专利名称：多肽驴皮胶代血浆生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽驴皮胶代血浆生产工艺，属于医药技术领域。
背景技术：
众所周知，血浆是循环血液之液体部分，是一种含有血清蛋白、无机盐类、电解质、葡萄糖和纤维蛋白原的水溶液。在平时特别是战争时期当人体因种种原因出现失血过多时，都需补充血浆，应用人血血浆和血液制品已随一些由血液传染的病如肝炎、艾滋病等而变得不十分安全。再加上人体血源受到限制，价格又贵，因此单靠人体血源己不能满足大量用血的需要。开发和研制非人体血液的代血浆已成为科技界和医学界十分关注和重视的问题。当前在医学临床中，普遍应用的代血浆是右旋糖酐、羟乙基淀粉和明胶代血浆。右旋糖酐临床应用的不良反应较多，如过敏反应、急性肾功能衰竭、蓄积作用、出血倾向、交叉配血实验的假凝集、加速血沉、抑制吞噬功能系统。羟乙基淀粉的生物学效应取决于它的平均分子量和羟乙基的取代度，较低相对分子质量的羟乙基淀粉的扩容强度小，较高相对分子质量的羟乙基淀粉在脏器内积存期较长，使红细胞聚集增加，出血时间延长，低取代的羟乙基淀粉在血液循环中易被血液淀粉酶所水解，在循环中存留时间较短，高取代羟乙基淀粉因停留时间过长会发生体内蓄积和凝血机制受损。而且这类代血浆的制备工艺复杂， 工艺条件控制较难，成品产量少而价格高，其成份以低分子量为主，不参与体内代谢过程， 无营养价值。研究表明，明胶代血浆具有最好的血液相溶性，即使大剂量输注，也几乎不影响凝血机制和纤维蛋白溶解系统，在临床应用中过敏反应症状也较血浆蛋白或右旋糖酐轻微，是优选的代血浆。可供临床使用的明胶代血浆有3种，即氧化聚明胶、脲联明胶、琥珀酰明胶。氧化聚明胶于1951年用于临床，但过敏反应发生率较高，曾报道应用后发生过敏性休克死亡的病例，对血沉及血型鉴定亦有影响，现已少用。脲联明胶由于其溶液中钙离子浓度过高，使得在应
用中会出现凝胶现象。琥珀酰明胶是由牛胶原经琥珀酰化而成的胶体溶液，皮肤丘疹反应较多，且随着疯牛病的出现和全球蔓延，已不再用牛骨制备明胶。寻找新的胶原蛋白的来源、探索新工艺、制备安全有效的血浆代用品迫在眉睫。多肽驴皮胶代血浆属于明胶类代血浆，其扩充血容量、改善微循环的作用突出，并具有促进红细胞再生、促进受损的肝细胞恢复的优势，将成为新一代理想的血浆产品，可广泛应用于战伤、外伤、烧伤、手术等各种情况下补充血量，维持血压，不仅市场可观，而且具有较大的社会意义。CN1055111公开了一种驴皮胶代血浆及其制备方法。该专利通过改进传统阿胶的制备工艺“原料的去脂、除热原处理，原胶熬制分离，原胶的除菌、除热原精制和代血浆配制”制备代血浆。该专利所述的驴皮胶代血浆制备方法繁琐，难于规模化生产。CN101185657 保护驴皮阿胶代血浆生产工艺及装置，该专利的制备方法复杂，同样难于规模化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产工艺科学合理，生产效率高，产品杂质少、纯度高、 质量好的多肽驴皮胶代血浆的制备方法。针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案
一种多肽驴皮胶代血浆生产工艺，其特征在于所述的多肽驴皮胶的制备方法包括 (1 )多肽驴皮胶的制备
a、选用健康、无病的毛驴进行清洗、宰杀、剥皮；
b、将驴皮切割，装入渗漉罐中，用60 80°C水渗漉提取明胶；
c、渗漉液喷雾干燥，收集明胶粉末；将磷脂溶于聚乙二醇硬脂酸酯15中，加5%-25% 的乙醇形成胶束；将明胶粉末复溶于上述的5%-25%的乙醇中，过滤去除杂质；其中所述聚乙二醇硬脂酸酯15的用量是多肽驴皮胶重量的0. 2%、磷脂的用量是多肽驴皮胶重量的 0. 2% ；
e、阳离子树脂精制，过滤去除杂质，真空干燥，即得； (2)多肽驴皮胶代血浆的制备
