专利名称：光敏组合物的制作方法
光敏组合物本发明涉及光敏组合物及其在通过光化学内在化(photochemicalinternalization, " PCI")将药物分子递送至细胞的方法中的用途。更具体地，其涉及用于该方法的组合物，所述组合物包括两亲性光敏剂(amphiphilic photosensitizingagent)的水溶性盐，因此适于肠胃外给药。光化学疗法或光动力学疗法(TOT)是用于治疗多种异常或病症的技术。PDT可用于治疗皮肤或其它上皮器官或粘膜的病症，特别是癌症或癌前期病变。其也可用于治疗非癌性病症，例如痤疮和与年龄相关的黄斑变性。PDT涉及将光敏剂施用在受影响的身体区域，然后将该区域暴露于光敏化光中以激活光敏剂。光敏剂经激活转化为细胞毒性形式，其可杀死受影响细胞或降低受影响细胞的增殖能力。已知有一系列光敏剂用于TOT。已知用于临床的那些光敏剂包括5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)、5-ALA甲酷,5-ALA己酷，维替泊芬(verteporf in),补骨脂素(psoralen)和口卜菲尔钠(porfimer)。5-ALA (Levulan )和5-ALA甲酯(Metvix )用于治疗多种皮肤症状；5-ALA己酯(Hexvix )用于诊断膀胱癌；维替泊芬(Visudyne )用于治疗眼的黄斑变性；以及卟菲尔钠(Photofrin )用于治疗肺癌以及姑息治疗阻塞性食管癌。光化学内在化(也已知简称为"PCI")是一种药物递送方法，其涉及使用光和光敏剂将不可透过膜的药物引至细胞的胞质(cytosol)中，但该方法并不必然导致细胞破坏或细胞死亡。在该方法中，将待内化或转移的分子与光敏剂组合施用于细胞。将这些细胞暴露于合适波长的光激活了所述光敏剂，其又导致细胞内腔室膜的破裂并因此将所述分子释放入胞质中。在PDT中，光对所述光敏剂作用，形成直接对疾病产生影响的细胞毒性物质。不同的是，在PCI中，所述光敏剂和光之间的相互作用用于影响细胞，使得药物的细胞内摄取增加。这两种机理都经过涉及单态氧物质的途径。单态氧是氧的高反应性形式，可氧化多种生物分子，包括细胞膜中的分子。在TOT中，通常不使用直接作用的治疗剂，而在PCI中，直接作用的药物(或其前药)经常用于与所述光敏剂结合。可认为是"直接作用"的药物是具有内在生物活性(治疗性或预防性)的药物。当出现于体内的所需靶点时，所述药物不需要光来激活。可用于PCI中的光敏剂也可用于PDT中，然而并非所有TOT-活性光敏剂可用于PCI中。PCI 公开于以下专利文件中TO 96/07432，WO 00/54708, WO 02/44396，WO02/44395，WO 03/020309，US-A-6, 680，301 和 US-A-5, 876,989。该技术还公开于以下出版物中Berg, K.等人，Cancer Res. (1999) 59,1180-1183, H0gset, A.等人，Hum.Gene Ther. (2000) 11，869-880，Prasmickaite, L.等人，J. Gene Med. (2000)2,477-488,Selbo, P. K.等人，Biochim. Biophys. Acta (2000) 1475, 307-313, Selbo, P. K.等人，Int.J. Cancer (2000) 87，853-859，Selbo, P. K.等人，Int. J. Cancer (2001) 92，761-766，Berg,K.等人，Photodynamics News (2001) 4, 2-5, Prasmickaite, L.等人，Photochem. Photobiol.(2001)73,388-395, Selbo, P. K.等人，Photochem. Photobiol. (2001)74,303-310, Selbo.P. K.等人，Tumor Biol. (2002) 23,103-112, H0gset, A.等人，Adv. Drug Deliv. Rev.(2004)56,95-115，Berg, K 等人，Curr. Op in. Mo I. Ther. (2004)6,279-287，Prasmickaite,L.等人，Expert Opin. Mol. Ther. (2004)4,1403-1412, Berg, K. et al. in Clin. Cancer.Res. (2005) 11,8476-8485, Berg, K.等人，Curr. Pharmacol. Biotech (2006) 8, 362-372 和ffeyergang, A.等人，Photochem. Photobiol. Sci. (2008)7,1032-1040。很多不 同光敏剂已提出用于PCI中。它们包括例如酞菁(phthalocyanine),例如二横化的酞菁招(di-sulphonated aluminium phathalocyanines)(例如 AlPcS2 和AlPcS2a);横化的四苯基B卜啉(sulphonated tetraphenylporphyrins)(例如 TPPS2a, TPPS4,TPPS1和TPPS2。)；尼罗蓝(Nile Blue) ;二氢卟酚(chlorin)和二氢卟酚衍生物，包括细菌二氧B卜酌· (bacteriochlorins)和二氧B卜酌■丽(ketochlorin);尿口卜琳I ;叶赤素；天然和合成的卩卜啉(porphyrin),包括血卩卜啉(hematoporphyrin)和苯并卩卜啉(benzoporphyrins)；亚甲蓝；阳离子染料；四环素类，萘酞菁(naphthalocyanine);德克萨卩卜啉(texaphyrine)；脱镁叶绿酸盐(pheophorbide);红紫素；若丹明；突光素；趋溶酶体弱碱(lysosomotropicweak base);和卩卜啉烯(porphycene)。