专利名称：乙脑ev71联合疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种联合疫苗及其制备方法，特别是涉及一种预防性乙脑EV71联合疫苗及其制备方法。
背景技术：
乙脑病毒主要在亚洲地区流行，全球约有30亿人居住在流行区，中国、印度及东南亚都是乙脑病毒广泛流行区域。这些地区每年新生儿数约3000万，全球每年估计有 50，000例感染并有10，000人死亡。目前随着世界流动性人口的增多，乙脑病毒的流行区域扩大至澳洲区域，且每年到疫区旅游人员的发病率增加。乙脑是蚊虫叮咬传播的病毒性人畜共患病，病人发病急，常累及中枢神经系统，症状轻重不一，呈隐性感染、轻症脑膜炎或病情严重的重症脑炎，甚至死亡，重型病例幸存者常留有明显的后遗症，虽通过加强公共卫生和个人防护可以减少乙脑的发病率，但有效的疫苗预防才是根本之路。在我国，乙脑疫苗现已纳入国家计划内免疫，尽管经过多年的预防控制，流行性乙型脑炎仍是严重困扰儿童群体的急性传染病之一，每年5000例以上的发病人数中，10岁以下的儿童比例高达75%，病死率为5% 35%，智力致残率5% 20%。乙脑疫苗的研究经历漫长过程，已更新换代升级多种产品，到目前主要有一下几种疫苗1.鼠脑灭活疫苗20世纪30年代日本和俄罗斯就开始使用鼠脑灭活疫苗，鼠脑疫苗有一定的免疫效果，但这种疫苗含有大量鼠脑异性蛋白，可引起严重变态反应。1943年美国Sabin公司亦用鼠脑制备灭活疫苗，曾在美国军队中使用，但未达到满意效果。1%4年日本学者开发出JEV Nakayama株鼠脑纯化灭活疫苗，1989年改用北京-1株。疫苗生产以鼠脑增殖病毒，经超滤浓缩，鱼精蛋白硫酸盐处理及蔗糖密度梯度离心纯化，最后经甲醛灭活而得。现在除日本外一些亚洲国家如印度、泰国、韩国、越南也小量生产这种疫苗。目前，该疫苗已停止生产销售。2.原代地鼠肾细胞灭活疫苗我国自1968年开始生产地鼠肾细胞灭活疫苗，毒种为P3株乙脑病毒。经小鼠脑内传代后制成病毒悬液，接种原代地鼠肾单层细胞，收获病毒经甲醛灭活后加硫柳汞制成疫苗。后在此疫苗的基础上增加了纯化工艺制备出原代地鼠肾细胞纯化乙脑疫苗。3.乙脑减毒活疫苗我国俞永新等经过多年的研究，筛选出具有良好免疫原性的减毒株SA14-14-2，并开发成功拥有自主知识产权的原代地鼠肾细胞培养的乙脑减毒活疫苗。从1988年开始生产疫苗，已累计使用2亿多人次，与原代地鼠肾细胞乙脑灭活疫苗相比，抗体阳转率较高，接种针次少，副反应明显降低。目前，该疫苗是我国广泛使用的乙脑疫苗之一，也已出口韩国、尼泊尔等国家。4.基因工程疫苗现用的全病毒疫苗均含有病毒基因组，难以达到100%的安全， 因此基因工程疫苗将为人们所关注。主要研究的疫苗类型包括痘病毒载体重组疫苗、嵌合减毒活疫苗、病毒样颗粒、基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗。
