专利名称：一种猪繁殖与呼吸综合症病毒m蛋白与cd40l融合疫苗及制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药基因重组领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗及制备方法。
背景技术：
M蛋白是PRRSV结构蛋白中最保守的蛋白，它有一个短肽段(18aa)暴露于病毒粒子表面，可能与病毒的聚集和结合有关。M蛋白聚集于粗面型内质网上，并与GP5形成异源二聚体，在病毒对肺泡巨噬细胞附着和病毒侵染过程中起重要作用。M蛋白具有很强的免 疫原性，感染后IOd即可激发产生可检测的抗体应答，表达的重组M蛋白可以作为血清学试验的靶抗原和亚单位疫苗，M蛋自在细胞免疫中起重要作用。CD40L具有刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖，诱导B淋巴细胞分化。此外，它还作用于抗原呈递细胞(APC)，促进⑶28、B7-1和B7-2等免疫共刺激分子的表达，提高APC的抗原递呈能力，增强免疫应答反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗及制备方法，用于PRRSV感染的预防及治疗。本发明的目的是通过以下技术方案来实现一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与⑶40L融合疫苗，是一种基因重组融合多肽，该多肽含有PRRSV的M蛋白和⑶40L的主要氨基酸序列。上述猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与⑶40L融合疫苗的制备方法，包括以下步骤I)采用基因重组技术将PRRSV的M基因与⑶40L的cDNA基因连接形成融合基因；2)将融合基因克隆到原核表达载体pET30a的克隆位点上，通过IPTG诱导表达，液相色谱纯化重组融合蛋白。本发明的有益效果为用重组融合蛋白的混合弗氏免疫佐剂皮下接种猪，检测特异性IgG抗体和中和抗体滴度，验证重组融合蛋白的体液免疫水平；细胞免疫是抗细胞内感染免疫的主要形式，此重组PRRSV疫苗通过将M蛋白与CD40L的融合，能刺激机体产生抗PRRSV的细胞免疫；免疫后进行攻毒实验，结果证实可以有效地抑制PRRSV感染，降低受感染的猪的死亡率；此外，该融合蛋白抗原特异性高，不会引起非特异性免疫反应，可作为预防和治疗性疫苗在临床的应用。
图I为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的M蛋白质氨基酸序列；图2为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的M基因核苷酸序列；图3为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的CD40L蛋白质氨基酸序列；图4为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的CD40L基因核苷酸序列；图5为本发明实施例所述的 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的M-CD40L融合蛋白质氨基酸序列；图6为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的M-⑶40L融合基因核苷酸序列。
具体实施例方式本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗，是一种基因重组融合多肽，该多肽含有PRRSV的M蛋白和⑶40L的主要氨基酸序列，所述M蛋白氨基酸序列如附图I所示，所述CD40L的主要氨基酸序列如附图3所示；M基因核苷酸序列如附图2所示，CD40L基因核苷酸序列如附图4所示，M-CD40L融合蛋白氨基酸序列如附图5所示，M-⑶40L融合基因核苷酸序列如附图6所示。实施例IM基因克隆到原核表达载体pET30aI、设计M基因引物参考PRRSV的M基因序列(GenBank号DQ379480)设计扩增PRRSV病毒的M基因引物如下，引入酶切位点为EcoR I和Xho I (用斜体表示)M-F-E :GC GAATTC ATGGGGTCGTCCTTAGATGA,M-R-X GCTTATTTGGCATATTTGACAAG。2、提取 PRRS 病毒 RNAMarc-145 细胞感染 PRRSV 毒株为 VR2332，48 小时后(48hpi)，根据 invitrogen 公司的RNA提取试剂盒，从感染病毒的Marc-145细胞中提取总RNA。3、PRRSV的M基因的反转录及PCR根据invitrogen公司的RT-PCR试剂盒进行反转录，获得M-mRNA的cDNA。然后根据上述弓I物为PCR扩增M基因。PCR反应条件如下94°C 4分钟；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 45秒；共30循环；720C 10分钟。结果得PCR产物约为525bp的目的片段。4、阳性重组质粒pET30a_M的获取I %琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，按下列体系用EcoR I和Xho I双酶切回收PCR产物及载体pET30a质粒
权利要求
1.一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与⑶40L融合疫苗，是一种基因重组融合多肽，其特征在于该多肽含有PRRSV的M蛋白和CD40L的主要氨基酸序列，所述M蛋白氨基酸序列如附图I所示，所述CD40L的主要氨基酸序列如附图3所示。
2.权利要求I所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)采用基因重组技术将PRRSV的M基因与⑶40L的cDNA基因连接形成融合基因； 2)将融合基因克隆到原核表达载体pET30a的克隆位点上，通过IPTG诱导表达，液相色谱纯化重组融合蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗及制备方法，猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗是一种基因重组融合多肽，该多肽含有PRRSV的M蛋白和CD40L的主要氨基酸序列；用基因重组技术将M基因与免疫共刺激分子CD40配体(CD40L)连接成重组融合蛋白，并将融合基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中，IPTG诱导并表达重组融合蛋白，通过包涵体纯化重组蛋白。本发明的有益效果为重组融合蛋白可用于PRRSV感染的预防及治疗。
文档编号A61K39/12GK102908617SQ201110223200
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者李帅伟, 庞程 申请人:广州格拉姆生物科技有限公司