本发明人已证实，显示两亲性性质并且包括一个或多个带电荷基团的光敏剂尤其适用于PCI。所述光敏剂尤其包括磺化的四苯基卟啉和二氢卟酚。然而，尽管将两亲性光敏剂用于PCI体外研究取得了令人鼓舞的结果，所述化合物仍未实现广泛的临床用途。本发明人已认识到，使用已知的两亲性光敏剂用于PCI的重大问题涉及该试剂在溶液中较差的溶解性，特别是在水溶液中，例如在可能用于肠胃外给药的溶液中(所述试剂的水溶性远远小于0. 5mg/ml)。迄今为止，该问题尚未阐述于任何现有技术文献中。应理解，水溶性很低的光敏剂有从溶液中沉淀出来的趋势，这可导致严重的体内副作用，尤其是在将所述光敏剂给药至血管系统中时。这些副作用可包括发烧和多种免疫反应，并且在一些情况下可能是致命的。因此，即使最强效的两亲性光敏剂(photosensitizer),目前也不适用于肠胃外药物制剂(例如用作注射用或输注用溶液)。本发明人现已经开发出了体内进行PCI的替代性(例如改进的)方法，其涉及使用两亲性光敏剂，所述两亲性光敏剂易溶于水，并且因此基本上无上述副作用。因此本发明的一个方面提供两亲性光敏剂的药学上可接受的盐以用于光化学内在化的方法，其中所述盐具有至少0. 5mg/ml的水溶性。所述盐优选具有大于lmg/ml的水溶性，更优选大于3mg/ml或大于5mg/ml。最优选地,其具有大于10mg/ml的溶解度。用于本发明中的盐可具有至少20mg/ml的溶解度,更优选至少25mg/ml的溶解度，例如至少30mg/ml的溶解度。用于本发明中的光敏剂是两亲性的。用于本文中的"两亲性"是指分子的整体性质，其中亲水性和疏水性的程度在整个分子中并不恒定，并且相对于所述分子的其余部分存在更高亲水性区域(例如极性区域)。所述光敏剂典型地包括带有一个或多个带电荷基团的分子，且该分子总体为正电性(阳离子)或负电性(阴离子)。出于本发明的目的，"水溶性"是指在环境温度(例如在约20°C)在水中的溶解度。水溶性的测量可通过以下方法进行在20°C将已称好重量的固体光敏剂与少量水搅拌，使得所述固体不完全溶解，并测量固体上面的溶液(即在上清液)中光敏剂的浓度。术语"药学上可接受的盐"是指保持所述光敏剂生物效能和性质的盐，其由合适的无毒酸或碱形成。用于本文中的术语"光化学内在化"和"PCI"是指分子(例如药物分子)的胞质递送，其包括从细胞内/膜结合腔室释放分子至患者细胞的胞质中的步骤。在本发明的另一方面中，提供了两亲性光敏剂的药学上可接受的盐，所述盐具有至少O. 5mg/ml的水溶性，其用于制备在光化学内在化方法中使用的治疗剂。
在本发明的另一方面中，提供了将药物分子引至患者细胞的胞质中的方法，所述方法包括以下步骤(a)将所述细胞与具有至少O. 5mg/ml水溶性的两亲性光敏剂的药学上可接受的盐接触；(b)将所述细胞与所述药物分子接触；和(C)用有效激活所述光敏剂的波长的光照射所述细胞。根据本发明使用的所述光敏剂可为任何具有所需两亲性性质的已知光敏剂，且其定位于细胞内腔室(尤其是核内体或溶酶体)。本领域中已知一系列合适的光敏剂，其公开于文献中用于PCI，包括WO 96/07432,WO 03/020309和GB-A-2420784。这些光敏剂具体包括酞菁，例如二磺化的酞菁铝(尤其是邻位磺化的二磺化的酞菁铝)；磺化的四苯基卟啉(TPPSn，例如TPPS2a和TPPS1) ;二氢卟酚和二氢卟酚衍生物，包括细菌二氢卟酚和二氢卟酚酮；和天然和合成的卟啉，包括血卟啉和苯并卟啉。以下属于本发明所用的最优选的光敏剂TPCS2a、TPPS2a、AlPcS2a和卟菲尔钠(Photofrin )』卜菲尔钠(Photofrin )是多种物质的非均质混合物，其中的至少一些物质是两亲性的。用于本发明中的盐可由药学上可接受的碱形成，所述碱例如有机胺，特别是氨基醇(或烷醇胺(alkanolamine))。这些化合物能够与阴离子光敏剂形成盐。用于本文中的术语"氨基醇"包括任一既含有至少一个胺官能团又含有至少一个醇官能团的有机化合物。或者，用于本发明中的盐可为药学上可接受的酸加成盐。形成盐的合适的酸是磺酸和磺酸衍生物，其能够与阳离子型光敏剂形成盐。符合本发明的形成盐的合适的碱包括氨基醇。所述化合物可为直链、支链或环状。尤其适于制备本文所述盐的氨基醇包括低级脂肪氨基醇，例如单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺和2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1，3-二醇等等。其它合适的氨基醇包括环状化合物，例如4-(2-羟基乙基)-吗啉和I-(2-羟基乙基)-吡咯烷。本发明尤其优选与氨基糖(葡萄糖胺和N-甲基葡萄糖胺(葡甲胺))形成的碱性盐。尤其优选的用于本发明的盐是N-甲基葡萄糖胺盐和乙醇胺盐。用于本文中的术语"磺酸"是指包含至少一个-SO3H基团的任一有机化合物。其可包括1、2或3个-SO3H基团，最优选I或2个,例如I个。当与磺酸关联使用时,术语"衍生物"是指包含至少一个(优选1、2或3个，最优选I或2个，例如I个)-SO3X基团的任一化合物(其中X为生理学可耐受的阳离子，例如钠、钙、钾、镁或葡甲胺阳离子)。根据本发明的酸加成盐典型地源自阳离子型光敏剂和一元磺酸(例如甲磺酸)，从而形成I : I盐。或者，盐可在所述光敏剂和二元或三元磺酸(例如乙烷-1，2-二磺酸)之间形成。