氧化电流值I，Y为氧化电位值仏/2 ；氧化电流值越高，电位值越低，ORAC值越大，清除AAPH自由基能力越强。以Trolox为阳性对照，可以看出，本实验样品均有较好的抗氧化活性，由此推知当样品的氧化电位值低于0. 232V，氧化电流值大于0. 282 μ A/mg · mL—1时，它们的抗氧化活性较强。表1 10种中药提取物氧化电流值、氧化电位值及DPPH清除率(n = 7-10)
_样品的名称 E1/2/VIC^
/μΑ/mg-mL"1/mg-mL"1
....................Trolox66^98 …— 0.120 ....................θ7θΓ ———
茶叶 7.80.0690.012
贯叶金丝桃6.3580.0820.028
黄芩2.3440.0190.049
木蝴蝶6.2980.0120.052
槐米(回流)2.2080.0820.079槐米(冷浸)2.1900.0820.051
金荞麦2.9340.1330.054
金银花4.5980.2100.066
山楂叶1.4080.1890.11
山楂1.7540.1330.33
红花(过树脂)0.5140.1280.45
红花(水提物)1.4180.2320.46
红花(醇提物)0.2820.1511.30
I表2 9种中药提取物氧化电流值、氧化电位值及AAPH清除率(n = 7)
权利要求
1.一种测定中药抗氧化活性的方法，其特征在于测定步骤为以适宜溶剂对中药进行提取，收集滤液，浓缩，干燥，得到提取物，以伏安法测定中药提取物的氧化电位和氧化电流值，其中提取物不是单体化合物。
2.如权利要求1所述的测定中药抗氧化活性的方法，其特征在于测定步骤为取 2-25kg中药，粉碎，加入4-6倍量的有机溶剂提取2-10次，每次提取2_10小时，收集滤液， 滤液减压浓缩，干燥，即得中药提取物，然后，取中药提取物20-50mg，以有机溶剂溶解，置 10-25ml容量瓶中定容，采用伏安法测定中药提取物的氧化电位和氧化电流值。
3.如权利要求2所述的测定中药抗氧化活性的方法，其特征在于有机溶剂为乙醇或甲醇。
4.如权利要求2所述的测定中药抗氧化活性的方法，其特征在于提取中药的方法选自冷浸，渗漉，加热回流中的任意一种。
5.如权利要求2所述的测定中药抗氧化活性的方法，其特征在于中药选自槐米、贯叶金丝桃、黄芩、木蝴蝶、金荞麦、山楂叶、山楂、金银花、红花、茶叶中的任意一种。
6.一种测定槐米抗氧化活性的方法，其特征在于测定步骤如下(1)槐米提取物的制备，取2. Okg槐米加入4倍量70 %乙醇冷浸Mh，重复冷浸5次，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，残渣蒸干，得提取物0. 85kg，得率为42%。(2)配制pH为7. 0的0. IM的磷酸盐缓冲溶液为底液。取槐米提取物2%ig，精密称定，以70%乙醇溶解，定容置IOmL量瓶中，制备成样品溶液，测定前，用Al2O3打磨工作电极，高纯水超声清洗3次，每次lmin，测定时，先将底液与空自样品液以体积比为1 1混合，进行空白测定，随后，将样品溶液与底液以体积比为1 1混合，进行线性扫描，起始电位-1.0V，终止电位1.0V，扫描速率0.05V/S，记录伏安图，测得第一氧化电位的半峰电位值为0. 082V，单位浓度的电流值为2. 190 μ A/mg · mL—1。
7.一种测定贯叶金丝桃抗氧化活性的方法，其特征在于测定步骤如下(1)贯叶金丝桃提取物的制备，5. Okg贯叶金丝桃加入15倍量的70%乙醇冷浸池，加热回流提取2h，滤过，残渣加原药材15倍量的70%乙醇回流提取2次，每次1小时，滤过，合并滤液，减压回收浓缩，残渣蒸干，得提取物。(2)配制pH为7. 0的0. IM的磷酸盐缓冲溶液为底液。取贯叶金丝桃提取物7mg，精密称定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中，制备成样品溶液。测定前，用 Al2O3打磨工作电极，高纯水超声清洗3次，每次lmin，测定时，先将底液与空白样品液以体积比为1 1混合，进行空白测定，随后，将样品溶液与底液以体积比为1 1混合，进行线性扫描，起始电位-1. 0V，终止电位1. 0V，扫描速率0. 05V/s，记录伏安图，测得第一氧化电位的半峰电位值为0. 082V,单位浓度的电流值为6. 358 μ A/mg · mL—1。