5. Vero细胞乙脑灭活疫苗鉴于鼠源性疫苗的外源因子的污染不可控性，目前有不少国家和公司尝试用Vero细胞来制备新一代乙脑灭活疫苗。WHO已批准Vero细胞用作灭活疫苗生产的细胞基质，生产新型乙脑灭活疫苗。我国北京天坛生物制品有限公司开发出了 P3株Vero灭活疫苗并已上市供应。另外，日本Biken公司用北京-1株制备的Vero 细胞灭活疫苗，经小鼠实验，可对乙脑北京-1株的致死性攻击产生保护，中和抗体水平比鼠源性疫苗高2 3倍，正在进行临床试验和大规模生产。此外国内还有辽宁成大和昆明医学生物研究所做生物反应器培养Vero细胞制备乙脑灭活疫苗的文献报道，日本Hiroko Toriniwa等也有用无血清培养基大规模培养Vero 细胞制备纯化乙型脑炎灭活疫苗的文献报道。手足口病是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV71)最为常见。近年来手足口病呈逐年上升趋势， 2008年我国(不含港澳台地区)共报告手足口病例约48. 9万例，其中重症病例1165例，死亡病例1 例，病死率为0.沈％。。全国31个省份均有病例报告，报告病例以5岁及以下儿童为主(占91.27% )。2009年我国累计报告手足口病例108万，发病率81. 66/10万，涉及2765个区县，死亡339例，位列丙类传染病第二位。由于目前对手足口病尚无特效的治疗药物，因此，疫苗成为了最有效的预防措施。中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所对从阜阳分离到的9株肠道病毒EV71 中的8株已完成全基因序列(7409个)核苷酸测定、分析和比对，结果表明从阜阳分离的8 株病毒与深圳、上海、重庆、山东分离的4株病毒比较，同源性很高，未发现重症和轻症手足口病例的EV71病毒基因神经毒力位点变异。EV71病毒没有发生变异给疫苗制造带来了契机。从发表的文献看，目前在研究开发中的EV71疫苗主要有灭活疫苗、DNA疫苗、亚单位疫
田ο曾有EV71福尔马林灭活疫苗成功地控制EV71在保加利亚传播的报道，但未见再次使用此类疫苗的报道。Cheng-Nan ■等曾用三种EV71疫苗(福尔马林灭活疫苗、 VP1DNA疫苗和VP1原核表达亚单位疫苗)对实验母鼠进行免疫接种，比较了新生小鼠对野生型EV71产生的免疫保护效果。结果表明，三种疫苗都有一定的免疫保护效果，其中，福尔马林灭活疫苗的免疫保护效果最好，除了产生大量的IgG外，还产生T辅助细胞参与的免疫反应，对新生小鼠的保护率为80% (免疫剂量为IOug/母鼠，攻毒剂量为2300LD5(1/新生鼠)，而VP1DNA疫苗和VP1亚单位疫苗的免疫保护率分别为40% (免疫剂量为IOOug/母鼠，攻毒剂量为230LD50/新生鼠)和80% (免疫剂量为IOug/母鼠，攻毒剂量为230LD50/ 新生鼠)。三种疫苗通过脾细胞激发产生的细胞因子也不同，如灭活疫苗主要产生高水平的 IL-4。VP1DNA疫苗产生高水平的IFN- γ和IL 一 12，而VP1亚单位疫苗产生高水平的IL-IO 和IFN-γ。Suh-Chin mi等人用微载体技术培养病毒，制备EV71灭活疫苗，选择比较Vero、 MRC-5和WI-38三种细胞介质，发现Vero培养的病毒滴度最高，高达5. 8 X 107TCID50/ml。联合疫苗即可简化接种程序，又可节省人力、物力和减少免疫接种者的痛苦、减少接种次数和不良反应，乙脑EV71联合疫苗目前尚无报道，因此我们研制了乙脑EV71的新型联合疫苗，以便减少免疫接种者(主要是婴幼儿)的痛苦，增加其依从性。同时，使用更加安全有效、成本低廉的原料制备这种联合疫苗已达到更好效果。
发明内容