a、将多肽驴皮胶等溶于注射用水中，加入活性炭煮沸，过滤，分装，热压灭菌，制得多肽驴皮胶代血浆注射液。b、将多肽驴皮胶等溶于注射用水中，加入活性炭煮沸，无菌过滤，分装，冷冻干燥， 制得注射用多肽驴皮胶代血浆。本发明的有益效果主要是
USolutol HS-15 (聚乙二醇硬脂酸酯15又称聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯)，专为注射剂开发的一种低毒非离子表面活性剂。可作为增溶剂和乳化剂应用在注射剂、乳剂和脂质体等剂型中。本发明经过大量筛选和研究，发现Solutol HS-15和磷脂形成胶束后可以解决多肽驴皮胶经喷雾干燥后长时间放置，加水复溶不完全溶解的难题。另本发明提供的多肽驴皮胶代血浆制备工艺中引入了动态渗漉提取和喷雾干燥步骤，提取物杂质少，喷雾干燥过程中粗胶中的脂质和其他杂质在复溶20%的乙醇时，由于不溶解而被最大程度的的去除，不仅制备工艺得到了简化，适宜于大规模化生产，而且后续过滤等操作的速度也大幅度提高。2、本发明提供的多肽驴皮胶代血浆制备工艺的特点是生产工艺科学合理，产品杂质少、纯度高、质量高；生产效率高，工人劳动强度低，环境污染少，成本低，有较高的经济效益和社会效益。
具体实施例方式下面结合实例对本发明作进一步详细说明，但本发明的范围并不受这些实例的任何限制。实施例1
选用健康、无病的毛驴进行清洗、宰杀、剥皮，将驴皮切割，装入渗漉罐中，用8 0°C水渗漉提取明胶；渗漉液喷雾干燥(进风温度160°C，出风温度50°C)，收集干燥粉末，将磷脂溶于聚乙二醇硬脂酸酯15中，加20%的乙醇形成胶束；将明胶粉末复溶于上述的5%-25%的乙醇中，过滤去除杂质；其中所述聚乙二醇硬脂酸酯15的用量是多肽驴皮胶重量的0. 2%、磷脂的用量是多肽驴皮胶重量的0. 2% ；，采用卧式离心机过滤，回收乙醇，阳离子树脂交换去除钙离子等杂质，卧式离心机过滤，60°C真空干燥，分装，备用。将多肽驴皮胶250g、氯化钠70g溶于适量注射用水中，调PH值6. 5，加入活性炭煮沸，离心，调PH值7 8，常温下 0. 2Mpa压力下直径150毫米的0. 45微米微孔滤膜过滤，考察过滤时间，结果过滤耗时15分钟，加注射用水至10L，分装，115°C热压灭菌45分钟，Zetasizer Nano M光散射法测定重均分子量为18000。选用健康、无病的毛驴进行清洗、宰杀、剥皮、去毛、去脂，2%的碳酸钠溶液浸泡10 分钟，用水蒸煮驴皮，使其成明胶状，去除表层少量脂肪和底部沉淀物，进一步浓缩，真空干燥成原胶，原胶加水溶解，离心，取上清液用阳离子交换树脂精制，过滤去除杂质，真空干燥，分装，即得多肽驴皮胶。将多肽驴皮胶250g、氯化钠70g、溶于20L注射用水中，调PH值 6. 5，加入30g活性炭粉末煮沸30分钟，常温下0. 2Mpa压力下直径150毫米的0. 45微米微孔滤膜过滤，考察过滤时间，结果过滤耗时163分钟，加注射用水至10L，分装，115°C热压灭菌45分钟，Zetasizer Nano M光散射法测定重均分子量为17500。实施例2
选用健康、无病的毛驴进行清洗、宰杀、剥皮，将驴皮切割，装入渗漉罐中，用6 0°C水渗漉提取明胶；渗漉液喷雾干燥(进风温度160°C，出风温度50°C)，收集干燥粉末，将磷脂溶于聚乙二醇硬脂酸酯15中，加25%的乙醇形成胶束；将明胶粉末复溶于上述的5%-25%的乙醇中，过滤去除杂质；其中所述聚乙二醇硬脂酸酯15的用量是多肽驴皮胶重量的0. 2%、磷脂的用量是多肽驴皮胶重量的0. 2% ；采用卧式离心机过滤，回收乙醇，常压煮沸2小时，阳离子树脂交换去除钙离子等杂质，卧式离心机过滤，60°C真空干燥，分装，备用。将多肽驴皮胶250g、氯化钠70g溶于适量注射用水中，调PH值6. 5，加入活性炭煮沸，离心，调PH值7 8，常温下0. 2Mpa压力下直径150毫米的0. 45微米微孔滤膜过滤，考察过滤时间，结果过滤耗时16分钟，加注射用水至10L，分装，115°C热压灭菌45分钟，Zetasizer Nano M光散射法测定重均分子量为16900。实施例3
