专利名称：溶血栓的寡肽化合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有溶血栓功能的寡肽化合物及其制备方法和应用，属于生物医药领域。
背景技术：
P6A(ARPAK)为纤维蛋白β链降解产物之一，具有溶血栓活性。在Ρ6Α的代谢研究中发现了代谢产物RPAK和PAK。在大鼠动静脉旁路插管溶血栓模型上，RPAK和PAK也具有溶血栓活性，且PAK的溶血栓活性比母体Ρ6Α强。按照一般的认识，多肽在体内都会迅速降解。通过PAK肽的结构修饰延缓体内降解速率和提高溶血栓活性，是寡肽溶血栓药物研究的重要途径。按照一般的认识，含多肽的两亲性分子，例如脂肪醇链修饰的多肽，在适当的条件下通过分子间非共价键相互作用可发生自组装，形成纳米结构。借助纳米结构可改善多肽在体内的输送、延缓多肽在体内的降解速率和提高多肽的体内活性。
发明内容
本发明的目的在于提供具有溶血栓活性的寡肽化合物，并通过动物实验评价这些寡肽化合物的溶血栓活性，证明了本发明的溶血栓寡肽化合物除具有优秀的溶血栓活性外，还具有自主装性能。本发明是通过以下技术方案来实现本发明的本发明的目的之一是提供Pro-Ala-Lys-R-CH2 (CH2) 12CH3，其中R为NH或0 ；提供 Arg-Pro-Ala-Lys-R-CH2 (CH2) 12CH3，其中 R 为 NH 或 0 以及提供 AA-Arg-Pro-Ala-Lys-R-Ql2 ( CH2) 12CH3，其中 AA 为 Ala、Gly 或 Gln，R 为 NH 或 0。本发明还提供了制备以上所述结构化合物的方法，具体包括如下步骤(1)在二环己基碳二亚胺(DCC)存在下Boc-Pro在无水THF中与N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)缩合为Boc-Pro-Osu，在NaHCO3存在下Boc-Pro-OSu与Ala反应生成 Boc-Pro-Ala ；(2)在 DCC 和 HOBt 存在下 Boc-Pro-Ala 在无水 THF 中与 Lys (Z) -OBzl 缩合为 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl ；(3)在 NaOH 存在下，在甲醇中将 Boc-Pro-Ala-Lys (Z)-Cffizl 皂化为 Boc-Pro-Ala-Lys (Z)；(4)在 DCC 和 HOBt 存在下 Boc-Pro-Ala-Lys (Z)在无水 THF 中与 R1CH2 (CH2) 12CH3 缩合为 Boc-Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3，其中队为 NH2 或 0H，& 为 NH 或 0 ；(5)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3脱去保护基生成 Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3 ；(6)在乙醇、Pd/C 和 H2 存在下 Pro-Ala-Lys(Z)-Ii2CH2(CH2)12CH3 脱去保护基得到 Pro-Ala-Lys-R2CH2 (CH2) 12CH3，其中 Ii2 为 NH 或 0。
进一步，将上述步骤(5)获得的Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3进行以下三步反应，可获得 Arg-Pro-Ala-Lys-RCH2 (CH2) 12CH3，其中 R 为 NH 或 0，具体为(1)在 DCC 禾口 HOBt 存在下 Boc-Arg(NO2)在无水 THF 中与 Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3 缩合为 Boc-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3,其中，&为NH或O ；(由于该步骤的结构式中用的是R2,因此，采用了原来的修改，烦请确认)(2)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中 Boc-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-Ii2CH2-(CH2)12CH3 脱去 Boc 生成 Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3 ；(3)在乙醇、Pd/C 和 H2 存在下 Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys(Z)-Ii2CH2(CH2)12CH3 脱去保护基，得到 Arg-Pro-Ala-Lys-R2CH2 (CH2) 12CH3，其中 & 为 NH 或 O。更进一步，将以上获得的Arg(NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3 再进行以下三步反应可获得 AA-Arg-Pro-Ala-Lys-RCH2 (CH2) 12_CH3，其中，AA 为 Ala、Gly 或 Gln 残基，R 为NH或0，具体为(1)在 DCC 和 HOBt 存在下 Boc-ΑΑ 在无水 THF 中与 Arg (NO2)-Pro-Ala-Lys (Z)-R 2CH2 (CH2) 12CH3 缩合为 Boc-AA-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2- (CH2) 12CH3,其中 AA 为 Ala、 Gly或Gln残基；(2)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中 Boc-AA-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12C H3 脱去 Boc 生成 AA-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3 ； (3)在乙醇、Pd/C 和 H2 存在下 AA-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2- (CH2) 12CH3 脱去保护基得到 AA-Arg-Pro-Ala-Lys-Ii2CH2 (CH2) 12CH3，其中 AA 为 Ala、Gly 或 Gln，& 为 NH 或 O0本发明通过动物实验评价了本发明寡肽化合物的溶血栓活性，证明了本发明寡肽化合物除具有优秀的溶血栓活性外，还具有自主装性能。
图1为本发明寡肽化合物的合成路线图；图2为本发明化合物19在水溶液中形成的纳米球的透射电镜照片。在图1 中，i)DCC、HOSu, NaHCO3 和 Ala ；ii)DCC、HOBt, NMM ；iii)氯化氢 / 乙酸乙酯溶液 GN) ；iv)NaOH 水溶液；ν)乙醇、Pd/C(5% )、H2 (0. 02Mba)。
