专利名称：一种包裹药理活性物质的核酸纳米粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种包裹药理活性物质的核酸纳米粒的方法，属于药理活性物质的体内递送及其临床应用领域。具体来说，本发明是一种将药理活性物质包裹进入核酸，从而形成纳米粒，用于体内药物递送。
背景技术：
静脉注射给药能够快速直接地作用于机体。为了降低静脉注射给药的副作用，有效的方法之一就是将药理活性物质包入微米或纳米级的粒子中。一方面，静脉注射的粒子可以缓释药理活性物质并延长药理活性物质的半衰期；另一方面，靶向材料可以将粒子中的药理活性物质靶向地释放。近年来，以核酸适体(Aptamer)作为主动靶向给药载体的研究日益受到了人们的关注。核酸适体是一段小的DNA或者RNA片段，能够形成比较特殊的三维结构，从而识别细胞表面的核酸质、糖类或者核苷酸等分子。目前已经报道的以核酸适体为导向给药系统有 核酸适体-药物结合体，核酸适体-脂质体结合体，核酸适体-纳米粒结合体。Bagalkot 等人(Angew Chem Int Ed Engl, 2006,45 (48) :8149-8152)将阿霉素与核酸适体连接，成功制备了适体-药物结合体。但是这种连接中，核酸与药物是一对一的关系，载药量相对较低，而且靶向性也较差。Cao 等人(Angew Chem Int Ed Engl，2009，48 (35) :6494-6498)制备了以顺钼为治疗药物的核酸适体-脂质纳米囊的靶向制剂。用该结合物处理乳腺癌MCF-7细胞，大大地提高了药物的化疗效果。Farokhzad等人(Cancer Res, 2004,64 (21) :7668-7672)以核酸适体 AlO作为“靶向载体”，通过PEG与包裹有模型药物右旋糖酐的纳米粒相连构成适体-PEG-纳米粒复合物，由于适体AlO的存在，使得前列腺癌LNCaP细胞(PSMA+)对该结合体的吸纳能力比没有适体的PEG-纳米粒复合物提高了 77倍。尽管这些方法部分实现了药物的靶向， 但是这些技术都是基于高分子材料表面修饰核酸，因此会带来一定的免疫原性。另外这里用到的核酸通常为几十个碱基的片段，其靶向性有一定的局限性。同时，由于核酸适体的立体结构与纳米粒的大小相比有几十倍甚至几百倍的差距，因此当利用核酸适体导向纳米粒至靶向部位，其局限性也是显而易见的。
发明内容
本发明的技术目的在于提供一种包裹药理活性物质的核酸纳米粒的制备方法。为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案为一种制备用于包裹药理活性物质的核酸纳米粒的方法，包括以下步骤(a)环化单链DNA引物；(b)以步骤(a)中所述的DNA引物为模板，利用滚环复制扩增核酸形成具有高度重复序列的球形或者近球形结构；(c)在加热条件下将药理活性物质加入步骤(b)中所述的球形或者近球形结构中，形成核酸纳米粒。本发明技术方案中所述的核酸纳米粒平均粒径为50 300nm。
本发明技术方案中所述的核酸纳米粒可包载占核酸纳米粒总重量 20%的药理活性物质。本发明技术方案所述的药理活性物质是紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、卡莫司汀、阿霉素、苯芥胆留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黄酸、冬凌草甲素、鬼臼毒素、环磷酰胺、博莱霉素、道诺霉素、表柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、钼、长春碱、丝裂霉素-C、依托泊苷。其中，优选的药理活性物质是紫杉醇，多西紫杉醇、阿霉素或者是他们的组合。本发明技术方案中所述的单链DNA引物的序列是CTCTACTACCTTCTCCCTCCCACAAAC GCAAACCCACTACCACCAAAC。本发明技术方案中所述的步骤(c)的操作温度为60 100°C。本发明的技术方案的方法进一步包括(d)除去步骤(C)所得纳米粒水溶液中多余的小分子。本发明的技术方案的方法进一步包括(e)将纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂。其中，所述的脱水的步骤是冷冻干燥、喷雾干燥或减压蒸馏。下面是对本发明技术方案的进一步描述本发明技术方案进一步提出了一种制备用于体内递送紫杉醇核酸纳米粒的方法， 所述方法包含以下几个步骤(a)环化单链DNA引物；(b)以步骤(a)中所述的DNA引物为模板，利用滚环复制扩增核酸形成具有高度重复序列的球形或者近似球形结构；(c)在加热条件下将紫杉醇加入步骤(b)中所述的球形或者近球形结构中，形成核酸纳米粒。