专利名称：一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，具体涉及鹰嘴豆豆芽总皂苷、 总异黄酮的纯化方法。
背景技术：
鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)起源于西亚、地中海沿岸，现全球播种面积已有1. 5 亿亩，是目前世界上第二大食用豆类作物，维吾尔族名为诺胡提，在新疆有2500年的生长 历史，是维吾尔医常用药材，已收载在中华人民共和国卫生部《药品标准》维吾尔药分册和 《维吾尔药志》，具有清除异常体液，开通体液闭阻，调节机体等作用。用于身体瘦弱，性欲低 下，食欲不振，皮肤瘙痒及糖尿病等疾病。鹰嘴豆豆芽中富含皂苷类成分，主要是三萜类大豆皂苷。我们测定鹰嘴豆豆芽中 含有5%左右的皂苷。皂苷具有多种药理作用，如抗癌、防治心血管疾病、抗病毒、保肝以及 抗血栓等作用，研究发现，B类和DDMP类大豆皂苷具有很强的α _葡萄糖苷酶抑制作用，且 表现为非竞争性抑制作用。鹰嘴豆皂苷被认为与降血脂作用有关。可能因与食物中的胆固 醇结合(Gestener et al. 1972)阻止吸收，也可能与胆汁酸结合干扰肝肠循环，增加粪排 (Sidhu & Oakenful，1986)。而且胆汁酸的粪排增加就会引起肝内补偿性胆汁酸合成，消耗 胆固醇，从而降低血浆胆固醇。鹰嘴豆抗癌作用的有效成分可能是三萜皂苷。鹰嘴豆豆芽中富含异黄酮，是原豆中的300倍左右。异黄酮由于结构上类似于β 雌二醇，因此近年来，异黄酮已广泛用于与年龄和激素有关的疾病的预防和治疗，如糖尿 病、高血压、肿瘤等。因为植物雌激素可通过选择性的激活雌激素受体α和抑制雌激素受 体β，从而提高胰岛素效应组织葡萄糖运载体4的表达和葡萄糖的吸收。因此对鹰嘴豆豆 芽总皂苷、总异黄酮进行纯化研究，使其在保健和医药行业中得到应用。传统的皂苷、异黄酮分离精制方法有化学溶剂沉淀法和柱色谱分离法。化学溶剂 沉淀法需使用大量的化学试剂，不适用于工业化生产，且皂苷、异黄酮纯度较低。目前常用 柱色谱分离法有硅胶柱，葡聚糖凝胶柱，聚酰胺柱和大孔树脂法。硅胶柱、葡聚糖凝胶柱等 方法可纯化出纯度很高的皂苷和异黄酮，但其操作复杂，费用高，也不适用于工业化生产。 利用聚酰胺、大孔树脂纯化皂苷、异黄酮，该法具有耗费溶剂量少，回收率较高的特点，且这 两种吸附材料价格便宜，可反复使用，适用于生产化需求。鉴于鹰嘴豆豆芽提取物水溶性差 的特性，不易于直接采用大孔树脂分离，而采用单一聚酰胺进行精制，纯化物纯度较低，因 此，本研究采用聚酰胺_大孔树脂联用技术纯化鹰嘴豆豆芽提取物，可以提高皂苷、异黄酮 活性成分纯度，使其在保健和医药行业中得到应用。
发明内容
本发明目的在于，提供一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，该方法是由挑选优 质鹰嘴豆，经发芽，采摘豆芽，晾干，粉碎，加入乙醇，加热回流提取，收集提取液，减压回收 乙醇，得提取液，再用聚酰胺_大孔树脂进行纯化，乙醇溶液洗脱，减压浓缩，真干燥，即可得到鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮产品。通过本发明所述方法获得的鹰嘴豆豆芽 有效成分总皂苷、总异黄酮，经体外降糖实验——对蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制作用，结果 表明有很好的活性。采用本发明所述方法获得的鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮质 量含量达到52%，重现性好，树脂可重复使用。本发明所述的一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，按下列步骤进行a、挑选优质、饱满、整齐和光泽度好的鹰嘴豆，浸泡，水温为25_35°C，用水量为鹰 嘴豆重量的2倍，再进行消毒处理，采用全自动发芽机发芽，温度27°C，每4h淋一次水，经 6-7d后发芽，采摘豆芽，晾干；b、将步骤a晾干豆芽粉碎，过80-100目筛，以质量体积比5_15倍量的30%-80% 乙醇，加热回流提取l_3h，提取1-4次，收集提取液，减压回收乙醇；C、将步骤b提取液用聚酰胺吸附，减压浓缩、干燥，大孔树脂进行纯化，树脂径高 比为1 1-8，以1-7倍体积的20%-40%乙醇洗除杂，再以50-80%乙醇洗脱，收集1-7倍 体积洗脱液；d、将步骤c中的洗脱液，减压浓缩后，45 °C真干燥，真空度20Pa，加热温度 30-45°C，即可得到鹰嘴豆豆芽有效成分。步骤a浸泡时加入0. 02-2. 00mg/L的先用5mL乙醇溶解的赤霉素，100_500mg/ L(NH4)2S04和先用5mL乙醇溶解的0. 02-2. 00mg/L2,4- 二氯苯氧乙酸的混合液，再加入选