具体实施例方式为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。实施例IBoc-Pro-Ala的制备将1. 075g(5. Ommol) Boc-Pro溶于20mL无水THF，冰浴下向溶液中加入 0. 637g(5mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)，并使完全溶解。冰浴下，把已溶于少量无水THF 的二环己基碳二亚胺(DCC) 1. 236g(6. Ommol)加入反应液中。室温搅拌7h，TLC (氯仿/甲醇，10 1)监测Boc-Pro消失。滤除二环己基脲(D⑶)，滤液减压浓缩除去THF。浓缩物用乙酸乙酯(EA)溶解，依次用饱和NaHCO3水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗，然后将EA层减压浓缩至干，加入适量THF溶解。再加入已溶于少量水的Ala 0. 489g(5. 5mmol)，用NaHCO3固体调pH到8-9，常温反应12h，减压浓缩除去THF，加入5mL水溶解，用饱和KHSO4水溶液调pH
到2，用EA少量多次萃取，合并EA层，用饱和NaCl水溶液洗至中性，无水硫酸钠干燥。过滤，
滤液减压浓缩至干，得1.41g(96% )标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/e) :285[Μ_ΗΓ; 20 z) = -59.93 (c= 1, CH3OH) ο实施例2Boc-Pro-Ala_Lys (Z) -OBzl 的制备将1. 43g (5. Ommo 1) Boc-Pro-Ala溶于20mL无水THF，冰浴下往得到的溶液中加入
0.675g(5mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，并使完全溶解。10分钟后加入1. 071g (6mmol)
二环己基碳二亚胺(DCC)，得到反应液(I)，待用。冰浴下把2.71g(5.0mmOl)LyS(Z)-0Bzl
悬浮于20mL无水DMF中，然后加入ImL N-甲基吗啉(NMM)，调pH 8_9。搅拌35分钟，得
到反应液(II)，待用。冰浴下把反应液(II)加入反应液(I)中，先冰浴下搅拌lh，再室
温搅拌12h，TLC(氯仿/甲醇，10 1)显示Lys(Z)-OBzl消失。滤除二环己基脲(DCU)，
滤液除去DMF。残留物用50mL氯仿溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液洗、饱
和NaCl水溶液洗、5% KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。氯仿层用无水Na2SO4干燥、
过滤、滤液减压浓缩至干，得到3.09g(97% )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS(m/e) 20
639 [Μ+Η]+. [α] ο = -32.69 (c = 1, CH3OH). IR(KBr) :3311，2936，2872，1679，1534，1455， 1379，1248，1166. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ /ppm = 8. 77 (m, 1H)，8· 12 (m, 1H)，7· 88 (m, 1H)， 7. 37 (m, 10H)，5· 22 (m，2Η)，5. 15(m，2H)，4· 60 (q, J = 4. 5Hz, 1Η)，4· 27 (t, J = 6. 5Hz, 1Η)， 3. 49 (m, 1Η)，3. 43 (m, 1Η)，3. 13 (m, 2Η)，1. 90 (m, 2H)，1. 85 (m, 2H)，1. 82 (m, 2H)，1. 70 (m, 1H)，
1.50(m，2H)，1. 48(s，9H)，1. 35 (d, J = 6. 5Hz,3H).实施例!BBoc-Pro-Ala-Lys(Z)的制备将1. 59g (3. Ommol) Boc-Pro-Ala-Lys (Z)-OBzl 溶于 15mL 甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOHON)水溶液调pH12并搅拌池，TLC(二氯/甲醇，15 1)监测 B0c-Pr0-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反应混合物用稀盐酸QN)调pH 7，减压浓缩除甲醇。残留物用稀盐酸ON)调pH 2，用乙酸乙酯萃取3次。合并乙酸乙酯层，用饱和NaCl水溶液洗至中性，无水Na2SO4干燥。过滤，滤液减压浓缩至干，得1.40g(85% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :547[Μ_Η]\实施例4Boc-Pro-Ala_Lys (Z) -NHCH2 (CH2) 12CH3 (1)的制备按照实施例2 的制备方法由 2. 74g(5mmol) Boc-Pro-Ala-Lys (Z)和 0. 925g(5mmol) CH3(CH2)12CH2NH2 得 3. 20g(90 % )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS(m/e) 743[Μ+Η]+· [a]P =-10.30 (c = 1, CH3OH). Mp :105. 3-105. 7°C · IR(KBr) =3277,2926,2852, 1689，1635，1541，1452，1393，1367，1257，1163，1118，736，721，698. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ /ppm = 7. 35(m，5H)，6· 33(d, J = 6. 6Hz, 1Η)，5· 2(t，J = 12. ΟΗζ，2Η)，4· 3 (t，J = 4. 2Hz, 2Η)，4· 19(t, J = 6. ΟΗζ, 1Η)，3· 4 (m，2Η)，3· 2 (m，4Η)，1. 7(m, 10Η)，1-2 (m，36H)，0· 89 (t, J = 6. 9Hz,3H).实施例5Pro-Ala-Lys (Z) -NHCH2 (CH2) 12CH3 的制备将0. 74如(1· Ommol) Boc-Pro-Ala-Lys (Z)-NHCH2 (CH2)12CH3 溶解在 10mL4M 氯化氢-乙酸乙酯溶液中，冰浴搅拌2小时，TLC(二氯/甲醇，15/1)监测原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气体，最后得0.568g(91% )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS(m/e) :643[M+H]+.实施例6Pro-Ala-Lys-NHCH2 (CH2) 12CH3 (3)的制备将0. 633g(Immol)Pro-Ala-Lys (Z)-NHCH2 (CH2)12CH3 置于 50ml 茄形瓶中， 用甲醇溶解，加49mg Pd/C (5 % )，通H2 (0. 02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除 Pd/C、滤液减压浓缩至干得0. 38g (80 % )标题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/e)