本发明提供一种联合联合疫苗，该疫苗可以减少疫苗接种次数而达到同时预防乙型脑炎和EV71所致手足口病的目的。本发明使用的乙脑疫苗是经细胞培养、病毒培养、病毒灭活、纯化抗原等工序制备后，加入保护剂配制而成的疫苗。本发明使用的EV71疫苗经细胞培养、病毒培养、纯化、病毒灭活等工序制备后，加入保护剂配制而成的疫苗。本发明的联合疫苗含有乙脑疫苗和EV71疫苗，其中乙脑疫苗、EV71疫苗的重量比为1 1 1 10。该疫苗0.5ml/支，含乙脑抗原2 4微克，EV71抗原3 9微克。基础免疫应注射三针，于6月龄、8月龄、10月龄各注射一针。本发明的联合疫苗其中乙脑疫苗、EV71疫苗可以按照现有技术制备，也可按照以下方法制备。本发明的制备方法，包括以下步骤1.乙脑疫苗的制备方法1. IVero细胞复苏、扩增至生物反应器，微载体培养；
1.2高密度细胞接种乙脑病毒毒种；1. 3连续灌流收获病毒液；1. 4病毒收获液澄清、超滤浓缩；1.5β-丙内酯或者甲醛灭活病毒；1.6硫酸鱼精蛋白沉淀、蔗糖密度梯度区带离心、超滤脱糖纯化制备乙脑病毒抗原；1.7乙脑病毒抗原加人血白蛋白和(或)海藻糖、右旋糖酐制成原液；以上方法中Vero细胞来源于ATCC ；乙脑病毒为Ρ3株，来源于中国药品生物制品检定所，并且建立了细胞库、毒种库三级管理，按现行中国药典检定合格。乙脑疫苗制备首先进行Vero细胞的复苏、传代扩增，微载体生物反应器培养制备高密度细胞，Vero细胞扩增阶段培养液可以是含有2 10%小牛血清或者胎牛血清的DMEM、199或者MEM培养基。 细胞在微载体上生长至单层后，按Μ0Ι0. 001 0. 1接种乙脑病毒P3株，灌流培养收获病毒液。将同批次收获的病毒液经澄清过滤后，按30 60倍超滤浓缩，按1 2000 1 4000 比例加入β-丙内酯或者甲醛灭活制备成病毒灭活液。向病毒灭活液中加入终浓度0.5 2. Omg/ml硫酸鱼精蛋白吸附沉淀Vero细胞残余DNA，再经蔗糖密度梯度区带离心纯化乙脑抗原，超离梯度液为30% 60% (W/W)的蔗糖溶液，转速20000 30000rpm，离心2 10 小时。超离纯化液经超滤脱糖，加入血白蛋白和(或)海藻糖、右旋糖酐制成制备成原液。2.EV71疫苗的制备方法2. IVero细胞或二倍体细胞的复苏、扩增；2. 2单层细胞接种EV71毒种；2. 3收获病毒液；2. 4澄清、超滤浓缩病毒液2. 5病毒采用阴离子交换DEAE sepharose FF和分子筛s印harose 6FF结合的方法纯化得EV71抗原；2. 6病毒灭活2. 7EV71抗原加人血白蛋白和(或)海藻糖、右旋糖酐制成原液；以上方法中Vero细胞和MRC-5细胞来源于ATCC ；EV71病毒分离白手足口病患者咽拭子样本。EV71疫苗制备首先进行Vero细胞或二倍体细胞的复苏、传代扩增于细胞工厂，二倍体细胞扩增阶段培养液可以是含有2 10%小牛血清或者胎牛血清的DMEM、199 或者MEM培养基。细胞单层后，按Μ0Ι0. 01 1.0接种EV71毒种，48 84小时后CPE达到“+++”时收获病毒液，可反复冻融2 4次收集细胞内病毒。将同批次收获的病毒液按 30 60倍超滤浓缩，病毒浓缩液采用阴离子交换DEAE sepharoseFF和分子筛s印harose 6FF结合的方法纯化得EV71病毒；EV71病毒按1 2000 1 4000比例加入β -丙内酯或者甲醛灭活制备成灭活液。原液加入血白蛋白和(或)海藻糖、右旋糖酐制成原液。