在使用具有多于一个酸性质子的酸的情况下，所得盐的化学计量比可能不为I : 1，例如为2 : I (光敏剂酸)或3 I (光敏剂酸)。适用于形成根据本发明的盐的磺酸和磺酸衍生物包括式R-SO3IKI)和R-SO3X(II),其中R可为氢原子或任选被取代的烷基基团(例如C1J烷基)或芳基基团(例如至多20个碳原子的芳基)，优选任选被取代的烷基或芳基基团。用于本文中的术语"烷基"包括任一长链或短链，直链、支链或环状脂肪族，饱和或不饱和经基。任选地，该基团可被例如轻基、烧氧基、酸基氧基、硝基、烧氧基擬基氧基、氣基、芳基、氧代或卤素(例如氟或氯)基团取代(例如单取代或多取代)。所述不饱和烷基基团可为单不饱和或多不饱和，并且包括烯基和炔基基团。用于本发明的优选盐由式⑴或(II)的酸形成，式中R为任选被取代的(即单取代或多 取代)直链、支链或环状(例如单环或双环，桥环或非桥环)烷基基团，所述基团可含有至多20个碳原子；或为任选被取代的(即单取代或多取代)芳基基团，所述基团优选含有至多20个碳原子。基团R的优选取代基包括Cu烷基(例如甲基)、羟基、烷氧基、酰基氧基、硝基、烧氧基擬基氧基、氣基、芳基、氧代和齒素(例如氣或氣)。通常，根据本发明的由光敏剂和磺酸化合物形成的盐包括单个磺酸部分，即为一元酸。然而，如上所述，也可使用由多于一个磺酸部分(例如2或3个所述基团)的酸形成的盐。因此可存在于基团R中的其它取代基包括一个或多个、优选一个_S020H、-SO2OX (其中X在下文中定义)或-S020_基团。可用于制备根据本发明的盐的二磺酸的代表性实例包括乙烷-1，2- 二磺酸和萘-1，5- 二磺酸。基团R的优选烷基基团可含有至多20个、但优选至多15个，例如至多12个碳原子。然而，优选包含至多10个，例如至多5个、更优选1、2或3个碳原子的烷基基团。特别地，优选具有至多10个碳原子的直链烷基基团，例如甲基，乙基或丙基基团。尽管这些基团可被取代或未被取代，但是优选未被取代的基团。基团R的优选芳基基团包括任选被取代的苯基或萘基基团。所述芳基基团优选被取代，例如被一个或多个(例如一个、两个或三个)可包括(V6烷基基团(优选(V4烷基，例如甲基)、烷氧基(例如甲氧基)、硝基、卤素(例如氟或氯)、-so3H、-SO3X(其中X在下文中定义)、-so2o_或三氟甲基基团的取代基取代。芳基基团的代表性实例包括甲苯(例如对甲苯)、苯、萘和萘磺酸(例如2-萘磺酸)。适于形成本发明所用的酸的磺酸的实例包括乙烷-1，2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基-乙磺酸、甲磺酸和萘-1，5- 二磺酸。用于本发明以PCI递送药物的优选盐的实例包括TPCS2a 二乙醇胺盐TPCS2a乙醇胺盐TPCS2a N-甲基-葡萄糖胺盐TPCS2a三乙醇胺盐TPCS2a 1-(2_羟基甲基)_吡咯烷盐TPCS2a 2-氣基-2-(轻基甲基)丙烧_1，3_ _■醇盐TPPS2a 二乙醇胺盐TPPS2a乙醇胺盐TPPS2a N-甲基-葡萄糖胺盐TPPS2a三乙醇胺盐TPPS2a 1-(2_羟基甲基)_吡咯烷盐
TPPS2a 2-氣基-2-(轻基甲基)丙烧_1，3_ _■醇盐卟菲尔钠二乙醇胺盐卟菲尔钠乙醇胺盐卟菲尔钠N-甲基-葡萄糖胺盐卟菲尔钠三乙醇胺盐卟菲尔钠1-(2-羟基甲基)_吡咯烷盐B卜菲尔纳2-氣基-2-(轻基甲基)丙烧_1，3- _■醇盐。本文所述的各种盐本身是新颖的，并且构成本发明的另一方面。所述盐可为固态(例如粉末状或颗粒状)，或为溶解形式或液体形式(即随时可用的)。用于本发明中的盐可使用本领域已知的标准方法和操作制备。例如，这些盐可通过在合适的溶剂的存在下将所需两亲性光敏剂与合适的酸或碱反应而制备。所述溶剂可容易地由本领域的普通技术人员选择，并且典型地可为水或水溶液。或者，所述反应可在有机溶剂中进行，并且所述成分可溶于其中，例如DMS0、DMF、醇和乙腈。在制备本发明的盐的过程中，所述光敏剂可与所述酸或碱的水溶液或有机溶剂溶液混合。典型地，所述酸或碱将以过量于反应所需的摩尔量存在(例如过量至少10% )。然后可将所述混合物加热，并且在冷却时所述光敏剂的所需盐沉淀，并可以以固体形式回收，例如通过合适的技术(例如过滤)。若必需或需要进一步纯化所述盐时，那么其可通过已知的方法实现，例如用合适的有机溶剂洗涤。合适的溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙醚、THF、乙酸乙酯和其混合物。本发明还涉及药物组合物，其包含本文所述的盐以及至少一种药用载体或赋形齐U。本发明的药物组合物包括单位剂型以及中间制剂(例如粉末或浓缩溶液)。典型地，所述组合物可以以最终的(即随时可用的)剂型的形式提供。这些剂型包括肠胃外剂型，例如可注射溶液或输注用溶液。单位剂量的可注射溶液通常为一个小瓶。肠胃外溶液所述盐的优选浓度为O. I至100mg/ml,优选为O. 5至50mg/ml。优选地，所述随时可用的组合物将以溶液(例如水溶液)的形式提供。例如，将所述盐可溶解于选自水、乙醇或水和乙醇的混合物的溶剂中。典型地，所述溶剂基本上由无菌水组成。与血液相比，准备给药的最终溶液应当优选为等渗或略微高渗(例如具有300m0sm/kg或更高的重量摩尔渗透压浓度(osmolality)。所述液体剂型可通过本领域已知的常规技术制备。例如，在加入任一其它赋形剂前后，通常伴随搅拌以及任选在高温，可将本文所述的水溶性盐溶解于水性溶剂中。若需要，所述组合物可在初始时制成浓缩溶液或混悬液，并在使用前稀释至所需浓度。尽管本文所述的光敏剂主要用于肠胃外给药，但是其也可通过其它途径给药，例如通过局部或口服给药。合适的用于局部给药的制剂包括霜剂和乳剂。合适的用于口服给药的制剂包括片剂和胶囊。所述组合物可包括本领域公知的其它赋形剂，例如载体、稀释剂、填充剂等等。所述赋形剂典型地公开于Martindale' s Extra Pharmacopoeia(36th Edition, 2009)和TheMerck Index (14th Edition, 2006)中。用于PCI的光敏剂的溶液中所用的最优选赋形剂包括能够调节重量摩尔渗透压浓度以形成等渗溶液的药学上可接受的化合物，以及抗氧化齐IJ、缓冲剂、表面活性剂、溶剂和增溶剂。对于肠胃外给药，所述溶液优选应具有2-10的pH。