509[Μ+Η]+· [a]/) = -61.06 (c = 1, CH3OH). Mp :118. 4-119. 0°C · IR(KBr) 3053，2951，2852， 1739,1653,1531,1388,1242,1201,719. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ/ppm = 8. 15(d, J = 8. 0Ηζ，3Η)，4· 29 (m，2H)，3· 10(m，3H)，2. 73(m，4H)，2· 30(s，3H)，1. 78 (m，6H)，1. 55(m，4H)，
1.37 (t, J = 6. 0Hz，3H)，1. 25 (m, 24H), 0. 86 (t, J = 7. 0Hz，3H).实施例7Boc-Pro-Ala-Lys (Z) -OCH2 (CH2) 12CH3 (2)的制备按照实施例2 的制备方法由 2. 74g(5mmol) Boc-Pro-Ala-Lys (Z)和 0. 93g(5mmol) CH3(CH2)12CH2OH 得 3. 24g(87 % ))标题化合物，为米黄色固体。ESI_MS(m/e)
■γη
744[Μ+Η]+. [α]β = -1.96 (c = 1.1, CH3OH). Mp :90. 3-91. 8 V . IR(KBr) :3294,2929,2856, 1697，1531，1454，1390，1365，1249，1165，1026，777，738，698. 1HNMR (300MHz, CDCl3) δ / ppm = 7. 18(m，5H)，6· 56 (t, J = 7. 2Hz, 1Η)，5· 2 (m，3Η)，4· 5 (m，5Η)，3· 42(m，4H)，1. 5-2 (m， 10Η)，1. 48 (m, 36H), 0. 89 (t, J = 6. 9Hz，3H).实施例 8Pro-Ala-Lys (Z) -OCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例5 的制备方法，从 0. 716g(l. (Mimol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OCH2-(CH2)1 2CH3制得0. 573g(93% )标题化合物，为米黄色固体。ESI-MS(m/e) :644[M+H]+.实施例9Pro-Ala-Lys-OCH2 (CH2) 12CH3 (4)的制备按照实施例6 的制备方法由 0. 616g (Immol) Pro-Ala-Lys (Z) -OCH2- (CH2) 12CH3 制得0. 49g(80 标题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/e)
510[M+H]+. [a] D = -26.07 (c = 1, CH3OH). Mp 121. 9-122. 5 °C . IR(KBr) =3255,3055,2924, 2854，1735，1654，1541，1454，1384，1164,725.1H NMR(300MHz，CDCl3) δ/ppm = 8. 46(m, 2H), 4. 20 (m, 2H), 4. 03 (m, 2H), 3. 36 (s, 1H), 2. 72 (t, J = 6· 0Hz，4H)，2. 01 (s，3H)，1. 91 (m， 4H)，1. 66 (t, J = 5. 5Hz，6H)，1. 38 (t, J = 6. 5Hz，3H)，1. 28 (m, 24H), 0. 86 (t, J = 7. OHz, 3H).实施例IOBoc-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -NHCH2 (CH2) 12CH3 (5)的制备按照实施例2 的制备方法由 3. 08g(5匪ol)Pro-Ala-Lys(Z)-NHCH2(CH2)12-CH3 和 1. 6g(5. Ommol)Boc-Arg(NO2)制得 3. 67g(80%)标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/e) 944[Μ+Η]+. [α] = -13.1 (c=1.0, CH3OH). Mp 98. 0-98. 9 °C . IR(KBr) :3280,2926,2852, 1708，1635，1529，1452，1390，1365，1253，1166，1052，1001，777，734，698. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ /ppm = 7. 39 (m, 5Η)，6. 63 (s, 1Η)，4-5 (m, 4H)，3. 6 (m, 2H)，3. 2 (m, 4H)，2. 1 (m, 5H)， 1-2 (m,44H) ,0. 89 (t, J = 6. 9Hz，3H).实施例1 IArg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -NHCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例5 的制备方法，从 0. 917g(l. Ommol)Boc-Arg(NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -N HCH2(CH2) 12013制得 0.7768(95% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/e) 844[M+H]+.实施例12Arg-Pro-Ala-Lys_NHCH2 (CH2) 12CH3 (7)的制备