(d)除去步骤(c)中所得纳米粒水溶液中多余的小分子。(e)将纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂。这里制得的纳米粒平均粒径为50 300nm，可包载占粒子总重量约1 20%的药理活性物质。其中本发明技术方案中所述的单链DNA引物的序列是CTCTACTACCTTCTCCCTCCC ACAAACGCAAACCCACTACCACCAAAC。本发明技术方案进再一步提出了一种制备用于体内递送多西紫杉醇核酸纳米粒的方法，所述方法包含以下几个步骤(a)环化单链DNA引物；(b)以步骤(a)中所述的DNA 引物为模板，利用滚环复制扩增核酸形成具有高度重复序列的球形或者近似球形结构；(c) 在加热条件下将多西紫杉醇加入步骤(b)中所述的球形或者近球形结构中，形成核酸纳米粒。(d)除去步骤(c)中所得纳米粒水溶液中多余的小分子。(e)将纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂。这里制得的纳米粒平均粒径为50 300nm，可包载占粒子总重量约1 20%的药理活性物质。其中本发明技术方案中所述的单链DNA引物的序列是CTCTACTACCT TCTCCCTCCCACAAACGCAAACCCACTACCACCAAAC。本发明技术方案进再一步提出了一种制备用于体内递送阿霉素核酸纳米粒的方法，所述方法包含以下几个步骤(a)环化单链DNA引物；(b)以步骤(a)中所述的DNA引物为模板，利用滚环复制扩增核酸形成具有高度重复序列的球形或者近似球形结构；(c)在加热条件下将阿霉素加入步骤(b)中所述的球形或者近球形结构中，形成核酸纳米粒。(d) 除去步骤(c)中所得纳米粒水溶液中多余的小分子。(e)将纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂。这里制得的纳米粒平均粒径为50 300nm，可包载占粒子总重量约1 20%的药理活性物质。其中本发明技术方案中所述的单链DNA引物的序列是CTCTACTACCTTCTCCCTCCCACAAACGCAAACCCACTACCACCAAAC。对本发明所述技术方案的进一步说明本发明所制备的核酸纳米粒平均粒径分布于50nm到300nm。而且，本发明所制备的纳米粒能够结合高达20%的药理活性物质。本发明中所述的将药理活性物质包入核酸，指的是药理活性物质可以通过核酸的展开和再折叠，进入核酸中心区域。一般来说，药理活性物质包括在给病人服用时，能够产生药理反应的任何的物质。本发明中的药理活性物质包括疏水和亲水的化合物。本领域技术人员清楚疏水性药理活性物质的水溶性不好，亲水性药理活性物质能够顺利的溶解在水中。疏水性的药理活性物质包括如下的化合物，但是不仅仅限于此抗肿瘤药物，心血管药物，抗炎药物，降糖药物，中枢神经系统药物，免疫抑制药物，以及抗病毒药物。本发明涉及的药理活性物质可以包括，但是不仅仅局限于此紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥胆留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黄酸、冬凌草甲素、鬼臼毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非诺贝特、硝苯地平、布洛芬、喷哚美辛、吡罗昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齐拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韦、利托那韦、 Telaprevir、洛匹那韦，环磷酰胺、博莱霉素、道诺霉素、表柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶及其类似物、钼及其类似物、长春碱及其类似物、高三尖杉酯碱及其衍生物、放线菌素-D，丝裂霉素-C，依托泊苷以及它们的组合。在一个更优化的范围中，药理活性物质包括紫杉醇，阿霉素和多西紫杉醇。上述的药理活性物质包括晶体形式和无定形形式，其晶体形式包括带有结晶水和不带有结晶水的形式。本领域技术人员能够理解本发明中使用的药理活性物质的量会根据核酸的量的变化而变化，同时根据纳米粒的量的变化而变化。同时，有经验的人能够意识到本发明中使用的药理活性物质，可以是纯的物质，或者是混合物，这些都没有背离本发明的范围。本发明中，可以选择不同的核酸去形成本领域技术人员所感兴趣的纳米粒子。