专利名称：镇痛活性肽vrd及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，涉及镇痛活性肽VRD的结构、功能以及制备方法与应用，具体地说，本发明涉及镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段、第54位保守氨基酸残基的结构及其制备方法，以及作为镇痛药物在医药领域中的应用。
背景技术：
蝎作为中医珍贵药材又称全虫、全蝎，始载于《开宝本草》，《本草纲目》列于虫部40卷，距今已有2000多年的药用历史，具有熄风镇痉、攻毒散结、痛络止痛之功效。临床用于治疗偏头痛、面神经瘫痪、风湿痹痛及癌痛等症，疗效确切。蝎主要活性成分 是尾腺分泌的毒素，其中蕴涵大量具有药学价值的活性组分，是一个富含有多种功能肽的天然活性肽库。目前，从蝎获得具有镇痛活性的成分且结构清楚的已经有一些，如，蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽、蝎镇痛抗菌活性肽、镇痛活性肽VGG、镇痛活性肽DKK、镇痛活性肽GRR等。
发明内容
本发明的目的是通过体内生物活性实验确证源于蝎的一种多肽具有镇痛活性(该活性肽命名为镇痛活性肽VRD)。同时，也提供了镇痛活性肽VRD制备方法与应用范畴，具体是利用基因工程技术，从蝎cDNA克隆获得镇痛活性肽VRD基因并表达获得具有镇痛活性的该活性肽以及其衍生物、类似物、活性片段、突变体,镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段、突变体的制备方法简单易行，可与任何载体混合制备医学上可接受的剂型。本发明目的之二是针对镇痛活性肽VRD的镇痛活性，利用基因工程技术获得系列镇痛活性肽VRD的衍生物、类似物、活性片段、突变体，通过获得的系列表达产物的实验动物体内镇痛活性，以获得可以进一步开发镇痛类药物的镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段、突变体。本发明目的之三是针对镇痛活性肽VRD第54位氨基酸残基对其镇痛活性保守性进行研究，利用基因工程技术针对该位点氨基酸残基进行突变以获得系列突变体，通过获得的系列突变体表达产物的实验动物体内镇痛活性，确定对镇痛活性肽VRD的镇痛活性具有保守性。本发明目的之四是针对镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段、突变体的制备方法，利用基因工程技术或化学合成技术解决镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段、突变体。镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段、突变体的基因工程技术方法包括
⑴将编码镇痛活性肽VRD或其衍生物或其类似物或其活性片段或其突变体的DNA重组至表达载体；
⑵将步骤⑴获得的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；
⑶在适合的诱导表达条件下，培养步骤⑵的被转化的宿主细胞；
⑷收获并纯化所得到的蛋白质。本发明的另一个目的是提供上述镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段、突变体的表达产物分离纯化方法。该方法可使用盐析沉淀、超滤、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法，从细胞的溶胞产物及培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(WESTERN)检测表达产物的存在及相应分子大小。本发明首次进行上述镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段、突变体的小鼠体内镇痛生物学活性实验。本发明还提供了上述镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段、突变体在生物制药领域的应用，具体地说是其镇痛生物活性。 本发明的再一个目的是提供含有如上限定的蛋白质及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。可按照制药工业领域已知的基本原则和方法制备适于胃肠道外途径给药的药物组合物(如参见Remington’ s Pharmaceutical Science, 15th.,Mack Publishing Company, 1980)。可通过各种给药途径,特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔内、鼻内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本发明的药物组合物。本发明的再一个目的是提供如上限定的蛋白质在生产镇痛药物中的应用。可使用本发明的蛋白或含有该蛋白质的药物组合物作为治疗剂，用于治疗特定类型人体的各种疼痛相关疾病。本发明的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾病的性质、严重程度及对药物的敏感适应性，以及给药途径等诸多因素由临床医生按照个体化原则来确定。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。本发明所述的镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段、突变体具有较好的镇痛活性，其获得方法常规、简单、产量高，不仅具有重要的指导意义和实用价值，也为工业化生产奠定了基础。