按照实施例 6 的制备方法由 0.817g (Immol) Arg (NO2)-Pro-Ala-Lys (Z )-NHCH2 (CH2) 12CH3 制得 0. 445g(70 % )标题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/e) 665[Μ+Η]+. [α] = -79.8 (c=l.l, CH3OH). Mp :102. 2-104. 7 V · IR(KBr) :2926, 2850，2794， 1639,1533,1452,1369,1242,1159,1049,723.1H NMR(300MHz，CDCl3) δ/ppm = 8. 28(d, J = 4. 5Ηζ，5Η)，7· 91 (d, J = 9. OHz, 1Η)，6· 7 (m，2Η)，4· 43 (s，3Η)，3-4 (m，5Η)，2· 72 (d, J = 11. 5Ηζ，6Η)，2. 01(s，5H)，1. 5-2. O (m，14Η)，1. 38(s，3H)，1. 28 (d, J = 7. 0Hz，20H)，0. 86 (t, J = 7. 0Hz，3H).实施例 I3Boc-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -OCH2 (CH2) 12CH3 (6)的制备按照实施例2 的制备方法由 3. 08g (5mmol) Pro-Ala-Lys (Z) -OCH2 (CH2) 12CH3 和
1.6g(5. OmmoDBoc-Arg(NO2)制得 3. 90g(85%)标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/e) 945[Μ+Η]+. [α]ο = -92.2 (c=l.l, CH3OH). Mp 89. 8-90. 1 "C . IR(KBr) :3280,2926,2852, 1708，1635，1529，1452，1390，1365，1253，1166，1052，1001，777，734，698. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ /ppm = 7. 47 (m, 5H)，6-7 (m, 1H)，4-5 (m, 4H)，3. 6 (m, 2H)，3. 2 (m, 4H)，2. 1 (m, 5H)， 1-2 (m,46H) ,0. 89 (t, J = 6. OHz，3H).实施例14Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -OCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例5 的制备方法，从 0. 917g(l. Ommol)Boc-Arg(NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -O CH2(CH2) 12013制得 0.7768(95% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/e) :845[M+H]+.实施例I5Arg-Pro-Ala-Lys-OCH2 (CH2) 12CH3 (8)的制备按照实施例6 的制备方法由 0.818g (Immol) Arg (NO2)-Pro-Ala-Lys ( Ζ) -OCH2 (CH2) 12CH3 制得 0. 60g(84 % )标题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/e) 666[Μ+Η]+. [α]λ = -25.7 (c=1.0, CH3OH). Mp :122. 8-123. 2 "C · IR(KBr) :2924,2852,1743, 1654，1525，1456，1240，1161，1043,721. 1H NMR(300MHz，CDCl3) δ /ppm = 8.3_9(m，2H)， 8. 37 (d, J = 3. 0Hz，2H)，7. 47(s，1H)，6. 63(s，2H)，4. 17 (d, J = 5. 5Hz，5H)，3. 51 (m，3H)，
2.73 (t, J = 5. 5Hz，4H)，2. 35(d，J = 6. 0Hz，2H)，2 (s，5H)，1. 91 (s，2H)，1. 58 (m，8H)， 1. 36 (d, J = 14. 0Hz，27H)，0. 86 (t, J = 7. 0Hz，3H).实施例16Boc-Ala_Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -NHCH2 (CH2) 12CH3 (9)的制备按照实施例2 的制备方法由 0. 945g(5mmol) Boc-Ala 和 4. 09g(5. Ommol) Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z)-NHCH2 (CH2)12CH3 制得 3. 77g(77% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/ e) :1016[Μ+Η]+. [α] = -19.2 (c=1.2, CH3OH). Mp : 133. 5-134. 1 °C . IR(KBr) :3315,2929, 2856，1632，1533，1454，1395，1367，1253，1165，1066，740，721，696. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ /ppm = 8. 22 (m, 4H)，7. 36 (m, 5H)，4-5 (m, 9H)，3. 40 (m, 4H)，2. 45 (m, 7H)，1-2 (m, 49H)， 0. 88 (t, J = 6. 0Hz, 3H).实施例I7Ala-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -NHCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例5 的制备方法，从 1. 016g(l. Ommol)Boc-Ala-Arg(NO2)-Pro-Ala-Lys (Ζ )-NHCH2(CH2)12CH3 制得 0. 719g(81% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :916[Μ+Η]+·实施例I8Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-NHCH2 (CH2)12CH3 (I5)的制备按照实施例6 的制备方法由 0. 953g (Immol) Ala-Arg (NO2)-Pro-Ala-Lys ( Ζ)-NHCH2(CH2) 12CH3 制得 0. 59g(73 % )标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)736[Μ+Η]+. [α]^= -11.34 (c=1.0, CH3OH).Mp :102. 2-104. 7°C. IR(KBr) :3055,2929,2856, 1737，1624，1533，1375，1238，1168，1035,725. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ/ppm = 8. 45(d, J =7. 2Hz,2H)，8. 21 (m, 3H)，6. 63 (s, 1H) ,4. 31 (m, 4H)，4· 13 (s，2H)，3-4 (m, 3H)，2. 69 (m, 6H)，