本文所述的水溶性盐尤其适于制备用于肠胃外给药的液体药物组合物。优选地，所述溶液为水溶液，这意味着水占据了所述溶剂介质的一定比例。通常，水占所述溶剂的至少50 %，更优选至少60 %，更优选至少80 %，更优选至少90 %，例如基本上占所述溶剂的100%。当存在除水之外的另一种溶剂时，其通常为乙醇。根据本发明的组合物可为无菌或非无菌的。然而，对于除外用和胃肠系统(包括口腔)应用之外的大多数用途而言，所述组合物应为无菌的。灭菌方法包括高压灭菌、干热灭菌、Y射线灭菌和用环氧乙烷处理。本文所述的组合物可以以"随时可用的"形式提供，其中所述光敏剂的盐形式已经溶解于水溶液中。或者，其可以以干燥(例如粉末状)形式提供，并且附有指导在使用前伴随搅拌将其溶于水溶液中的说明书。
对于PCI中的使用，本文所述的组合物可以与治疗剂(本文中也称作"药物分子")组合给药。取决于待治疗的症状以及所述组合物的性质等，所述光敏剂可与药物分子共同给药，例如在单一组合物中，或者它们可依次或分别给药。因此本发明的另一方面提供一种产品，其包含本文所述的两亲性光敏剂的药学上可接受的盐以及治疗剂，以同时、分别或依次地用于光化学内在化方法中。或者，本发明的该方面还提供用于光化学内在化方法的试剂盒，其包含(a)第一容器，其包含本文所述的两亲性光敏剂的药学上可接受的盐；(b)第二容器，其包含治疗剂；和(C)第三容器(当所述盐为固体形式时)，其包含用于在使用前将所述盐溶解的水溶液。当所述治疗剂意欲与所述光敏剂的盐共同给药时，其可在使用前溶解或混悬于同一溶液(例如水溶液)中。待转移至患者细胞的细胞内腔室中的药物分子和所述光敏剂可同时或依次施用于细胞，然后所述光敏化合物和所述分子被内吞或以其它方式被移位至核内体、溶酶体或其它被细胞内膜限制的腔室中。通过以下方式释放细胞中待内化的分子将细胞暴露于合适的波长的光，以激活所述光敏化合物，其又导致细胞内腔室膜破裂，并因此将所述分子释放入胞质中。加入所述待转移分子(即所述药物分子)和光敏剂的精确时机以及进行照射以达到上述效果的时机需要考虑多种因素，包括待处理细胞、所述药物分子的性质、细胞的环境、以及给药是直接给药于靶组织还是给药于远端部位。考虑到这些因素，本领域的普通技术人员可容易地确定合适的时机。典型地，所述药物分子和所述光敏剂可在照射之前与细胞接触。光照射可在所述光敏剂的给药之后的任何时间进行。通常地，所述药物分子和光敏剂可在照射前I至72小时、优选4至48小时，例如在照射之前4至24小时同时或分别施用。然而，照射可在所述药物分子被吸收至与所述光敏剂相同的细胞内腔室中之前进行(见WO 02/44396，其中更详细地公开了如何实现这一点)，例如通过在所述药物分子给药之前照射，例如通过在照射后5分钟至24小时，例如30分钟至2小时加入所述药物分子。在一些情况下，所述药物分子可以与所述光敏剂同时给药。因此本发明的另一方面提供药物组合物，其包含本文所述的两亲性光敏剂的药学上可接受的盐，以及治疗剂。还可存在药学上可接受的载体或赋形剂。或者，并且更典型地，所述光敏剂可在所述药物分子给药前给药。本发明的另一方面提供药物组合物，其包含本文所述的两亲性光敏剂的药学上可接受的盐以及治疗剂，所述组合物用于疗法中，例如用于癌症、基因或寡聚核苷酸(例如siRNA)的疗法中。本发明的另一方面提供本文所述的两亲性光敏剂的药学上可接受的盐和/或治疗剂在制备用于疗法中的药物中的用途，例如用于癌症、基因或寡聚核苷酸(例如siRNA)疗法，其中所述光敏剂的盐和所述治疗剂与患者的细胞或组织(分别地、同时地或依次地)接触，并用有效激活所述光敏剂的波长的光照射所述细胞或组织。包括所述方法的治疗方法构成本发明的另一方面。本文所述的光敏剂可用于将任何药物分子运输或转染至体内活细胞的胞质中。其不仅用于将分子(或其部分或碎片)转移入细胞内部，在一些情况下也用于将其呈递或表达于细胞表面。因此，在将药物分子运输和释放入细胞胞质后，若所述细胞是特异化细胞(例如抗原呈递细胞)，那么所述分子或碎片可被运输至细胞表面，在细胞表面其可呈递于细胞外部(即细胞表面上)。所述方法在疫苗接种的领域尤为实用，其中可以向细胞内引入疫苗组分(即抗原或免疫原)，用于呈递在该细胞的表面上，以诱导、促进或增加免疫应答。WO 00/54802描述了关于能够在细胞表面上表达分子的实用性的进一步细节。可以利用本发明光敏剂而引入到细胞质内的转移分子包括不易穿透细胞膜的分子。另外，本文所述的试剂能够增加仅能部分穿透细胞膜或细胞内小囊泡膜的分子的胞质的释放和活性。药物分子可以是有机化合物、蛋白或蛋白片段，例如肽、抗体或抗原或者它们的片段。另一类可以利用本发明试剂引入的药物是细胞毒性药物，例如蛋白毒素或细胞毒性有机化合物。利用本文所述的方法，能够将可能具有临床癌症治疗价值但是受胞质摄取低或者没有摄取而限制的分子引入到胞质内，并且靶向特定细胞。白树毒素是所述分子的一个实例。可与本文所述光敏剂结合使用的细胞毒性药物的另一实例是博来霉素。通过本文所述的方法可治疗的具体形式的癌症包括头颈癌(例如鳞状细胞癌)、骨肉瘤和皮肤转移癌(尤其是源于乳腺癌)。