择的鹰嘴豆。步骤c鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺比为1-10 1，鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂比为 1-7 1。步骤c 大孔树脂为 HPD100、HPD300、HPD450、HPD600、D141、D101、SA-3 或 FL-3 型。所述的方法获得的鹰嘴豆豆芽有效成分为总皂苷、总异黄酮，其质量含量为 52-55% ο本发明提供的鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，该方法具有以下优点通过鹰嘴豆发芽这一简单的生物反应，可显著提高鹰嘴豆降血糖功能因子皂苷和 异黄酮的含量，利于其进一步纯化。以乙醇为溶剂和洗脱剂，价廉、无毒。采用的聚酰胺和FL-3大孔树脂进行纯化，这两种树脂价格较低，且安全性较高， FL-3大孔树脂符合国家关于食品工业用大孔树脂的国家标准，是目前国内药品行业常用的 纯化填料。获得的鹰嘴豆豆芽提取物中的有效成分总皂苷、总异黄酮质量含量52-55%。本发明所述的一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，该方法对不同型号大孔树脂 对纯化物总皂苷、总异黄酮含量的影响；药材与聚酰胺用量分析；药材与大孔树脂用量比 分析；树脂解吸剂对纯化物总皂苷、总异黄酮含量的影响；70%乙醇的动态解吸和色谱柱 径高比分析的测试大孔树脂型号筛选取等量不同型号的大孔树脂，预处理后装柱(5mL注射器)，供试液8等份分别拌入 相同量的聚酰胺粉末，减压干燥后等量水洗脱，将水洗脱后的聚酰胺分别置于大孔树脂上 部，再以70%乙醇洗脱，收集洗脱液5BV，测定洗脱液中总皂苷和总异黄酮含量及固体量，计算纯度和回收率。结果见
图1 利用大孔树脂吸附和分子筛双重作用，经聚酰胺初步精致的供试液进入大孔树脂 柱后将得到进一步分离纯化。由图1可以看出，8种大孔树脂中，FL-3大孔树脂在富集物总 异黄酮和总皂苷纯度及回收率方面效果较好。鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺用量比分析称取等量的已处理好的聚酰胺，分别伴以供试液，使供试液所对应鹰嘴豆豆芽 粉-聚酰胺用量比分别为1 1、3 1、5 1、7 UlO 1，相同量水洗后，以70%乙醇 洗脱，收集7BV洗脱液，测定洗脱液中相应指标，计算其纯度和回收率。结果见图2 由图2可知，随着鹰嘴豆豆芽粉-聚酰胺用量比增大，洗脱液中的总异黄酮和皂苷 增加，而收率明显降低，到鹰嘴豆豆芽粉_聚酰胺比达到10 1时，纯度和收率都最低，这 可能是由于聚酰胺相对供试液用量减少后，对异黄酮和皂苷杂质的吸附和截留同时减少， 是在水洗脱除杂过程中，大量的异黄酮和皂苷流失。鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂用量比分析称取等量的已处理好的FL-3大孔树脂各10g，湿法装柱，分别量取供试液，以鹰嘴 豆豆芽粉-聚酰胺用量比5 1伴以聚酰胺，等量水洗后，以供试液所对应的鹰嘴豆豆芽粉 与大孔树脂用量比分别为1 3、1 1、3 1、5 1、7 1，置于树脂上部，以70%乙醇洗 脱，收集洗脱液7BV，测定洗脱液中相应指标，计算其纯度和回收率。结果见图3 由图3可以看出，随着鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂用量比增加，总异黄酮的收率随 之增高，总皂苷收率在3 1时最高，再增大时开始降低，在3 1时，总异黄酮和总皂苷的 纯度都最高。