2.0(d, J = 1.8Hz，5H)，1.81(m，6H)，1.55(d，J = 6. 6Hz，7H)，1· 31 (m，25H)，0· 85 (t，J = 7. 2Hz,3H).实施例19Boc-Gly_Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -NHCH2 (CH2) 12CH3 (10)的制备按照实施例2 的制备方法由 0. 875g(5mmol) Boc-Gly 和 4. 09g(5. 0mmol)Arg(N02)
-Pro-Ala-Lys (Z)-NHCH2 (CH2)12CH3 制得 3.41g (70% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/ 20
e) :1002[Μ+Η]+· [α]ο =-76.3 (c=l.2，CH3OH). Mp :94. 0-94. 6 °C . IR(KBr) :3329,2929, 2856，1654，1529，1452，1392，1367，1247，1163，1051，1026，748，721，698. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ /ppm = 8. 22 (m, 4H)，7. 36 (m, 5H)，4-5 (m, 9H)，3. 40 (m, 4H)，2. 45 (m, 7H)，1-2 (m, 49H) ,0. 88 (t, J = 6. 0Hz, 3H).实施例20Gly_Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -NHCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例5 的制备方法，从0. 974g(l. Ommol)Boc-Gly-Arg(NO2) -Pro-Ala-Lys (Ζ )-NHCH2(CH2)12CH3 制得 0. 725g(81% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :902[M+H]+.实施例21Gly-Arg-Pro-Ala-Lys_NHCH2 (CH2)12CH3 (16)的制备按照实施例6 的制备方法由 0. 874g (Immol) Gly-Arg (NO2)-Pro-Ala-Lys ( Ζ)-NHCH2(CH2) 12CH3 制得 0. 52g(73 % )标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e) 722[Μ+Η]+. [α]λ = -11.9 (c=l.l, CH3OH). Mp :144-145 °C · 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ /ppm =8. 33 (d, J = 6. 9Ηζ，4Η)，7· 84 (t, J = 4. 8Hz，1H)，5-7 (m，4H)，4· 31 (t，J = 4. 2Hz，4H)，
3.59 (m, 7H)，2. 72 (d, J = 4. 8Hz,6H)，2. 05 (s, 5H)，1. 81 (m, 4H)，1. 55 (s,6H)，1. 36 (m, 27H)， 0. 88 (t, J = 6. 0Hz，3H).实施例22Boc-Gln_Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -NHCH2 (CH2) 12CH3 (11)的制备按照实施例2 的制备方法由 1. 23g(5mmol) Boc-Gln 和 4. 09g(5. Ommol) Arg (NO2)-Pro-Ala-Lys (Z) -NHCH2 (CH2) 12CH3 制得 4. 33g(82% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/ e) :1085[Μ+Η]+. [α]^= -52.6 (c=1.2, CH3OH). Mp :90. 9-91. 6 °C . IR(KBr) :3325,2926, 2850，1697，1627，1573，1535，1448，1392，1367，1311，1159，1087，732，696.1H NMR(300MHz, CDCl3) δ /ppm = 8. 72 (m, 4H)，7. 26 (m, 5H)，4-5 (m, 9H)，3. 40 (m, 4H)，2. 45 (m, 7H)，1-2 (m, 49H) ,0. 88 (t, J = 6. 0Hz, 3H).实施例 23Gln_Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -NHCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例5 的制备方法，从 1. 045g(l. Ommol)Boc-Gln-Arg(NO2) -Pro-Ala-Lys (Ζ )-NHCH2(CH2)12CH3 制得 0. 822g(87% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :985[Μ+Η]+·实施例24Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-NHCH2 (CH2)12CH3 (Π)的制备按照实施例6 的制备方法由 0. 985g(l謹ol) Gln-Arg (NO2)-Pro-Ala-Lys (
Z) -NHCH2 (CH2) 12CH3 制得 0. 499g (63 % )标题化合物，为无色油状物。ESI-MS (m/e) 20