根据药物分子的性质，本文所述的方法可以用于治疗多种病症，例如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化与其它心血管疾病、病毒与其它感染、牛皮癖、日光性角化病、伤口愈合、骨折愈合、疣和遗传性病症，例如囊性纤维变性、戈林氏综合征和运动失调性毛细血管扩张症。另一类合适的药物分子是核酸。可以使用核酸的基因形式，例如编码治疗性蛋白、反义RNA分子、核酶、RNA适体、短发夹RNA(shRNA)、微RNA或构成寡核苷酸的三链体。或者，可以采用非编码分子形式的核酸，例如合成的DNA或RNA反义分子、核酶、短发夹RNA、微RNA、适体、构成寡核苷酸的三链体、肽核酸(PNA)、转录因子“dec0y”DNA或嵌合寡核苷酸，用于修复患者的特异性突变。在适当时核酸分子可以是全基因或核酸片段的形式，可任选地掺入到载体分子中，例如质粒或病毒载体。后者的形式在转移分子用在基因疗法中时具有特别的应用性，其中基因被治疗性地转移至患者细胞。这可以用于治疗很多疾病，例如癌症、心血管疾病、病毒感染和单基因病症，例如囊性纤维变性。
任选地，可以将待引入细胞的光敏剂和药物分子之一或二者的药学上可接受的盐连接于或缔合于或共轭于载体分子、祀向分子或载体，这能够促进或增加光敏剂或药物分子的摄取或者能够靶向或释放这些实体至特定的细胞类型、组织或细胞内腔室。载体系统的实例包括聚赖氨酸、壳聚糖、聚乙烯亚胺或其它聚阳离子、硫酸葡聚糖、不同的阳离子型脂质、脂质体、再生的LDL-粒子或空间稳定化的脂质体。这些载体系统一般能够改善药物分子和/或光敏剂的药动学并增加其细胞摄取，还可以定向药物分子和/或光敏剂于细胞内腔室，这尤其有益于获得光化学内在化，但是它们一般不具有定向药物分子和/或光敏剂于特定细胞(例如癌症细胞)或组织的能力。不过，为了实现这类特异性或选择性靶向载体分子，可以将药物分子和/或光敏剂缔合于、键合于或共轭于特异性靶向分子，这将促进药物分子向所需细胞或组织内的特异性 细胞摄取。这类靶向分子还可以定向将分子转移至细胞内腔室，这尤其有益于获得光化学内在化。可以采用很多不同的祀向分子,例如Curiel, D. T. (1999), Ann. New York Acad.Sci.886,158-171 ；Bilbao, G.等人(1998), Gene Therapy of Cancer(Walden 等人编辑，Plenum Press, New York), Peng K. ff. and Russell S. J. (1999), Curr. Opin.Biotechnol. 10,454-457, Wickham T. J. (2000)，Gene Ther. 7，110-114 所述。可以将载体分子和/或靶向分子缔合于、键合于或共轭于药物分子、光敏剂或这二者，并且可以使用相同或不同的载体或靶向分子。这类靶向分子或载体还可以用于使药物分子定向于特定的细胞内腔室，这尤其有益于应用PCI，例如溶酶体或核内体。按照本领域公知的技术，可以利用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂按常规方式配制本发明的组合物。可以根据给药的选择与所需途径、治疗目的等按常规方式选择组合物与载体或赋形剂物质的性质、剂量等。剂量同样可以按常规方式加以确定，并且可以依赖于所述药物分子的性质、治疗的目的、患者的年龄、给药的方式等。组合物通常可以局部或全身给药。局部给药的组合物包括凝胶剂、霜剂、软膏剂、喷雾剂、洗剂、阴道栓剂、气雾剂、滴剂、溶液剂和本领域任一其它常规的药物剂型。对不可接近部位的局部给药可以借助本领域已知的技术加以实现，例如利用导管或其它适当的药物递送系统。优选地，所述组合物可以以适合于肠胃外给药的形式提供，例如皮内、皮下、腹膜内或静脉内注射，或输注。因而替代性的药物形式包括包含所述光敏剂的盐以及任选地包含一种或多种惰性常规载体和/或稀释剂的混悬液和溶液。肠胃外给药制剂可以以水性或非水性、等渗、无菌注射溶液或混悬液的形式存在。这些溶液可使用一种或多种载体或赋形剂从无菌粉末或颗粒制备，所述载体或赋形剂例如合适的分散剂、湿润剂或混悬剂。用于制备注射用溶液的合适的载体包括水、盐水和葡萄糖。可使用其它可用于肠胃外途径的无毒稀释剂或溶剂，包括氨基酸溶液，例如Glavamin (Fresenius Kabi);碳水化合物溶液，例如Glucos (Braun);电解质，例如氯化钠溶液、林格氏溶液、氨丁三醇溶液，或任意前述溶液的混合物。取决于若干个因素，光敏剂和药物的总剂量、浓度和给药体积可在很大范围内变化。主要因素为适应症(疾病的性质)、疾病的阶段、器官系统以及光敏剂和药物的选择。
如上所述化合物在组合物中的浓度取决于化合物的既定用途、组合物的性质、给药的方式、待治疗的病症和患者，可以根据选择加以改变或调整。就在PCI中的用途而言，重要的是光敏剂的浓度，其可使得一旦被细胞摄取(例如进入或者缔合于一个或多个细胞内腔室)并且被照射激活，则一个或多个细胞结构被破坏(例如一个或多个细胞内腔室被溶解或破坏)。例如，可以按O. 5至100mg/ml的浓度使用光敏剂。就人体内治疗而言，当全身给药时可以在O. 05-20mg/kg体重的范围内使用光敏剂，或者用于局部用药时使用O. 1-20%的溶液。用光敏剂培育细胞的时间(也就是“接触”时间)可以从几分钟至若干小时不等，例如甚至长达48小时或更长。培育时间应当使得光敏剂被合适的细胞摄取。用光敏剂培育细胞之后，可以任选地用无光敏剂培养基培育一段时间，然后使细胞暴露于光和/或药物分子。确定本发明用的药物分子的合适剂量对本领域的普通技术人员来说是常规操作。若药物分子是蛋白或肽，一般使用剂量小于5mg/kg (例如O. l-5mg/kg)的药物分子。