具体实施例方式 下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。实施例I :
镇痛活性肽VRD的获得
根据镇痛活性肽 VRD (VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHR)的N末端和C末端氨基酸序列以及其基因序列，分别设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5'端，分别加上限制性核酸内切酶I和BamH I水解位点序列；以蝎cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过限制性核酸内切酶I和I双酶切后，与同样进行双酶切的质粒在T4 DNA Iigase的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞DH 5a，经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。结果表明，通过上述基因工程的方法构建获得镇痛活性肽VRD基因。将阳性重组质粒热转化大肠杆菌BL21 ( A DE3)，然后从该LB固体平板上挑取单菌落后接种至3 ml LB (含卡那抗生素,50 Mg/ml),于37 °C, 200 r/min振荡过夜培养。按照1%接种量将过夜培养物接种至400 ml含相应抗生素的新鲜LB培养基的三角瓶中，于37°C，200 r/min振荡培养至0D600为0. 6-0. 8，加入终浓度为0. 166 mmol/L的诱导物异丙基3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培养4 h。结束发酵，3000 g离心力、4 °C离心20 min，收集菌体。用40 ml裂解缓冲液(0. I M PBS, 0. 15 M NaCl, 50 mM咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，超声结束后于12，OOOg离心力、4 °C离心20 min，得上清液，所得沉淀按照上述步骤重复破碎一次，合并两次上清液，直接上样于0. I M PBS (pH 8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不同阶段的PH缓冲液分别充分洗涤5个柱床体积后，使用0.5 M咪唑(pH 9.0)进行洗脱并收获该洗脱液。洗脱液中的表达产物结构特征为MHHHHHHM VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHR。利用化学法在 M 处断裂肽链，从而获得镇痛活性肽VRD，结构特征为VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQffGGRYGNACffCIKLPDSVPIRVPGKCHR。实施例2:
镇痛活性肽VRD的分离纯化
在实施例I获得的表达产物或镇痛活性肽VRD的纯度没有达到预期纯度要求，可以利用疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、反相层析方法，分别单独或组合进行，以便进一步分离纯化至预期纯度要求。疏水层析分离
实施例I中的金属离子螯合层析柱获得的表达产物或化学法在M处断裂肽链获得的镇痛活性肽VRD，用盐酸水溶液或磷酸水溶液或酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围下，加中性盐至2M浓度，上样于预先用2M中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，分别用2. OMU. 5M、1. 0M、0. 5M中性盐-缓冲液洗脱，最后用缓冲液洗脱，将含有目标物的洗脱液合并。疏水层析分离的特征1.疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料或正辛烷-疏水层析添料-或己烷-疏水层析添料-或丁烷-疏水层析添料；2.中性盐选择(HN3) 2S04或Na2SO4或NaCl ；3.缓冲液的pH选择在pH2_pH12，此条件既不影响镇痛活性成分的生物活性，又不影响活性成分的分离；4.缓冲液的浓度选择在ImM-lOOmM，此条件既不影响镇痛活性成分的生物活性，又不影响活性成分的分离。超滤处理镇痛活性成分溶液