793[Μ+Η]+. [α]ο = -12.03 (c-1.0, CH3OH). Mp :131-132 V . IR(KBr) :2926,2848,1625, 1573，1448，1311，1242，1069，893，721，640. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ/ppm = 7· 9(m，9H)， 6. 43 (s，2Η)，4-5 (m, 4H)，3-4 (m, 5H)，2. 51 (m，6H)，2. 01 (t，J = 5. OHz，9H)，1-2 (m, 37H)，0. 86 (t, J = 5. 0Hz, 3H).实施例25Boc-Ala_Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -OCH2 (CH2) 12CH3 (12)的制备按照实施例2 的制备方法由 0. 945g(5mmol) Boc-Ala 和 4. 09g(5. 0mmol)Arg(N02)-
Pro-Ala-Lys (Z)-OCH2 (CH2)12CH3 制得 3. 89g(74% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/e) 20
1016[M+H]+. =-45.1 (c=l.l, CH3OH). Mp :78-79 V . IR(KBr) :3313，2933，2868，1631， 1537，1452，1392，1367，1251，1166，1051，1026，750，738，696. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ / ppm = 8. 39 (m, 3H)，7. 30 (m, 5H)，6. 68 (m, 3H)，5. 12 (m, 2H)，4. 53 (m, 5H)，4. 09 (t，J = 6. 5Hz, 2H)，3. 62 (m, 2H)，3. 13 (m, 2H)，2. 25 (s,7H)，1. 71 (m, 6H)，1. 53 (m, 12H)，1. 30 (m，31H)， 0. 90 (t, J = 7. 0Hz, 3H).实施例26Ala_Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -OCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例5 的制备方法，从 0. 989g(l. Ommol)Boc-Ala-Arg(NO2) -Pro-Ala-Lys ( Ζ)-OCH2(CH2)12CH3 制得 0. 755g(81% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :916[Μ+Η]+·实施例27Ala-Arg-Pro-Ala-Lys_0CH2 (CH2)12CH3 (18)的制备按照实施例6 的制备方法由 0. 917g (Immol) Ala-Arg (NO2)-Pro-Ala-Lys (Z)-OCH2(CH2)12CH3 制得 0. 68g(74 % )标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e) 738[Μ+Η]+. [α]B = -15.9 (c=l.l, CH3OH). Mp 80. 6-81. 7 "C . IR(KBr) :3055,2951,2852, 1739,1653,1550,1456,1375,1251,1161,719. 1H NMR(300MHz，CDCl3) δ/ppm = 8. 9(m, 5H)，7· 95 (s，1H)，6. 6(s，2H)，4. 35 (d, J = 5. lHz，6H)，3. 64(m，3H)，2. 73 (s，6H)，2. O (s， 5H)，1. 78 (m, 4H)，1. 59 (s,6H)，1. 31 (m, 30H)，0. 85 (s, 3H).实施例 ^Boc-Gly-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -OCH2 (CH2) 12CH3(13)的制备按照实施例2 的制备方法由 0. 875g(5mmol) Boc-Gly 和 4. 09g(5. Ommol) Arg (NO2)-
Pro-Ala-Lys (Z)-OCH2 (CH2)12CH3 制得 3. 41g(70% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/e) 20
1002[Μ+Η]+. [α]· =-54.9 (c=l.2, CH3OH). Mp :88-89 V . IR(KBr) :3313，2933，2868，1631， 1537，1452，1392，1367，1251，1166，1051，1026，750，738，696. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ / ppm = 8. 45 (m, 3H)，7. 30 (m, 5H)，6. 68 (m, 3H)，5. 12 (m, 2H)，4. 53 (m, 5H)，4. 09 (t，J = 6. 5Hz, 2H)，3. 62 (m, 2H)，3. 13 (m, 2H)，2. 25 (s,7H)，1. 71 (m, 6H)，1. 53 (m, 12H)，1. 30 (m，31H)， 0. 90 (t, J = 7. 0Hz, 3H).实施例29Gly_Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -OCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例5 的制备方法从 1. 002g(l. Ommol)Boc-Gly-Arg(NO2) -Pro-Ala-Lys (Ζ )-OCH2(CH2)12CH3 制得 0.787g(86% )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/e) :900[M+H]+.实施例30Gly-Arg-Pro-Ala-Lys_0CH2 (CH2)12CH3 (19)的制备按照实施例6 的制备方法由 0. 875g (Immol) Gly-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z)-OCH2(CH2)12CH3制得0. 520g(75% )标题化合物，为无色油状物，易吸潮。ESI-MS (m/e) 723[M+H]+. [a] D= -75.3 (c=1.0, CH3OH). Mp :75-76 °C . IR(KBr) :2924，2858，1737，1624， 1544,1448,1404,1242,1207,1049,719. 1H NMR(300MHz，CDCl3) δ/ppm = 7. 9(m,4H), 6. 63(s，2H)，5· 12(m，2H)，4-5(m，6H)，3-4(m，5H)，2. 37(m，6H)，2. 01 (s，5H)，1. 82 (m, 10H)， 0. 86 (t, J = 5. 0Hz，3H).实施例31Boc-Gln_Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -OCH2 (CH2) 12CH3 (14)的制备