联合疫苗配制混合方法按重量比1 1 1 10配制，为乙脑EV71联合疫苗。 联合疫苗是由含人血白蛋白和(或)海藻糖、右旋糖酐制等稳定剂乙脑原液和EV71原液混合而成，联合疫苗中人血白蛋白和(或)海藻糖、右旋糖酐的含量为 10%。该疫苗 0. 5ml/支，含乙脑抗原2 4微克，EV71抗原3 9微克。基础免疫程序三剂，新生儿于 6月、8月、10月，各注射一剂。实施例1生物反应器灌流培养、收获乙脑病毒取经15L瓶或细胞工厂培养的已长至单层的Vero细胞，胰蛋白酶消化成单个细胞后，细胞计数，按3X IO5个/ml细胞接种浓度接种含有5g/L的Cytodex-I微载体的生物反应器内，培养用液体为DMEM培养基含有10%新生牛血清，NaHCO3调整pH至7. 2，37°C进行培养，培养2天后开始2体积/天灌流培养，灌流培养阶段细胞生长液为DMEM培养基含有 2 %新生牛血清，NaHCO3调整pH至7. 2，培养至第6天开始换维持液，维持液为199培养基含有0. 人血白蛋白，NaHCO3调整pH至7. 4。根据对病毒最佳接种浓度、培养条件、收获时间的优化筛选，我们选择病毒细胞比例以1 100 (Μ0Ι = 0.01)接种，33°C培养，培养48 72小时后开始灌流收获，可连续收获8 10天。实施例2病毒灭活验证1)乙脑疫苗灭活验证验证方法取供试品脑内接种12 14克小鼠8只，每只0. 03ml,同时腹腔接种 0. 5ml，为第一代；7天后将第一代小鼠处死3只，取脑做成10%悬液，同法脑内接种12 14g小鼠6只，为第二代；7天后将第二代小鼠处死3只，同法脑内接种12 14g小时6只， 为第三代。接种后逐日观察14天，3天内死亡者不计(动物死亡数量应不超过试验用动物总数的20% )，每代小鼠除处死和接种后非特异性死亡外，全部健存为合格。2)EV71疫苗灭活验证取灭活的病毒液经透析后，接种25ml于Vero细胞或其他适宜敏感细胞，每Iml病毒液应至少接种3cm2单层细胞，37°C吸附60分钟后加入细胞培养液，培养液与病毒液比例不超过1 3，每7天传1代，培养21天后收获培养液，混合后取样，脑内接种新生小鼠10 只，每只0. lml，3天内死亡者不计，观察14天。每代细胞均不得出现典型细胞病变小鼠全部健存则灭活验证合格。实施例3效价测定
1)用乙脑EV71联合疫苗和参考疫苗按规定程序免疫昆明系小鼠，刺激其免疫反应产生抗体，到期后采血，分离血清，与乙型脑炎病毒中和，通过蚀斑减少中和试验，计算待检疫苗的效价。2)用乙脑EV71联合疫苗免疫SD大鼠，免疫两次，间隔7天，于初免后第14天采血，分离血清，与EV71病毒中和，通过微量中和试验检测抗体效价。实施例4异常毒性检查1)小鼠试验法昆明系小鼠，18 22g，每批疫苗注射5只小鼠，每只小鼠腹腔注射 0. 5ml，观察7天。观察期内，小鼠应全部健存，且无异常反应，到期时，每只小鼠体重增加则判为合格。2)豚鼠试验法豚鼠，250 350g，每批疫苗注射2只，每只豚鼠腹腔注射5. 0ml，观察7天。观察期内，豚鼠应全部健存，且无异常反应，到期时，每只豚鼠体重增加则判为合格。
权利要求
1.一种乙脑EV71联合疫苗，其特征在于该疫苗是分别将乙脑病毒抗原和肠道病毒 71 (EV71)抗原经细胞培养、病毒培养、病毒灭活、纯化抗原等工序制备后，按重量比1 1 1 10的比例进行混合得到的无佐剂联合疫苗。