8.一种测定黄芩抗氧化活性的方法，其特征在于测定步骤为(1)黄芩样品的制备，取 20kg黄芩，以6倍量70%乙醇回流提取2次，每次池，滤过，合并滤液，减压回收，真空干燥， 得提取物。(2)配制pH为7. 0的0. IM的磷酸盐缓冲溶液为底液。取黄芩提取物10mg，精密称定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中，制备成样品溶液。测定前，用Al2O3打磨工作电极，高纯水超声清洗3次，每次lmin，测定时，先将底液与空白样品液以体积比为1 1混合，进行空白测定，随后，将样品溶液与底液以体积比1 1混合，进行线性扫描，起始电位-ι.ον，终止电位1. 0V，扫描速率0. 05V/s，记录伏安图，测得第一氧化电位的半峰电位值为0. 019V, 单位浓度的电流值为2. 344 μ A/mg · mL—1。
9.一种测定木蝴蝶抗氧化活性的方法，其特征在于测定步骤为(1)木蝴蝶样品的制备，25kg木蝴蝶加入16倍量70%乙醇冷浸12h，再回流提取2h，滤过，残渣加入10倍量70% 乙醇回流提取池，合并滤液，减压回收乙醇，真空干燥，得提取物。(2)配制pH为7.0的0. IM 的磷酸盐缓冲溶液为底液。取木蝴蝶提取物10mg，精密称定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中， 制备成样品溶液。测定前，用Al2O3打磨工作电极，高纯水超声清洗3次，每次lmin，测定时， 先将底液与空白样品液以体积比为1 1混合，进行空白测定，随后，将样品溶液与底液以体积比为1 1混合，进行线性扫描，起始电位-1.0V，终止电位1.0V，扫描速率0.05V/S， 记录伏安图，测得第一氧化电位的半峰电位值为0.012V，单位浓度的电流值为6. 298 μ A/ mg · mL 1 ο
10.一种测定金荞麦抗氧化活性的方法，其特征在于测定步骤为(1)金荞麦样品的制备，取5. Okg金荞麦加入4倍量的70%乙醇冷浸1. 5h，回流提取池，滤过，滤渣加入原药材的2倍量的70%乙醇回流提取6次，每次1小时，合并滤液，减压回收乙醇，滤液蒸干，得提取物。(2)配制pH为7.0的0. IM的磷酸盐缓冲溶液为底液。取金荞麦提取物15mg，精密称定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中，制备成样品溶液。测定前，用Al2O3打磨工作电极，高纯水超声清洗3次，每次lmin，测定时，先将底液与空白样品液以体积比为1 1混合，进行空白测定，随后，将样品溶液与底液以体积比为1 1混合，进行线性扫描，起始电位-ι.ον，终止电位1.(^，扫描速率0. 05V/s，记录伏安图，测得第一氧化电位的半峰电位值为0. 133V, 单位浓度的电流值为2. 934 μ A/mg · mL—1。
11.一种测定金银花抗氧化活性的方法，其特征在于测定步骤为(1)金银花样品的制备，取2. Okg金银花，以4倍量70%乙醇回流，提取两次，每次提取池，滤液减压回收，残渣蒸干，得提取物。(2)配制pH为7.0的0. IM的磷酸盐缓冲溶液为底液。取金银花提取物 15mg，精密称定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中，制备成样品溶液。测定前，用Al2O3打磨工作电极，高纯水超声清洗3次，每次lmin，测定时，先将底液与空白样品液以体积比为1 1 混合，进行空白测定，随后，将样品溶液与底液以体积比为1 1混合，进行线性扫描，起始电位-1. 0V，终止电位1. 0V，扫描速率0. 05V/s，记录伏安图，测得第一氧化电位的半峰电位值为0. 210V,单位浓度的电流值为4. 598 μ A/mg · mL—1。
12.一种测定山楂叶抗氧化活性的方法，其特征在于测定步骤为(1)山楂叶样品的制备，2. Okg山楂叶，以4倍量70%乙醇回流，提取两次，每次提取2h，滤液减压回收，残渣蒸干，得提取物。(2)配制pH为7. 0的0. IM的磷酸盐缓冲溶液为底液。取山楂叶提取物 37mg，精密称定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中，制备成样品溶液。测定前，用Al2O3打磨工作电极，高纯水超声清洗3次，每次lmin，测定时，先将底液与空白样品液体积比为1 1混合，进行空白测定，随后，将样品溶液与底液以体积比为1 1混合，进行线性扫描，起始电位-1. 0V，终止电位1. 0V，扫描速率0. 05V/s，记录伏安图，测得第一氧化电位的半峰电位值为0. 189V，单位浓度的电流值为1. 408 μ A/mg · mL—1。