按照实施例2 的制备方法由 1. 23g(5mmol) Boc-Gln 和 4. 09g(5. (Mimol)Arg(NO2)-P ro-Ala-Lys(Z)-0CH2 (CH2)12CH3 制得 4. 18g(80% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/e) 1073[Μ+Η]+. [α] λ = -40.0 (c=1.2, CH3OH). Mp :98-99 V . IR(KBr) :3313，2933，2868，1631， 1537，1452，1392，1367，1251，1166，1051，1026，750，738，696. 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ / ppm = 8. 44 (m, 3H)，7. 38 (m, 5H)，6. 87 (m, 3H)，5. 12 (m, 2H)，4. 53 (m, 5H)，4. 09 (t，J = 6. 5Hz, 2H)，3. 62 (m, 2H)，3. 13 (m, 2H)，2. 25 (s,7H)，1. 71 (m, 6H)，1. 53 (m, 12H)，1. 30 (m，31H)， 0. 90 (t, J = 7. 0Hz, 3H).实施例32Gln_Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -OCH2 (CH2) 12CH3 的制备按照实施例5 的制备方法，从 1. 046g(l. Ommol)Boc-Gln-Arg(NO2) -Pro-Ala-Lys ( Ζ)-OCH2(CH2)12CH3 制得 0.804g(83% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :973[Μ+Η]+·实施例33Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-0CH2 (CH2)12CH3QO)的制备按照实施例6 的制备方法由 0. 973g (Immol) Gln-Arg (NO2)-Pro-Ala-Lys (
Ζ)-OCH2(CH2) 12CH3 制得 0. 517g(64 % )标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e) 20
793[Μ+Η]+. [α] β = -41.8 (c=1.0, CH3OH). Mp :136_137°C · IR(KBr) :2920，2818，1735，1618， 1543,1448,1408,1110,997,721.1H NMR(300MHz，CDCl3) δ /ppm = 8. 47(s,5H) ,7. 37 (m, 3Η)，6· 68(s，2H)，4-5(m，6H)，3· 37 (m，3H)，2. 73 (d, J = 5. 0Hz，6H)，2. 00(m，7H)，1. 7(m, 10H)，1. 36 (d, J = 5. 0Hz，23H)，0. 86 (t, J = 5. 0Hz，3H).实验例1化合物3，4，7，8，15-20静脉注射给药的体内溶血栓活性试验1)评价方法将200_220g雄性SD大鼠用20%乌拉坦溶液(6mL/kg，i. p.)进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，在远心端插管，松开动脉夹，放出约ImL动脉血并装在ImL的EP管中。往垂直固定的玻璃管(长15mm，内径2. 5mm，外径5. Omm，管底用胶塞密封)中注入0.1ml大鼠动脉血液，往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺旋用直径为0. 2mm的不锈钢丝绕成，螺旋部分长12mm，含15个螺圈，螺圈的直径为 1.0mm，托柄与螺旋相连，长7. Omm，呈问号型。血液凝固15min后，打开玻璃管底部的胶塞， 用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精确称重。旁路插管由3段构成，中段为聚乙烯胶管，长60mm，内径3. 5mm,两端为相同的聚乙烯管，长100mm，内径1mm，外径2mm，该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)， 外径1mm，另一端的外部套一段长7mm，外径3. 5mm的聚乙烯管(加粗，用于插入中段的聚乙烯胶管内)。3段管的内壁均硅烷化。将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内， 胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)备用。分离大鼠的左颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，同时远离旁路管中段(含精确称重的血栓固定螺旋)内血栓固定螺旋的托柄。 用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU/kg)，此时注射器不撤离聚乙烯管，用止血钳夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定。用头皮针将生理盐水，尿激酶的生理盐水溶液或不同浓度化合物的生理盐水溶液通过旁路管的中段(含精确称重的血栓固定螺旋)，刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处，打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉，此即大鼠动静脉旁路溶栓模型，缓慢将注射器中的液体注入到血液中(约6min)，使生理盐水，尿激酶或本发明的化合物通过血液循环，按静脉-心脏-动脉的顺序作用到血栓上。从开始注射时计时，Ih后从旁路管道中取出血栓固定螺旋，精确称重。计算每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差，统计并评价化合物的体内溶栓活性。血栓减重用均值和标准差(I ± SD)表示。2)给药方法和剂量静脉注射给药；空白对照生理盐水，给药剂量为3mL/kg ；阳性对照尿激酶，给药剂量为20000U/kg，相当于1. 68mg/kg ；本发明化合物的给药剂量为1. Onmol/kg.