2.权利要求1的联合疫苗，其特征在于其中，乙脑病毒抗原是用生物反应器培养Vero 细胞制备的。
3.权利要求1的联合疫苗，其特征在于其中，EV71抗原是Vero细胞或二倍体细胞的培养制备的。
4.权利要求1的联合疫苗的研制，其特征在于，包括以下步骤乙脑病毒抗原制备DVero细胞复苏、扩增至生物反应器，微载体培养；2)高密度细胞接种乙脑病毒毒种；3)多次收获病毒液；4)病毒收获液超滤浓缩；5)β -丙内酯或者甲醛灭活病毒；6)硫酸鱼精蛋白沉淀、蔗糖密度梯度区带离心、超滤脱糖纯化制备乙脑病毒抗原；7)乙脑病毒抗原加人血白蛋白和(或)海藻糖、右旋糖酐制成原液；EV71抗原制备DVero细胞或二倍体细胞的复苏、扩增；2)单层细胞接种EV71毒种；3)收获病毒液；4)超滤浓缩病毒液5)病毒采用阴离子交换DEAEsepharose FF和分子筛s印harose 6FF结合的方法纯化得EV71抗原；6)β -丙内酯或者甲醛灭活病毒7)EV71抗原加人血白蛋白和(或)海藻糖、右旋糖酐制成原液；联合疫苗配制混合方法按重量比1 1 1 10配制，为乙脑EV71联合疫苗。该疫苗0. 5ml/剂，含乙脑抗原2 4微克，EV71抗原3 9微克。基础免疫应注射三针，婴幼儿于6月龄、8月龄、10月龄各注射一针。
5.根据权利要求4所述乙脑EV71联合疫苗的研制，其特征在于乙脑病毒为P3株； EV71毒种为国内分离株。
6.根据权利要求4所述乙脑EV71联合疫苗的研制，其特征在于细胞培养液可以是含有2 10%小牛血清或者胎牛血清的DMEM、199或者MEM培养基。
7.根据权利要求4所述乙脑EV71联合疫苗的研制，其特征在于病毒超滤浓缩前经澄清过滤，乙脑病毒和EV71浓缩超滤膜截留分子量为50 300KD，超滤浓缩过程中可除去部分杂蛋白。
8.根据权利要求4所述乙脑EV71联合疫苗的研制，其特征在于EV71抗原是经转瓶培养或生物反应器培养或细胞工厂培养。
9.根据权利要求4所述乙脑EV71联合疫苗的研制，其特征在于EV71病毒灭活使用甲醛或者β-丙内酯。
10.根据权利要求4所述乙脑EV71联合疫苗的研制，其特征在于乙脑抗原纯化先通过硫酸鱼精蛋白吸附沉淀Vero细胞残余DNA，再用蔗糖密度梯度区带离心方法收取抗原峰，经100KD超滤脱糖制得；EV71抗原采用阴离子交换DEAE Sepharose FF和分子筛 Sepharose 6FF结合的方法纯化。
11.根据权利要求4所述乙脑EV71联合疫苗的研制，其特征在于联合疫苗是由含人血白蛋白和(或)海藻糖、右旋糖酐制等稳定剂乙脑原液和EV71原液混合而成，联合疫苗中人血白蛋白和(或)海藻糖、右旋糖酐的含量为 10%。
全文摘要
本发明涉及一种由乙型脑炎病毒疫苗和EV71病毒疫苗制备的联合疫苗及其制备方法。将乙型脑炎病毒经过培养、收获、灭活、超滤浓缩、纯化获得的乙型脑炎病毒原液和将EV71病毒经过培养、收获、超滤浓缩、纯化、灭活获得的EV71病毒原液按照一定比例配制后形成联合疫苗，这种联合疫苗可以同时预防婴幼儿、儿童常患的乙型脑炎和EV71病毒所致手足口病。
文档编号A61P31/14GK102160892SQ20111000514
公开日2011年8月24日 申请日期2011年1月12日 优先权日2011年1月12日
发明者石慧颖 申请人:山东恒业生物技术有限公司