聚酰胺-大孔树脂联用洗脱剂的选择取上柱供试液750mL，拌入6g干燥的聚酰胺粉末，减压干燥后置于10gFL_3大孔树 脂上，用水、20%、40%、60%、80%乙醇依次以2BV/h流速洗脱，分别收集5BV洗脱液，测定 洗脱物中总皂苷和总异黄酮量。计算收率(％)=[洗脱液中总皂苷(异黄酮量)/上柱前 药液所含总皂苷/(异黄酮量)]X100%。结果见图4:从图4中看出，异黄酮和皂苷主要集中在40%乙醇到80%乙醇洗脱剂之间，进一 步筛选结果表明，异黄酮、皂苷纯度70%> 60%> 80%，选择70%作为其洗脱剂。洗脱剂用量的考察取上柱供试液750mL，拌入6g干燥的聚酰胺粉末，减压干燥后置于10gFL_3大孔树 脂上，2根平行柱，分别用水、40%乙醇依次以2BV/h流速洗脱，分别收集5BV洗脱液，再以 70%乙醇洗脱5BV，收集洗脱液，测定洗脱物中总皂苷和总异黄酮量。测定各洗脱部位蛋白 酪氨酸磷酸酶IB抑制活性，结果见表2 表2聚酰胺-大孔树脂联用富集各部位皂苷和异黄酮纯度及PTPlB抑制活性
权利要求
1.一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，其特征在于按下列步骤进行a、挑选优质、饱满、整齐和光泽度好的鹰嘴豆，浸泡，水温为25-35°C，用水量为鹰嘴豆 重量的2倍，再进行消毒处理，采用全自动发芽机发芽，温度27°C，每4h淋一次水，经6-7d 后发芽，采摘豆芽，晾干；b、将步骤a晾干豆芽粉碎，过80-100目筛，以质量体积比5-15倍量的30%-80%乙醇， 加热回流提取l_3h，提取1-4次，收集提取液，减压回收乙醇；c、将步骤b提取液用聚酰胺吸附，减压浓缩、干燥，大孔树脂进行纯化，树脂径高比为 1 1-8，以1-7倍体积的20% -40%乙醇洗除杂，再以50-80%乙醇洗脱，收集1_7倍体积 洗脱液；d、将步骤c中的洗脱液，减压浓缩后，45°C真干燥，真空度20Pa，加热温度30_45°C，即 可得到鹰嘴豆豆芽有效成分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a浸泡时加入0.02-2. 00mg/L的先用5mL 乙醇溶解的赤霉素，100-500mg/L(NH4)2S04和先用5mL乙醇溶解的0. 02-2. 00mg/L 2,4- 二 氯苯氧乙酸的混合液，再加入选择的鹰嘴豆。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c鹰嘴豆豆芽粉与聚酰胺比为1-10 1， 鹰嘴豆豆芽粉与大孔树脂比为1-7 1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c大孔树脂为HPD100、HPD300、HPD450、 HPD600、D141、D101、SA-3 或 FL-3 型。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于采用该方法获得的鹰嘴豆豆芽有效成分为总 皂苷、总异黄酮，其质量含量为52-55%。
全文摘要
本发明涉及一种鹰嘴豆豆芽有效成分的纯化方法，该方法是挑选优质鹰嘴豆，经发芽，采摘豆芽，晾干，粉碎，加入乙醇，加热回流提取，收集提取液，减压回收乙醇，得提取液，再用聚酰胺-大孔树脂进行纯化，乙醇溶液洗脱，减压浓缩，真干燥，即可得到鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮产品。通过本发明所述方法获得的鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮，经体外降糖实验——对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制作用，结果表明有很好的活性。采用本发明所述方法获得的鹰嘴豆豆芽有效成分总皂苷、总异黄酮质量含量达到52％，重现性好，树脂可重复使用。
文档编号A61K131/00GK102000138SQ20101052306
公开日2011年4月6日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者吕俏莹, 程珍, 窦君, 阿吉艾克拜尔·艾萨, 阿布力米提·伊力, 高彦华 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所