本发明中所涉及的核酸包括所有的能够展开并结合药理活性物质的核酸或者多肽。合适的核酸引物的例子包括如下，但是不仅仅局限于此CTCTACTACCTTCTCCCTCCCACAAACGCAAACCCAC TACCACCAAAC。关于本发明的进一步说明是，本发明中步骤(a)中环化单链DNA引物是指，用DNA 连接酶将单链的DNA引物分子链接形成环状DNA。步骤(b)中的滚环复制是指通过滚环复制的形式，复制扩增环化的DNA引物序列，扩增后的核酸序列具有多个环状DNA引物的重复序列。由于静电作用形成直径为10 400nm的球形结构。温度升高以后，稳定的球形结构被破坏形成线状不稳定体系。加入药理活性物质并降温，线状不稳定DNA由于氢键和静电场的作用，将药理活性物质包裹并形成直径为50 300nm的载药纳米粒。反应参数对于形成纳米粒来说，是非常重要的。一般来说，要获得一个理想的结果，本发明中的步骤(c)须在60°C到100°C范围之间反应。实验已经证明，要获得一个比较理想的结果。一般来说，本领域技术人员能够充分意识到，反应过程和反应过程的每一个步骤都需要充足的时间，举一个例子，反应过程需要5分钟到8小时不等。本发明可能另外需要一个步骤(d)除去步骤(C)所得纳米粒水溶液中多余的小分子化合物。一般来说，这个步骤包括任意的能够将小分子从纳米粒中分离出去的方法，本领域技术人员能够充分意识到分离的方法包括任意的能够纯化核酸的方法。这些方法可包括盐沉淀，透析，层析以及它们的组合，这些方法可以适当的选择。一个更加精细的范围，透析是可行的。本发明可能还需要一个步骤(e)将纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂。一般来说，保护的方法包括给纳米粒脱水以方便储存和运输，以致获得合适的剂型。本发明所涉及的保护的方法包括离心，减压干燥，冻干，喷雾干燥。本领域技术人员能够意识到本发明的范围和精髓是变动的。核酸的选择是变化的，同时许多的药理活性物质是可使用的。本发明将会在下面的实施例中得到更加明确和清晰地描述。本发明的有益效果在于首先，经本发明提供的方法形成的纳米粒子可以达到90%的包封率，超过现有技术，形成了一种高效低耗的方法；其次，本发明所提供的方法能够获得最高达20%的载药量，即纳米粒中含有20%的药理活性物质。由于有更高的载药量，在治疗时，可以获得更小的用药体积，更短的用药时间，对病人更方便。较高的载药量降低了递送药理活性物质时核酸的使用量，提高了产品的成本效率；最后，现有技术提供的较低载药能力不能满足高剂量给药，因为高剂量的给药需要很大的给药体积。然而，本实验发明的具有高载药能力的纳米粒不会受给药体积的限制。通过本发明制备的纳米粒的另一个有益效果是，纳米粒能够特异性的递送药理活性物质。通过本发明制备的纳米粒子能够靶向一些身体器官和系统。比如，当用核酸适体作为载体时，它们对肿瘤细胞表面有亲和性，可以特异性的将药理活性物质输送到肿瘤组织。 因此可以说，本发明提供了一种高效低耗的方法来输送药理活性物质到身体的不同部位。
图1琼脂糖凝胶电泳图。从左至右分别是Marker，滚环复制后的球形DNA，环状 DNA和单链DNA引物。图2紫杉醇-核酸纳米粒子直径分布3紫杉醇-核酸纳米粒原子力显微镜照片图4紫杉醇-核酸纳米粒投射电镜图片
具体实施例方式以下均是基于本发明的代表性实施例，但下述实施例不会在任何方面限制本发明的保护范围。实施例1.环状DNA引物合成将5μ 7Κ，1μ1 IOx 反应缓冲液,0. 5 μ 1 ImM ATP, 0. 5 μ 1 50mM MnC12，2· 5 μ 1 100 μ M 线性 DNA (CTCTACTACCTTCTCCCTCCCACAAACGCAAACCCACTACCACCAAAC)和 0· 5 μ 1 DNA 环化连接酶混勻，在62°C下反应2小时，之后85°C反应15min，使环化酶酶失活。样品在-20°C保存。实施例2.滚环复制(RCA)将14. 1 μ 1 水，2. 5 μ 1 Phi29 缓冲液，2. 5 μ 1 25mM dNTPs，4 μ 1 1% BSA, 2. 5 μ 1100 μ M DTT, 2. 5 μ 1100 μ M DNA 模板，2. 5 μ 1 环状 DNA 引物和 0. 25 μ 1 lOOU/μ 1 Phi29 混勻，在37°C下反应3小时。用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测RCA反应产物(图1)。实施例3.紫杉醇-核酸纳米粒的制备取2. 5μ1 RCA反应产物，80°C反应持续两小时，结束后加入0. 