选用健康、无病的毛驴进行清洗、宰杀、剥皮，将驴皮切割，装入渗漉罐中，用8 0°C水渗漉提取明胶；渗漉液喷雾干燥(进风温度160°C，出风温度40°C)，收集干燥粉末，将磷脂溶于聚乙二醇硬脂酸酯15中，加5%的乙醇形成胶束；将明胶粉末复溶于上述的5%-25%的乙醇中，过滤去除杂质；其中所述聚乙二醇硬脂酸酯15的用量是多肽驴皮胶重量的0. 2%、磷脂的用量是多肽驴皮胶重量的0. 2% ；采用卧式离心机过滤，阳离子树脂交换去除钙离子等杂质，卧式离心机过滤，60°C真空干燥，分装，备用。将多肽驴皮胶250g、氯化钠70g溶于适量注射用水中，调PH值6. 5，加入活性炭煮沸，离心，调PH值7 8，过滤，加注射用水至10L， 0.22微米滤膜无菌过滤，分装，冷冻干燥即得。复溶后Zetasizer Nano M光散射法测定重均分子量为18000。实施例4
多肽驴皮胶代血浆体外溶血与凝聚试验
试验动物新西兰种白色家兔，雄性，体重2. ^g，中国药科大学实验动物中心提供。试验方法按中国药典二部附录XI L溶血与凝聚法进行。2%的红细胞混悬液的制备采用心脏取血法取兔血10毫升，放入含灭菌玻璃珠
5的50ml三角烧瓶中同方向震荡10分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0. 9%氯化钠溶液约100毫升，分装至10毫升刻度离心管中，摇勻，1200转/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0. 9%氯化钠溶液按上述方法洗涤3次，至上清液不显红色为止。 将所得红细胞加0. 9%氯化钠溶液配成2%的红细胞混悬液，备用。供试品的制备按实施例2制备多肽驴皮胶代血浆。检查法取洁净玻璃试管5只，编号。1、2号管为供试品管，3号管为阴性对照管， 4号管为阳性对照管，5号管为供试品对照管。按表1所示依次加入洲红细胞悬液、0. 9%氯化钠溶液、蒸馏水，混勻后，立即置37°C 士0. 5°C的恒温箱中进行温育。3小时后观察溶血和凝聚反应。表1溶血实验方案
试管编号1、23452%红细胞混悬液(ml)2. 52. 52. 50. 9%氯化钠溶液(ml)2. 22. 54. 7蒸馏水(ml)2. 5多肽驴皮胶代血浆(ml)0. 30. 3
结果
阴性对照管上层液体清亮透明，下层是沉淀的红血球，无溶血和凝聚发生，阳性对照管液体呈红色透明，发生溶血。供试品管中上层液体清亮透明，下层是沉淀的红血球，无溶血和凝聚发生。表明多肽驴皮胶代血浆符合注射溶血与凝聚试验的规定，可供注射使用。
实施例5
多肽驴皮胶代血浆过敏性试验
试验动物豚鼠，雄性，体重2680—330 g，中国药科大学实验动物中心提供。试验方法按中国药典二部附录XI K过敏反应检查法进行。供试品的制备按实施例2制备多肽驴皮胶代血浆。检查法取上述豚鼠6只，隔日每只每次腹腔注射供试品0.5ml，共3次，进行致敏。每日观察每只动物的行为和体征，首次致敏和激发前称量并记录每只动物的体重，然后将其平均分为2组，每组3只，分别在首次注射后第14日和第21日，由静脉注射供试品溶液Iml进行激发。观察激发后30分钟内动物有无过敏反应症状。结果三次腹腔致敏注射给药后未见豚鼠精神、活动、行为和体重出现异常；静脉激发注射给药后豚鼠呼吸均勻、被毛不竖，无抓鼻、咳嗽、呕吐、喷嚏等症状，未见其它精神、 行为的异常和过敏反应症状，体重也无异常变化。表明多肽驴皮胶代血浆符合注射过敏性试验的规定，可供注射使用。
实施例6
多肽驴皮胶代血浆对家兔静脉注射给药血管刺激性试验
试验动物新西兰种白色家兔，雄性，体重2. 2-2. ^g，中国药科大学实验动物中心提{共。试验方法
供试品的制备按实施例2制备多肽驴皮胶代血浆。
检查法