13.一种测定山楂抗氧化活性的方法，其特征在于测定步骤为(1)山楂样品的制备， 5. Okg山楂去核后，置于渗漉桶中，加入2倍量的70 %乙醇冷浸Mh，滤过，残渣再加原药材1.6倍量的70%乙醇冷浸24hX2，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，残渣蒸干，得提取物 0. Ag，得率为14%。(2)配制pH为7.0的0. IM的磷酸盐缓冲溶液为底液。取山楂提取物35. 6mg，精密称定，以70% KOH定容于IOmL量瓶中，制备成样品溶液。测定前，用Al2O3 打磨工作电极，高纯水超声清洗3次，每次lmin，测定时，先将底液与空白样品液体积比为·1 1混合，进行空白测定，随后，将样品溶液与底液以体积比为1 1混合，进行线性扫描， 起始电位-1. 0V，终止电位1. 0V，扫描速率0. 05V/S，记录伏安图，测得第一氧化电位的半峰电位值为0. 133V，单位浓度的电流值为1. 754 μ A/mg · mL—1。
14.一种测定红花抗氧化活性的方法，其特征在于测定步骤为(1)红花样品的制备 2. Okg红花，以4倍量70%乙醇回流，提取两次，每次提取池，滤液减压回收，残渣蒸干，得提取物。(2)配制pH为7. 0的0. IM的磷酸盐缓冲溶液为底液。取红花提取物81mg，精密称定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中，制备成样品溶液。测定前，用Al2O3打磨工作电极，高纯水超声清洗3次，每次lmin，测定时，先将底液与空白样品液以体积比为1 1混合，进行空白测定，随后，将样品溶液与底液以体积比为1 1混合，进行线性扫描，起始电位-ι.ον，终止电位1.(^，扫描速率0. 05V/s，记录伏安图，测得第一氧化电位的半峰电位值为0. 151V, 单位浓度的电流值为0. 282 μ A/mg · mL—1。
15.一种测定茶叶抗氧化活性的方法，其特征在于测定步骤如下(1)称取茶叶2. Ag 于渗漉桶中，加入4倍量的70%乙醇冷浸Mh，滤过，残渣再加茶叶3. 5倍量的70%乙醇冷浸Mh，滤过，残渣再加茶叶3. 5倍量的乙醇冷浸Mh，滤过，共冷浸3天，合并滤液减压回收乙醇，残渣蒸干，得提取物1.26kg，得率为46.7%。( 配制0. IM的磷酸盐缓冲溶液为底液，其pH为7. 0。取茶叶提取物10mg，精密称定，以70%乙醇溶解，定容置IOmL量瓶中，制备成样品溶液。测定前，用Al2O3打磨工作电极，高纯水超声清洗3次，每次lmin，测定时， 先将底液与空白样品液以体积比为1 1进行空白测定，随后，将样品溶液与底液以体积比为1 1混合，进行线性扫描，起始电位-1.0V，终止电位1.0V，扫描速率0.05V/S，记录伏安图，测得第一氧化电位的半峰电位值为0. 069V，单位浓度的电流值为7. 8 μ A/mg · mL—1。
全文摘要
本发明涉及一种采用电化学中的伏安技术，以氧化电位和电流值为指标，对中药抗氧化活性进行评价的方法。目前，有许多评价中药抗氧化活性的方法，但中药化学成分的复杂性使得实验结果往往对实验条件有很强的依赖性，阻碍了人们对其抗氧化活性的正确评价。本发明是将电化学中的伏安技术应用于中药的抗氧化活性评价，其理论基础是氧自由基清除剂的抗氧化作用多是通过电子转移清除氧自由基，其给电子的能力应与抗氧化活性密切相关，即氧化电位和电流值是其最基本的抗氧化活性指标，氧化电位代表物质给电子的难易程度，氧化电流值则代表物质反应的量。本发明以伏安法测定中药的氧化电位和电流值，以此来对中药的抗氧化活性进行评价。
文档编号A61K36/539GK102455316SQ201010522810
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者戴卉卿, 晏仁义, 李洪梅, 杨滨, 袁亚男, 陈承瑜 申请人:中国中医科学院中药研究所