若药物分子是核酸，每次将大约1(Γ6至Ig的核酸注射于人。在本文所述化合物或组合物的给药之后，使所治疗的区域暴露于光，以达到所需效果。激活光敏剂的光照射步骤可以按照本领域公知的技术和操作加以进行。能够提供所需波长和光强度的合适光源是本领域熟知的。在本发明的方法中肌体表面或细胞暴露于光的时间可以各不相同。例如，药物分子内化至胞质内的效率似乎随着暴露于光的时间增加而增加。一般而言，照射步骤的时间长度为几分钟至若干小时，例如优选至多60分钟，例如I至30分钟，例如O. 5至3分钟或I至5分钟，或者I至10分钟，例如3至7分钟，优选大约3分钟，例如2. 5至3. 5分钟。合适的光剂量可以由本领域的普通技术人员加以选择，将取决于蓄积在靶细胞或组织中的光敏剂的量。照射一般将按40至200焦耳/cm2的剂量水平施用，例如100焦耳/cm2，能流范围小于200mW/cm2。在本文所述方法中，用波长在500至750nm,例如550至700nm范围内的光照射特别适合于体内使用。肌体不同部位的照射方法是本领域熟知的，例如用灯或激光(例如参见Van denBergh, Chemistry in Britain, May 1986 p. 430-439)。就不可接近的区域而言，利用光导纤维易于实现。对于一些用途，可需要多种装置(例如导管)用于将光传送至感兴趣的部位。现通过以下非限制性实施例来详述本发明实施例I-间-四苯基卟啉二磺酸双(单乙醇胺)盐((MEA)2-TPPS2a)的制备将从游离酸制备的间-四苯基卟啉二磺酸双(三乙胺)盐溶解于甲醇，并加入过量的乙醇胺。将所述溶液搅拌15分钟，然后用旋转蒸发仪在30°C在真空中除去所述溶剂。再重复该操作两次。实施例2-间-四苯基卟啉二磺酸双(葡甲胺)盐((Megl)2-TPPS2a)的制备在室温将间-四苯基卩卜啉二磺酸盐(200mg,0. 26mmol)加至N-甲基_D_葡萄糖胺(102mg,0. 52mmol)在去离子水(5ml)中的溶液中。搅拌所述混合物15分钟,并将所述混合物冻干过夜。标题化合物为深红色固体物质。产量310mg(100% )。实施例3-间-四苯基卟啉二磺酸双(三(羟基甲基)甲胺)盐((TRIS)2-TPPS2a)的制备在室温将间-四苯基卩卜啉二磺酸盐(200mg, O. 26mmol)加至三(轻基甲基)甲胺(63mg,0. 52mmol)在去离子水(5ml)中的溶液中。搅拌所述混合物15分钟,并将所述混合物冻干过夜。标题化合物为深红色固体物质。产量260mg(100% )。实施例4-间-四苯基卟啉二磺酸双(二乙醇胺)盐((DEA)2-TPPS2a)的制备
在室温将间-四苯基卩卜啉二磺酸盐(100mg,0. 13mmol)加至二乙醇胺(27mg,O. 26mmol)在去离子水(5ml)中的溶液中。搅拌所述混合物15分钟,并将所述混合物冻干过夜。标题化合物为深红色固体物质。产量103mg(80% )。实施例5-间-四苯基卟啉二磺酸双(1-(2_羟基乙基)吡咯烷)盐((HEP)2-TPPS2a)的制备在室温将间-四苯基卩卜啉二磺酸盐(100mg,0. 13mmol)加至I-(2-轻基乙基)批咯烧(30mg,0. 26mmol)在去离子水(5ml)中的溶液中。搅拌所述混合物15分钟,并将所述混合物冻干过夜。标题化合物为深红色固体物质。产量117mg(90% )。实施例6-间-四苯基卟啉二磺酸双(三乙醇胺)盐((TEA)2-TPPS2a)的制备在室温将间-四苯基卩卜啉二磺酸盐(100mg,0. 13mmol)加至三乙醇胺(39mg,O. 26mmol)在去离子水(5ml)中的溶液中。搅拌所述混合物15分钟,并将所述混合物冻干过夜。标题化合物为深红色固体物质。产量106mg(79% )。 实施例7-间-四苯基二氢卟酚二磺酸双(单乙醇胺)盐((MEA)2-TPCS2a)的制备将从游离酸制备的间-四苯基卟啉二磺酸盐双(三乙胺)溶解于甲醇中，并加入过量的乙醇胺。将所述溶液搅拌15分钟，然后用旋转蒸发仪在30°C在真空中除去所述溶齐U。再重复该操作两次。实施例8-间-四苯基二氢卟酚二磺酸双(葡甲胺)盐((Megl)2-TPCS2a)的制备在室温将间-四苯基二氢B卜酹二磺酸盐(100mg,0. 13mmol)加至N-甲基_D_葡萄糖胺(51mg,0. 26mmol)在去离子水(5ml)中的溶液中。搅拌所述混合物15分钟,并将所述混合物冻干过夜。标题化合物为深红色固体物质。产量157mg(100% )。实施例9-间-四苯基二氢卟酚二磺酸双(三(羟基甲基)甲胺)盐((TRIS)2-TPCS2a)的制备在室温将间-四苯基二氢卩卜酹二磺酸盐(100mg,0. 13mmol)加至三(轻基甲基)甲胺(31mg,0. 26mmol)在去离子水(5ml)中的溶液中。搅拌所述混合物15分钟,并将所述混合物冻干过夜。标题化合物为深红色固体物质。产量157mg(100% )。实施例10-间-四苯基卟啉二磺酸盐(TPPS2a)的溶解度在试管中向实施例I至6所述的各种盐(大约50mg)中加入一份O. 2ml的水。振
摇所述混合物，直到固体颗粒破碎并溶解。
实施例编号化合物最低水溶性
1(MEA)2-TPPS2a42.3 mg/ml
2(Megl)2-TPPS2a89.7 mg/ml
3(TRIS)2-TPPS2a49.9 mg/ml
4(DEA)2-TPPS2a31.4 mg/ml
5(HEP)2-TPPS2a28.3 mg/ml
6(TEA)2-TPPS2a32.1 mg/mlTPPS2a盐的高浓缩溶液是粘稠的。
实施例11-间-四苯基二氢卟酚二磺酸盐(TPCS2a)的溶解度在试管中向实施例7至9所述的各种盐(大约50mg)中加入一份O. 2ml的水。振