取白色大耳家兔4只，供试品组和对照组各2只。在兔夹上固定后，双侧耳缘静脉用75%乙醇涂抹消毒，用5号注射针头刺入，给药组分别缓慢注射多肽驴皮胶代血浆 IOml (5ml/耳)，对照组注射等容积0. 9%生理盐水，速度大约5min/耳。干棉球压迫止血 5分钟。每天注射1次，在耳缘同一条静脉血管的远心端上连续给药7天，每天观察局部血管情况。在第7天注射给药后的2小时，棒击家兔枕部头颅处死，死亡1小时待血液完全凝固后，剪取注射静脉血管近心端的双耳廓面积2X4cm各一块，浸泡在10%甲醛固定液中， 经脱水、石蜡包埋、切片后制成标本玻片，再经H. E染色，显微镜下进行病理组织学观察。结果对照组和受试药组家兔在静脉注射后无全身性不良反应。第2次静脉注射给药后，肉眼观察局部血管皮下组织有少量出血引起的青紫色瘀斑，连续7天给药未见异常。病理组织学切片观察，对照组和受试药组注射部位血管及周围组织未见出血、水肿、变性或坏死等刺激性反应。表明多肽驴皮胶代血浆符合注射给药血管刺激性试验的规定，可供注射使用。
实施例7
多肽驴皮胶代血浆对失血性休克犬血液动力学的影响试验动物成年健康杂种犬12只，雄性，体重15-20kg。， 试验方法
供试品的制备按实施例1制备多肽驴皮胶代血浆。对照品万汶(羟乙基淀粉130/0.4氯化钠，德国费森尤斯卡比股份有限公司) 上述12只成年健康杂种犬随机分为2组，分别是供试品组(多肽驴皮胶代血浆)、对照
组(万汶)，每组6只。腹腔注射2. 5%硫喷妥钠25mg/kg，气管内插管，机械通气，静注芬太尼、咪唑安定、维库溴铵维持麻醉。放血前以10 15ml/kg复方氯化钠静滴，实验全程以 5ml · kg-1 · IT1 维持。左侧股动脉置管用于检测平均动脉压(MAP)、放血及采血样，左侧股静脉置管用于输液及采血样，右侧股静脉置入Swan-Ganz导管用于测量肺动脉压(PAP)、肺动脉嵌压 (PAWP)、中心静脉压(CVP)及心排血量(CO)。经股动脉放血使MAP降至约5. 3 kPa，并维持 60 min。然后以与放血量等量的多肽驴皮胶代血浆或万汶在15 20 min内静脉输入。在放血前(T0)、休克时(T1)、输入代血浆后 IOmin (T2)、60min (T3)、4h(T4)、8h(T5)用惠普 71034 监测仪测量记录HR、MAP、PAP、PAffP, CVP, CO (用温度稀释法，取3次平均值)，并计算心脏指数(Cl)、体循环阻力(SVR)。同时监测观察实验结束后呼吸、反射及球结膜水肿情况。
统计分析组内比较用t检验和秩和检验处理，组间比较用单因素方差分析处理，P<0. 05为有显著性差异。结果
供试品组(多肽驴皮胶代血浆)与对照组(万汶)动物的体重、放血量、代血浆输入量无统计差异(表2)。表2各组动物体重、放血量和代血浆输入量组别体重(kg)放血量(ml)代血浆输入量(ml)多肽驴皮胶代血浆16. 62±2. 7515±82516±79万汶16. 55±3. 1507 + 90509 + 88
血液动力学变化放血至犬休克时，多肽驴皮胶代血浆组与万汶组的MAP、PAP、 PAffP, CVP, CO、CI均显著降低(P<0. 01)。多肽驴皮胶代血浆或万汶快速静脉输入后，以上各项血液动力学指标均显著回升(P<0. 01)。各时间段MAP上升幅度多肽驴皮胶代血浆组 >万汶组；CO、CI三组均回升到或超过基础值，各时间段上升幅度多肽驴皮胶代血浆组> 万汶组，二组比较有显著性差异(P<0.01) ；PAP、PAWP 二组在输入代血浆后均显著升高，各时间段升高幅度多肽驴皮胶代血浆组〉万汶组，二组比较有显著性差异(P<0.01) ；SVR在休克时二组均增高，但与基础值比较无统计学差异(P>0. 05)，输入代血浆后二组均显著降低(P<0. 01)，各时间段多肽驴皮胶代血浆组与万汶组比较无统计学差异(P>0. 0 (表2)。 实验结束后全部动物均恢复自主呼吸、睫毛反射，睁眼，出现肢动，无明显球结膜水肿。表明多肽驴皮胶代血浆对失血性休克犬扩充血容量的效果优于万汶。