6yL 25mM的紫杉醇(乙醇溶解)溶液，混合2分钟，放至到冰水混合物中，至悬液透明，载药粒子的平均粒径为 50 200nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer)。用反相 C18 柱测定紫杉醇的包封率，流动相为乙腈水(60 40)，检测波长227nm。HPLC分析表明本实验的载药量为1%。实施例4.多西紫杉醇-核酸纳米粒的制备取2. 5μ1 RCA反应产物，100°C反应持续两小时，结束后加入1.6yL 25mM的多西紫杉醇(乙醇溶解)溶液，混合2分钟，放至到冰水混合物中，至悬液透明，载药粒子的平均粒径为 80 300nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer)。用反相 C18 柱测定多西紫杉醇的包封率，流动相为乙腈水(60 40)，检测波长227nm。HPLC分析表明本实验的多西紫杉醇载药量为20%。实施例5.阿霉素-核酸纳米粒的制备取2. 5μ1 RCA反应产物，100°C反应持续两小时，结束后加入l.OyL 25mM的阿霉素(乙醇溶解)溶液，混合2分钟，放至到冰水混合物中，至悬液透明，载药粒子的平均粒径为 80 200nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer)。HPLC 分析表明本实验的阿霉素包率达到90%以上。冻干的样品能复溶，HPLC分析载药量为8. 34%。实施例6.紫杉醇-核酸纳米粒的动态光散射(dynamic light scaterring, DLS) 分析对按照本发明的方法制备的紫杉醇-核酸纳米粒进行粒径分析，所用仪器为原子力显微镜。结果如图3所示，纳米成球形或者近球形结构。实施例7.紫杉醇-核酸纳米粒的透射电镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)表征按照本发明制备的紫杉醇-核酸纳米粒进行透射电镜的分析。所用仪器为EM 2100型200KV高分辨率透射电镜(日本)。结果如图4所示，显示纳米粒子呈球形。
权利要求
1.一种包裹药理活性物质的核酸纳米粒的制备方法，其特征是(a)环化单链的DNA引物；(b)以步骤(a)中所述的DNA引物为模板，利用滚环复制扩增核酸形成具有高度重复序列的球形或者近似球形结构；(c)在加热条件下将药理活性物质加入步骤(b)中所述的球形或者近似球形结构中， 形成核酸纳米粒。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核酸纳米粒的平均粒径为50nm 300nmo
3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的药理活性物质在纳米粒中所占的重量比是 20%。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的药理活性物质是紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素或者是他们的组合。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的单链DNA引物是CTCTACTACCTTCTCCCTCC CACAAACGCAAACCCACTACCACCAAAC。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(c)的操作温度为60 100°C。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于所述的方法进一步包括(d)除去 (c)中所得纳米粒水溶液中的多余小分子。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于所述的方法进一步包括(e)将纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于所述的脱水步骤是冻干，减压蒸馏或喷雾干燥。
全文摘要
本发明涉及一种包裹药理活性物质的核酸纳米粒的制备方法。本发明利用DNA滚环复制原理制备具有大量重复序列的核酸球形或者类球形结构，然后将药理活性物质包入，形成纳米粒，用于体内递送。
文档编号A61K31/704GK102309457SQ20111019575
公开日2012年1月11日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者吴锦慧, 王永毅, 陈晶 申请人:南京从一医药咨询有限公司