摇所述混合物，直到固体颗粒破碎并溶解。
实施例编号化合物最低水溶性
7(MEA)2-TPCS2a 34.9 mg/ml 8(Megl)2-TPCS2a 38.9 mg/ml
9(TRIS)2-TPCS2a 32.1 mg/mlTPPS2a盐的高浓缩溶液是粘稠的。实施例12-间-四苯基卟啉二磺酸盐(TPPS2a)的稳定性TPPS2a盐的水溶液(大约I重量％)在40°C保持31天。所述溶液用HPLC(HPllOO)分析。HPLC条件如下柱AgilentExtend C-18流动相85%甲醇，15%水流速1·Oml/ 分钟检测器UV检测器,415nm
实施例编号化合物降解
1(MEA)2-TPPS2a 无降解
2(Megl)2-TPPS2a 无降解
3(TRIS)2-TPPS2a 无降解
4(DEA)2-TPPS2a 无降解
5(HEP)2-TPPS2a 无降解
6(TEA)2-TPPS2a 无降解结论所有样品在40°C可稳定保持31天。实施例13-间-四苯基二氢卟酚二磺酸盐(TPCS2a)的稳定性TPPS2a盐的水溶液(大约I重量％)在40°C保持31天。所述溶液用HPLC(HPllOO)
根据实施例12所用的方法分析。
实施例编号化合物降解
7(MEA)2-TPCS2a无降解
8(Megl)2-TPCS2a无降解
9(TRIS)2-TPCS2a无降解结论所有样品在40°C可稳定保持31天。实施例14-用于口服给药的包含(MEA)2-TPPS2a的胶囊使用研钵和研棒，将从实施例I得到的(MEA) 2-TPPS2a (30mg)与乳糖一水合物O. 15mm(900mg) (Apotekproduksjon AS, Oslo, Norway)以体积不变方式(volumetrically)混合。将所述粉末填充入000号硬胶囊(Apotekproduksjon AS, Oslo, Norway)中。实施例15-无表面活性剂的(TRIS)2-TPCS2a的等渗无菌溶液通过使用混合机(3M ESP CapMix)混合2分钟，将从实施例9得到的(TRIS)2-TPCS2a(30mg)溶解于盐水(O. 9%氯化钠)(I. Oml)中。该棕色溶液中不含颗粒(经显微镜检查)。实施例16-包含(TRIS)2-TPCS2a和溶剂的试剂盒
制备包含两个小瓶的试剂盒小瓶A的组分从实施例9得到的(TRIS)2-TPCS2a(20mg)，其为小瓶(IOOml)中的干燥粉末小瓶B的组分包含以下的水溶液(52ml)
氯化納120 mM
嶙酸二氢钾 4.3 mM嶙酸氢二钾 4.3 mMHCl/NaOH适量，添加至pH 6.0
注射用水适量将小瓶B中的溶液加入小瓶A中，并且用手振摇小瓶A共3分钟。使用前，所述溶液应当不含可见的颗粒。实施例17-用于在皮肤和粘膜上给药的含(TRIS)2-TPCS2a的局部制剂使用研钵和研棒，将从实施例9得到的(TRIS) 2-TPCS2a(20mg)与Unguentum Merck以体积不变方式混合。每ml该棕色霜剂包含4mg的(TRIS)2-TPCS2a，将其填充于玻璃小瓶中。实施例18-用于肠胃外或肠内给药的包含(TRIS)2-TPCS2a的乳剂制剂通过使用混合机(3M ESP CapMix)混合2分钟，将从实施例9得到的(TRIS)2-TPCS2a(24mg)溶解于脂质乳剂(ClinOleic 200mg/ml (20% )，来自 Baxter)中。该棕色乳剂中不含(TRIS)2-TPCS2a颗粒(经显微镜检查)。实施例19-包含四苯基二氢卟酚二磺酸双(单乙醇胺)盐((MEA)2-TPCS2a)与克列莫佛(Cremophor)的制剂根据以下操作，在10%克列莫佛ELP水溶液中将从实施例7得到的(MEA)2-TPCS2a进行配制，使其浓度为30或60mg/ml -在容器中称量(MEA)2-TPCS2a ；-将克列莫佛ELP加热至60_70°C；-在搅拌条件下将加热的克列莫佛加入(MEA)2-TPCS2a中；-在60_70°C搅拌所述溶液大约5分钟，并缓慢加入预加热的(60_70°C)无菌水，直到克列莫佛的浓度为10%。将所述溶液在整个操作中保持在60-70°C ;和-然后将所述溶液高压灭菌。所述30mg/ml制剂可用于静脉给药,例如起始剂量为0. 25mg/kg体重。
实施例20-包含四苯基二氢卟酚二磺酸双(单乙醇胺)盐((MEA)2-TPCS2a)的吐温80的制剂根据以下操作在3 %吐温80中将(MEA) 2_TPCS2a进行配制-称量(MEA)2TPCS2a并置于瓶中；-将50mM的Tris缓冲液(pH8. 5)加入该瓶中，并搅拌所述溶液(500_700rpm)共10分钟；-加入吐温80，并搅拌所述溶液(500-700rpm)共10分钟。所述制剂中吐温80的最终浓度为3% ；-加入甘露醇，并搅拌所述溶液(500_700rpm)共20小时。所述制剂中甘露醇的最 终浓度为2.8% ;-用O.22 μ m滤器过滤该30mg/ml的(MEA) 2_TPCS2a制剂，以除去颗粒；-将所述制剂填充入带有塞子和盖子的小瓶中；-然后在121°C将所述制剂高压灭菌20分钟。所述制剂应当在2_8°C避光保存。实施例21-癌症患者的I/II期临床试验在I/II期临床试验中，向癌症患者给药所述光敏剂TPCS2a(30mg/ml的二乙醇胺盐((MEA)2-TPCS2a)在10%克列莫佛ELP中的水性制剂(见实施例19)。向三组中的11名患者分别给药O. 25,0.5和I. Omg的TPCS2a/kg体重，给药4天，然后对确定的靶肿瘤进行光照(652nm波长，60J/cm2)。另外，在光照前3小时，向所述患者静脉注射给予细胞毒性剂博来霉素(每平方米体表面积15000IU)。缓慢地以静脉注射方式给药所述TPCS2a制剂，患者没有出现疼痛或其它与给药相关的不良反应；这与其它光敏剂(例如替莫泊芬)的非水性制剂的给药不同，后者的给药可伴随剧烈疼痛。在光敏剂注射之后，所述水性制剂也使得用盐水清洗注射针头和静脉成为可能，从而在注射位点或其附近消除了不利的光敏作用；而在使用不可能进行所述清洗的非水性光敏剂制剂的情况下，这种不利的光敏作用是经常观察到的。患者人群包括头颈癌(鳞状细胞癌)、骨肉瘤和乳腺癌皮肤转移的患者。治疗数周后，所有患者中都诱导了靶肿瘤的完全临床消退，这表明TPCS2a-介导的博来霉素光化学内在化构成了对涵盖若干不同肿瘤种类的实体瘤的有效治疗。实施例22-用于口服给药的包含(MEA)2-TPPS2a的片剂组合物