表2各组血液动力学变化(n=6)
項ia iτT1Ti I Ta J T,TlKf (Isfa)多餘_ Ritie15 41±0 23 IS S2±0 255 23±0. Π 5 MM ηH.2B±0 2S IS.02±0 3 I 至4 22±0 23 ! Il -3Θ±0 18 H 32±D 16 I U Π±0 15t3.2S±.0 Il 9 H±0 08PAP (KPa)多慶代血《 ^^^2 18±0 10 t Π3.. 20 土 0,07tj±0 m'2. 72土0.23 if I 2.2S±0 08 2 社 15 [ ι ·Β±Ο m 1 I δ ±0 it2,03±β. IS 1 €￡±0 ISPJWP (kPa)多藍_ 臉代藤IL 鹩±0 3Sdm±o.oBS-IttO-ISL0D±0-12m0 IIι. m±o m ι αti±Q. IOο ω± .οτCYP Ilffa)RftittK 万次0 6S±O.OS 69 ± 100 33±0JX 0 34±0 mo. srrio. 05 ο m 0. 61 ±0 04 5&±C m0..71±0.· o.鶼±0 mG.S2 士 0 04 0 38士& ωOT'C L ir.‘ JIli2 19±0 ISQ 65±0. 7 0 6S±§. ￠94-0I+O- 13 3 S3±0 U t ii±0- 17 Z 5S± Ift2-S^±0. 31 l.8S±d 餘2.06土0 23 )16CIC L - ir. 1多*膽 RltllF.1 - 2±土0.157 例. i 例 tj I βΓ 1±0 ......2T........■毒.06±0. 16 3、IS土 .H2.83土0. iiSfR C ifm ■ s * ■ fW 膽代爐:錦±忽3um±3n3722 ±378 |dim±m%m±m4521 ±5533m±-m
权利要求
1.一种多肽驴皮胶代血浆生产工艺，其特征在于所述的多肽驴皮胶的制备方法包括(1)多肽驴皮胶的制备a、选用健康、无病的毛驴进行清洗、宰杀、剥皮；b、将驴皮切割，装入渗漉罐中，用60 80°C水渗漉提取明胶；c、渗漉液喷雾干燥，收集明胶粉末；将磷脂溶于聚乙二醇硬脂酸酯15中，加5%-25% 的乙醇形成胶束；将明胶粉末复溶于上述的5%-25%的乙醇中，过滤去除杂质；其中所述聚乙二醇硬脂酸酯15的用量是多肽驴皮胶重量的0. 2%、磷脂的用量是多肽驴皮胶重量的 0. 2% ；e、阳离子树脂精制，过滤去除杂质，真空干燥，即得；(2)多肽驴皮胶代血浆的制备a、将多肽驴皮胶等溶于注射用水中，加入活性炭煮沸，过滤，分装，热压灭菌，制得多肽驴皮胶代血浆注射液；b、将多肽驴皮胶等溶于注射用水中，加入活性炭煮沸，无菌过滤，分装，冷冻干燥，制得注射用多肽驴皮胶代血浆。
2.根据权利要求1所述的多肽驴皮胶代血浆生产工艺，其中所述的乙醇优选为20%。
全文摘要
本发明涉及一种多肽驴皮胶代血浆生产工艺，属于医药技术领域。一种多肽驴皮胶代血浆生产工艺，其特征在渗漉液喷雾干燥，收集明胶粉末；将磷脂溶于聚乙二醇硬脂酸酯15中，加5%-25%的乙醇形成胶束；将明胶粉末复溶于上述的5%-25%的乙醇中，过滤去除杂质；其中所述聚乙二醇硬脂酸酯15的用量是多肽驴皮胶重量的0.2%、磷脂的用量是多肽驴皮胶重量的0.2%；本发明提供的多肽驴皮胶代血浆制备工艺中引入了动态渗漉提取和喷雾干燥步骤，提取物杂质少，喷雾干燥过程中粗胶中的脂质和其他杂质在复溶20%的乙醇时，由于不溶解而被最大程度的去除，不仅制备工艺得到了简化，适宜于大规模化生产，而且后续过滤等操作的速度也大幅度提高。
文档编号A61K9/08GK102210705SQ201110148409
公开日2011年10月12日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者花亚光, 邹亚轩, 黄雄伟, 黄雄信, 龚箭 申请人:江苏建中投资有限公司