利用超滤处理的目的是除去镇痛活性成分溶液中的盐或杂蛋白或更换缓冲液，此外，对镇痛活性成分溶液进行浓缩。选择能够使镇痛活性肽VRD或及其衍生物、类似物、活性片段透过的超滤膜进行超滤处理，此时收集超滤透过液，而杂蛋白被截留实现分离的目的。选择能够截留镇痛活性肽VRD或及其衍生物、类似物、活性片段的超滤膜进行超滤处理，此时收集超滤浓缩液(镇痛活性肽VRD或及其衍生物、类似物、活性片段被截留)，而盐、缓冲液的缓冲对、能透过超滤膜的杂蛋白、水被透过，实现去除盐、杂蛋白或更换缓冲液或浓缩的目的。超滤处理的特征1.透过超滤膜选择是分子量为IOkDa或20kDa或30kDa或40kDa或50kDa的超滤膜，优选30kDa的超滤膜，大于或小于30kDa的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；2.截留超滤膜选择是分子量为IkDa或2kDa或3kDa或5kDa的超滤膜，优选IkDa的超滤膜，大于或小于IkDa的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；3.超滤处理的温度选择在0°C -45°C，此条件既不破坏超滤膜的理化性质，又不影响目标物的活性。离子交换层析分离
利用超滤处理的镇痛活性成分溶液，进一步用离子交换层析实验的缓冲液进行除盐、缓冲液更换和浓缩。待处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析柱，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白，分别用0. 05M、0. 1M、0. 15M、0. 2M、0. 25M、0. 3M、0.4M、0.5M盐溶液进行阶段洗脱，将含有镇痛活性的洗脱液合并。离子交换层析分离的特征1.层析介质选择阳离子交换层析添料，如CM-离子交换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料等阳离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7 ；
2.层析介质选择阴离子交换层析添料，如Q-离子交换层析添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料等离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12 ；3.缓冲液的浓度选择在lmM-50mM，此条件既不影响镇痛活性成分的生物活性，又不影响活性成分的分离；4.阶段洗脱的盐溶液选择是要求浓度的缓冲液或在IOmM缓冲液中加中性盐到需要的浓度；5.中性盐选择(HN3)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl，优选NaCl。疏水层析纯化
镇痛活性成分按照疏水层析分离方法的基本框架进一步纯化。镇痛活性成分溶液加中 性盐至2M浓度，上样于预先用2M中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱，进行中性盐浓度梯度(2.0M 0. 0M)洗脱，合并收集含有镇痛活性的洗脱峰，进行超滤去盐和浓缩处理。疏水层析纯化的特征1.疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料或正辛烷-疏水层析添料-或己烷-疏水层析添料-或丁烷-疏水层析添料；2.中性盐选择(HN3) 2S04或Na2SO4或NaCl;3.缓冲液的pH选择在pH2-pH12 ;4.缓冲液的浓度选择在ImM-lOOmM。离子交换层析纯化
镇痛活性成分按照离子交换层析分离方法的基本框架进一步分离。待处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析柱，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白，进行盐浓度梯度(0. OM I. OM)洗脱，合并收集含有镇痛活性的洗脱峰。离子交换层析纯化的特征1.层析介质选择阳离子交换层析添料，如CM-离子交换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料等阳离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7 ；2.层析介质选择阴离子交换层析添料,如Q-离子交换层析添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料等离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12 ；3.缓冲液的浓度选择在lmM-50mM ;4.盐梯度洗脱的盐溶液选择是要求浓度的缓冲液或在IOmM缓冲液中加中性盐到需要的浓度；5.中性盐选择(HN3) #04或Na2SO4或NaCl或KCl，优选NaCl。凝胶层析
将含有镇痛活性的溶液进行超滤浓缩，样品液上样于预先用洗脱液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行纯化，收集含有镇痛活性的洗脱峰。凝胶层析的特征1.层析介质可以选择 Sephacryl S-100 HR 或 Sephacryl S_200 HR 或 Sephadex G-50 或 Sephadex G-75 或Sephadex G-100 或 Sephadex G-150 或 Superose 12 prep grade 或 Superose 6 prep grade或 Superdex 30 prep grade 或 Superdex 75 prep grade 或 Superose 12 HR 或 Superose6 HR 或 Superdex Peptide HR 或 Superdex75 HR 或 Superdex Peptide PE 等凝胶层析添料；2.洗脱液的pH选择在pH2-pH12 ;3.洗脱液的浓度选择在离子浓度大于0. 15M及以上。反相层析