(MEA)2-TPPS2aIOOmg
微晶纤维素800 mg
交联羧曱基纤维素钠(AcDiSol) 30 mg
硬脂酸镇30 mg将所有成分混合。压制成片剂(片剂直径13_ ;片剂重量960mg)。
权利要求
1.两亲性光敏剂的药学上可接受的盐，其用于光化学内在化方法，其中所述盐具有至少O. 5mg/ml的水溶性。
2.两亲性光敏剂的药学上可接受的盐，其具有至少O.5mg/ml的水溶性，所述盐用于制备在光化学内在化方法中使用的治疗剂。
3.权利要求I或权利要求2的盐，其由药学上可接受的碱形成，优选由有机胺(例如氨基醇)形成。
4.权利要求3的盐，其中所述氨基醇为低级脂肪氨基醇，例如选自单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺和2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1，3- 二醇；环状氨基醇，例如选自4-(2-羟基乙基)-吗啉和I-(2-羟基乙基)-吡咯烷；或氨基糖，例如选自葡萄糖胺和N-甲基葡萄糖胺(葡甲胺)。
5.权利要求I或权利要求2的盐，其由药学上可接受的酸形成，优选由磺酸或磺酸衍生物形成。
6.权利要求I至5中任一项的盐，其中所述光敏剂选自酞菁，例如二磺化的酞菁铝(尤其是邻位磺化的二磺化的酞菁铝)；磺化的四苯基卟啉(TPPSn，例如TPPS2a和TPPS1)；二氢卟酚和二氢卟酚衍生物，包括细菌二氢卟酚和二氢卟酚酮；以及天然和合成的卟啉，包括血卟啉和苯并卟啉。
7.权利要求6的盐，其中所述光敏剂为TPCS2a、TPPS2a,AlPcS2a或卟菲尔钠(Photofrin )。
8.权利要求I的盐，其选自 TPCS2a 二乙醇胺盐 TPCS2a乙醇胺盐 TPCS2a N-甲基-葡萄糖胺盐 TPCS2a三乙醇胺盐 TPCS2a I-(2-羟基甲基)-吡咯烷盐 TPCS2a 2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-I，3-二醇盐 TPPS2a 二乙醇胺盐 TPPS2a乙醇胺盐 TPPS2a N-甲基-葡萄糖胺盐 TPPS2a三乙醇胺盐 TPPS2a I-(2-羟基甲基)-吡咯烷盐 TPPS2a 2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-I，3-二醇盐 卟菲尔钠二乙醇胺盐 卟菲尔钠乙醇胺盐 卟菲尔钠N-甲基-葡萄糖胺盐 卟菲尔钠三乙醇胺盐 卟菲尔钠I-(2-羟基甲基)-吡咯烷盐 口卜菲尔纳2_氛基-2_(轻基甲基)丙烧-I, 3- 二醇盐。
9.权利要求8所限定的盐。
10.药物组合物，其包含权利要求9的盐，以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
11.产品，其包含权利要求I至8中任一项所限定的两亲性光敏剂的药学上可接受的盐以及治疗剂，以同时、分别或依次地用于光化学内在化方法中。
12.用于光化学内在化方法的试剂盒，其包含 (a)第一容器，其包含权利要求I至8中任一项所限定的两亲性光敏剂的药学上可接受的盐； (b)第二容器，其包含治疗剂；和 (C)当所述盐为固体形式时，第三容器，其包含用于在使用前溶解所述盐的水溶液。
13.药物组合物，其包含权利要求I至8中任一项所限定的两亲性光敏剂的药学上可接受的盐，以及治疗剂。
14.药物组合物，其包含权利要求I至8中任一项所限定的两亲性光敏剂的药学上可接受的盐以及治疗剂，所述组合物用于疗法中，例如用于癌症、基因或寡聚核苷酸(例如siRNA)的疗法中。
15.权利要求I至8中任一项所限定的两亲性光敏剂的药学上可接受的盐和/或治疗剂在制备用于疗法的药物中的用途，例如用于癌症、基因或寡聚核苷酸(例如siRNA)疗法，其中所述光敏剂的盐和所述治疗剂与患者的细胞或组织(分别地、同时地或依次地)接触，并用有效激活所述光敏剂的波长的光照射所述细胞或组织。
16.将药物分子引至患者细胞的胞质中的方法，所述方法包括以下步骤 (a)将所述细胞与权利要求I至8中任一项所限定的两亲性光敏剂的药学上可接受的盐接触； (b)将所述细胞与所述药物分子接触；和 (c)用有效激活所述光敏剂的波长的光照射所述细胞。
全文摘要
本发明涉及两亲性光敏剂的药学上可接受的盐，其具有至少0.5mg/ml的水溶性；涉及其在光化学内在化方法中的用途。所述盐可由药学上可接受的碱形成，所述碱例如有机胺，例如氨基醇；或由药学上可接受的酸形成，所述酸例如磺酸或磺酸衍生物。由于水溶性增加，所述盐尤其适用于制备肠胃外药物制剂，例如用作注射用溶液或输注用溶液。
文档编号A61K9/00GK102648004SQ201080046459
公开日2012年8月22日 申请日期2010年8月16日 优先权日2009年8月14日
发明者A.霍格西特, J.克拉维内斯 申请人:Pci生物技术公司