3)评价结果如表1所示。表1化合物血栓减重(I± SD mg)化合物血栓减重SDmg)生理盐水10.43 士 2.261516.65 ± 2.33 b尿激酶19.64 ± 3.98 b1615.85 ± 2.07 b316.52 ± 3.38 b1715.96 ± 2.53 b415.29 士 2.53 b1816.85 士 3.17b717.52 ± 2.55 b1917.76 ± 2.21 b814.01 ±2.10b2016.09 士 3.54 b表1为1. Onmol/kg化合物3，4，7，8，15-20经静脉注射给药的溶血栓活性％其中， a)n = 10，尿激酶剂量为20000U/kg ；b)与生理盐水组比，P < 0. 01.
实验例2化合物19静脉注射给药的溶血栓量效关系
1)评价方法
同实验例1中1)的方法。
2)给药方法和剂量
静脉注射给药；选取高、中、低三个浓度考察化合物19的剂量效应依赖关系，剂量为 lnmol/kg,0. lnmol/kg 禾口 0. 01nmol/kg·3)评价结果如表2所示。表权利要求
1.以下结构的化合物，Pro-Ala-Lys-R-CH2 (CH2) 12CH3其中R为NH或O。
2.以下结构的化合物，Arg-Pro-Ala-Lys-R-CH2 (CH2) 12CH3其中R为NH或O。
3.以下结构的化合物，AA-Arg-Pro-Ala-Lys-R-CH2 (CH2) 12CH3其中AA为Ala、Gly或Gln，R为NH或O。
4.一种制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于包括如下步骤(1)在二环己基碳二亚胺(DCC)存在下Boc-Pro在无水THF中与N-羟基琥珀酰亚胺 (HOSu)缩合为 Boc-Pro-Osu，在 NaHCO3 存在下 Boc-Pro-OSu 与 Ala 反应生成 Boc-Pro-Ala ；(2)在DCC和HOBt存在下Boc-Pro-Ala在无水THF中与Lys(Z)-OBzl缩合为 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl ；(3)在NaOH存在下，在甲醇中将Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl皂化为 Boc-Pro-Ala-Lys (Z)；(4)在DCC 和 HOBt 存在下 Boc-Pro-Ala-Lys (Z)在无水 THF 中与 R1CH2 (CH2) 12CH3 缩合为 Boc-Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3，其中队为 NH2 或 0H，& 为 NH 或 O ；(5)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Pro-Ala-Lys(Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3脱去保护基生成 Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3 ；(6)在乙醇、Pd/C和吐存在下Pro-Ala-Lys(Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3脱去保护基得到权利要求1所述化合物。
5.一种制备权利要求2所述化合物的方法，其特征在于包括如下步骤(1)在DCC和HOBt存在下Boc-Arg(NO2)在无水THF中与权利要求4的步骤(5)所得化合物缩合为 Boc-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3 ；(2)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2- (CH2) 12CH3 脱去 Boc 生成 Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3 ；(3)在乙醇、Pd/C和 H2 存在下 Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3 脱去保护基， 得到权利要求2所述化合物。
6.一种制备权利要求3所述化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)在DCC和HOBt存在下Boc-AA在无水THF中与权利要求5中步骤(2)所得化合物缩合为 Boc-AA-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3 ；其中 AA 为 Ala、Gly 或 Gln 的残基；(2)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-AA-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3 脱去 Boc 生成 AA-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2 (CH2) 12CH3 ；(3)在乙醇、Pd/C和 H2 存在下 AA-Arg (NO2) -Pro-Ala-Lys (Z) -R2CH2- (CH2) 12CH3 脱去保护基，得到权利要求3所述的化合物。
7.—种药物组合物，其特征在于，含有治疗上有效剂量的权利要求1所述化合物或权利要求2所述化合物或权利要求3所述化合物，并含有一种或多种药学上可接受的赋型剂或者辅加剂。
8.—种药物制剂，其特征在于，将有效量的权利要求1所述化合物或权利要求2所述化合物或权利要求3所述化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。
9.权利要求1-3中任一项所述化合物在制备溶血栓药物中的应用。
10.权利要求7所述的药物组合物在制备溶血栓药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于溶血栓的寡肽化合物及其制备方法和应用。本发明的溶血栓寡肽化合物如以下结构所示。本发明通过动物实验评价了本发明寡肽化合物的溶血栓活性，证明了本发明的寡肽化合物除具有优秀的溶血栓活性外，还具有自主装性能。AA-Arg-Pro-Ala-Lys-R-CH2(CH2)12CH3。
文档编号A61P7/02GK102485744SQ201010576378
公开日2012年6月6日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者彭师奇, 蒋雪云, 赵明 申请人:首都医科大学