活性组分，上样于预先用0. 1%三氟醋酸-20%乙腈水溶液平衡好的反相层析柱，如SOURCE 15RPC、30RPC层析添料，先用0. 1%三氟醋酸-20%乙腈水溶液充分洗涤，而后进行乙腈浓度梯度(20%至95%)洗脱，合并收集洗脱峰面积最大的洗脱峰组分-镇痛活性肽目标物。实施例3
镇痛活性肽VRD在酵母中的表达及其纯化
将编码镇痛活性肽基因的序列利用寡核苷酸引物进行扩增，PCR反应所使用的5'寡核苷酸引物序列含有EcoR V限制性内切酶的酶切位点和镇痛活性肽VRD的N末端区域氨基酸序列的编码序列，3'端引物序列含有EcoR I限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止密码子和镇痛活性肽VRD的C末端区域氨基酸序列的编码序列。引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于酵母表达载体PPIC9K上的限制性内切酶酶切位点(其中EcoR V和SnaB I的内切酶切口为平末端)，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和KarO，一个来自2P质粒的复制子，一个AOXl启动子，在毕赤酵母中可由甲醇诱导高效表达，一个a -因子的信号肽序列，一个转录终止信号，一个HIS4选择性标记以及整合 序列。用SnaB I和EcoR I消化pPIC9K载体，用EcoR V和EcoR I消化PCR扩增的镇痛活性肽VRD基因，随后将其连入pPIC9K载体，连接产物热转化E. coli DH 5a菌株，在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在含有Amp (100 u g/ml)的LB液体培养基中过夜培养含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证插入片段正确插入。取质粒线性化后，电转化入酵母细胞，线性化的重组载体通过与宿主基因组的同源序列发生同源重组产生稳定的酵母转化体。利用G418筛选出高拷贝的整合转化子。将筛选得到的菌株接种于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28 30°C /250 300转/分培养至0D600 = 2
6(16 18 h);室温下3000转/分离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的丽、BMM或BMMY重悬菌体(约10 20ml);将步骤2所得的菌液置于IOOml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28 30°C /250 300转/分的摇床上继续生长；每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0. 5 I. 0%。诱导工程菌表达的培养液中含有表达产物，该表达产物结构特征为VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHRo针对诱导工程菌表达的培养液中表达产物，按照实施例2所提供的分离纯化方法，将表达产物分离纯化至预期纯度。实施例4
镇痛活性肽VRD的衍生物、类似物、活性片段获得
本实施例获得镇痛活性肽VRD的衍生物、类似物、活性片段的策略和基本方法，类同实施例I、实施例2和实施例3的策略和基本方法。具体是在镇痛活性肽VRD的N末端或C末端额外加上一个或多个氨基酸残基，获得的镇痛活性肽VRD衍生物、类似物、活性片段仍然具有镇痛生物活性。其结构特征为
MVRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHR。(SGGGG) n (n 可以是 I 或 2 或 3 或 4 或 5)。(SGGGG)n VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHR (n可以是I或2或3或4或5)。下面的解释可以使本专业技术人员更全面地理解上述镇痛活性肽VRD衍生物、类似物、活性片段的结构特征，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。N是3的镇痛活性肽VRD衍生物、类似物、活性片段的结构特征为MVRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHRSGGGGSGGGGSGGGG ；
或 MSGGGGSGGGGSGGGGVRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHRo实施例5
镇痛活性肽VRD第54位氨基酸残基的镇痛活性保守性
本实施例获得镇痛活性肽VRD第54位系列突变体的策略和基本方法，类同实施例I、实施例2、实施例3和实施例4的策略和基本方法。具体是针对镇痛活性肽VRD的54位S残基，通过基因突变技术，将54位S残基分别突变成A、Y、E、K、F、I、T、D、R残基，通过基因工程表达获得相应的突变体，其结构特征为
VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDAVPIRVPGKCHRo。。。。。。 。。针对镇痛活性肽VRD衍生物、类似物、活性片段的突变体，其结构特征为 MVRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPD (A 或 Y 或E 或K 或F
或 I 或 T 或 D 或 R) VPIRVPGKCHR。(A 或 Y 或 E 或 K 或 F 或 I 或 T 或 D 或 R) VPIRVPGKCHR (SGGGG) n (n 可以是 I 或2或3或4或5)。(SGGGG)n VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQffGGRYGNACffCIKLPD (A 或 Y或E或K或F或I或T或D或R) VPIRVPGKCHR (n可以是I或2或3或4或5)。实施例6
体内镇痛活性一小鼠醋酸扭体法
本实施例通过小鼠体内镇痛模型确定镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段的体内生物活性-镇痛活性。此外，也旨在验证镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段中保守氨基酸残基对镇痛活性的影响。蛋白浓度采用Lowry方法进行测定。小鼠醋酸扭体法镇痛模型将冰醋酸作为化学刺激物注入昆明种小鼠腹腔内，继而引起深部的、大面积而较持久的疼痛刺激，致使小鼠产生“扭体”反应(腹部内凹、躯干与后腿伸张、臀部高起)。18-22 g昆明种小鼠，雌雄各半，随机分组，每组10只，尾静脉注射样品，20 min后按0.2 ml/20 g腹腔注射0.6% (v/v)醋酸引起内脏痛,5 min后记录小鼠10 min内的扭体次数。以吗啡为阳性对照，生理盐水为空白对照，按照下述公式计算各个给药组的扭体反应抑制率。
-JrV, a,i fi.白组扭体次数-给药组扭体次数，
補库=-1百爾厭觀-幻纖镇痛生物活性实验结果表明
①生理盐水空白组实验动物扭体次数(Mean土SEM)为41. 75±2. 98 ;阳性对照组(吗啡，I. 00mg/kg)实验动物扭体次数(Mean土SEM)为23. 67±1. 95，扭体抑制率为43. 30%。②镇痛活性肽VRD样品组(0. 5mg /kg)的实验动物扭体次数(Mean 土 SEM)为22. 00 ± I. 79，扭体抑制率为47. 30%。③镇痛活性肽VRD衍生物、类似物、活性片段各样品组(0. 5mg /kg)的实验动物扭体抑制率均在45%以上。·④镇痛活性肽VRD第54位氨基酸残基突变体样品组(0. 5mg /kg)的实验动物镇痛生物活性
A.镇痛活性肽VRD第54位S分别突变为E或K或Y或T或D或R突变体及其相应衍生物、类似物、活性片段的扭体抑制率均在38%以上，相对突变前(镇痛活性肽VRD)的镇痛生物活性，两者之间的变化没有统计学意义；
B.镇痛活性肽VRD第54位S分别突变为A或F或I突变体及其相应衍生物、类似物、活性片段的扭体抑制率均在32%以下，相对突变前(镇痛活性肽VRD)的镇痛生物活性表现为降低，且该降低具有统计学意义；
述学6法IKLPDS
上述结果表明镇痛活性肽VRD第54位S或E或K或Y或T或D或R，是镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段的镇痛活性保守性氨基酸残基。
权利要求
1.镇痛活性肽VRD，其特征在于，其结构特征为VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHR。
2.根据权利要求I所述的镇痛活性肽VRD，其特征在于，所述的镇痛活性肽VRD的第54位氨基酸残基为S或E或K或Y或T或R或D。
3.镇痛活性肽VRD的衍生物或类似物或活性片段或突变体，其特征在于，它包含权利要求I或2中任何一项所述的氨基酸序列全序或片段。
4.根据权利要求I或2或3所述的镇痛活性肽VRD的衍生物或类似物或活性片段或突变体，其特征在干，其包括如下几个镇痛活性肽VRD的衍生物或类似物或活性片段或突变体MHHHHHHMVRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHR ；MVRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHR ；MVRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHR (SGGGG) η (η 可以是 I 或 2 或 3 或 4 或 5);M (SGGGG)n VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQffGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHR (η 可以是 I 或 2 或 3 或 4 或 5);MVRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHRSGGGGSGGGGSGGGG ；MSGGGGSGGGGSGGGGVRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDSVPIRVPGKCHR ；VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDAVPIRVPGKCHR ；VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDYVPIRVPGKCHR ；VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDEVPIRVPGKCHR ；VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDFVPIRVPGKCHR ；VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDIVPIRVPGKCHR ；VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDKVPIRVPGKCHR ；VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDTVPIRVPGKCHR ；VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDDVPIRVPGKCHR ；VRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPDRVPIRVPGKCHR ；MVRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQffGGRYGNACffCIKLPD (A 或 Y 或E 或K 或F 或 I 或T 或D 或 R) VPI RVPGKCHR ；MVRDAYIAKPENCVYHCATNEGCNKLCTDNGAESGYCQffGGRYGNACffCIKLPD (A 或 Y 或 E 或 K 或 F 或 I 或 T 或 D 或 R) VPI RVPGKCHR (SGGGG) η (η 可以是 I 或2或3 或4或 5); M (SGGGG)n VRDAYIAKPENCVYHCATN EGCNKLCTDNGAESGYCQWGGRYGNACWCIKLPD (Α 或 Y 或 E 或 K 或F或I或T或D或R) VPI RVPGKCHR (η可以是I或2或3或4或5)。
5.权利要求I或2或3或4所述的镇痛活性肽VRD及其衍生物或类似物或活性片段或突变体的制备方法，可以利用基因工程技术进行表达获得，其特征在于，表达宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
6.如权利要求I或2或3或4所述的镇痛活性肽VRD及其衍生物或类似物或活性片段或突变体，可以利用化学合成技术获得，其特征在于，化学合成为人工合成或合成仪合成。
7.权利要求I或2或3所述的镇痛活性肽VRD及其衍生物或类似物或活性片段或突变体在制备镇痛药物中的应用。
8.权利要求5所述的镇痛活性肽VRD及其衍生物或类似物或活性片段或突变体的制备方法，其特征在于，基因工程表达后通过如下方法分离纯化，它包括(I)表达的基因工程菌体经破碎后，离心除去不溶物获得的上清液；或基因工程菌分泌表达后离心除去不溶物获得的上清液(2)上清液经疏水层析柱分离得到目标物活性组分，(3)得到活性组分经超滤以去除盐和杂蛋白，同时进行浓缩，通过离子交换层析柱分离得到目标物活性组分，(4)经疏水层析柱进ー步分离得到活性组分，(5)经超滤以去除盐和浓缩，通过离子交换层析柱纯化得到目标物活性组分，(6)经凝胶过滤层析柱进一步纯化得到目标物活性组分，(7)经反向层析柱得到高纯度的目标物。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的镇痛活性肽VRD及其衍生物或类似物或活性片段或突变体可以与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射剂、ロ服制剂、透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂。
全文摘要
本发明涉及生物医药技术领域，涉及镇痛活性肽VRD的结构、功能以及制备方法与应用。具体地说，本发明涉及镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备方法，镇痛活性肽VRD第54位氨基酸残基对其镇痛活性的保守性，上述镇痛活性肽VRD及其衍生物、类似物、活性片段、突变体作为镇痛药物，可以与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射剂、口服制剂、透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂，在医药领域中应用。本发明所述的活性肽具有较好的镇痛活性，其获得方法常规、简单、产量高。
文档编号A61K38/17GK102690343SQ20111006900
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月22日 优先权日2011年3月22日
发明者刘岩峰, 吴春福, 张景海, 王月秋 申请人:沈阳药科大学