专利名称：一种用于防治奶牛生殖道感染的微生态制剂的制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种可以预防和治疗奶牛生殖道感染的微生态制剂，具有抗菌、无毒、无副作用、无残留、易于生殖道定植的特点，还可提高母畜产雌性家畜的几率，可广泛应用于防治奶牛生殖道感染。
背景技术：
在临床上，由于奶牛阴道的生理性和病理性损害，而导致的奶牛生殖道感染，以及继发性的生殖道病变，是非常普遍的现象。预防和治疗生殖道疾病，现今国内兽药市场，均使用化学合成类药物，治疗效果虽然显著，但导致了动物机体产生了耐药性，畜产品内有药物残留，对人体的健康造成了严重的威胁。寄生于正常奶牛阴道内的微生物群有真菌、原虫和病毒等，主要栖居在阴道的黏膜及皱褶处，乳酸菌是阴道正常菌群中数量较多、最重要的常住菌群，在维持阴道微生态平衡中起重要作用。张维军等(健 康奶牛产道内正常菌群的研究，家畜生态学报，第27卷第4期，2006)从奶牛产道分离细菌150株，其中乳酸杆菌46株，表皮葡萄球菌39株，无乳链球菌21株，大肠杆菌23株，芽孢杆菌8株，棒状杆菌5株，念珠菌8株；邓洪宇等(奶牛阴道嗜酸乳杆菌的分离鉴定，现代畜牧兽医，2009年第7期)从奶牛阴道中筛选出一株产酸革兰氏阳性杆菌。虽然对奶牛阴道菌群组成有了一定的认识，但关于其在防治奶牛生殖道感染的应用研究还未见报导。本发明利用以菌治菌的原理，将健康奶牛阴道内最具有优势的乳酸菌分离出来，再回归到患有疾病的动物体内，既利于菌株的定植，又有抑制病原菌的作用，并且克服了化学药物对机体的损害，解决了药物在机体内的残留问题，而且利于奶牛产母畜。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种可以预防和治疗奶牛生殖道感染的微生态制剂，与抗生素类药物相比，具有抗菌、无毒、无副作用、无残留、易于生殖道定植的特点，还可提高母畜产雌性家畜的几率，可广泛应用于防治奶牛生殖道感染的药物。本发明使用鉴别性培养基和经典的微生物学分离鉴定方法以及分子生物学鉴定方法，将健康奶牛阴道内最具有优势的乳酸菌分离、鉴定出来，此举主要便于乳酸菌对奶牛生殖道系统的回归定植，然后选择最佳的两种乳酸菌，通过小鼠的安全性检测，检测其无毒，在将其进行对病原菌拮抗性的检测，结果显示拮抗效果明显，而后摸索出此两菌种的工艺过程及制剂剂型，最后用于动物体，用以预防和治疗奶牛生殖道的感染。为了方便公众获得，该两株乳酸菌可以通过国内商业渠道购买，分别为双奇公司的SQ00048和SQ00054乳酸菌。本发明的优点在于:此两株乳酸菌性能优良，发酵用时短，产酸量大，冻干稳定性较好，活菌数较多，且无毒、拮抗效果明显。尤其SQ00048菌株具有产过氧化氢的特点；此菌株所作的微生态制剂，无毒、无副作用、拮抗效果明显，用于动物体无残留，且增加母畜的产雌性几率，具有良好的预防治疗效果；制备方法实用性强、操作简单、周期短、步骤简便合理，具有成本低、产率高、适宜规模化生产等优点。本发明的一个目的是提供一种用于防治奶牛生殖道感染的微生态制剂的制备方法，具体步骤为:将SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和辅料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例充分混合，制成片剂、胶囊及散剂。其中，SQ00048的菌粉的制备过程为:SQ00048的最佳发酵时间为8h，发酵温度为40°C，厌氧培养；将所得发酵液15000g离心30分钟，弃去上清液，得到湿菌泥，加入保护剂，搅拌均匀，倾注进冻干机中冻干，得到白色粉末状菌粉；其中，SQ00048的最佳发酵培养基:1.2%乳糖，0.8%牛肉膏，0.4%柠檬酸三胺，0.4%乙酸钾，0.04%硫酸镁，0.05% L-半胱氨酸盐酸盐，0.08%吐温-80。其中，SQ00054的菌粉的制备过程为:SQ00054的最佳发酵时间为8h，发酵温度为40°C，厌氧培养；将所得发酵液15000g离心30分钟，弃去上清液，得到湿菌泥，加入保护剂，搅拌均匀，倾注进冻干机中冻干，得到白色粉末状菌粉；其中，SQ00054的最佳发酵培养基^^蔗糖^^^牛肉膏，。.25%磷酸氢二钠，0.25 %磷酸二氢钾，0.01 %硫酸镁，0.05 % L-半胱氨酸盐酸盐，0.1 %吐温-80。在本发明一个具体技术方案中，保护剂成分及添加比例为:在300ml体系中加入20ml 50%脱脂奶粉，5ml 5%蔗糖。在本发明的一个具体技术方案中，将SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和辅料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例充分混·合，用压片机压制成两面扁平的片剂，平均片重0.4g，片剂Ig重活菌数为200亿左右，成年奶牛的用量为I日2片，7日为I疗程。在本发明的一个具体技术方案中，将SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和辅料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例充分混合，装在以明胶为主要原料制成的圆筒状胶壳中的胶囊中，胶囊体积为0.48ml，I胶囊体积活菌数为200亿左右，成年奶牛的用量为I日2粒，7日为I疗程。在本发明的一个具体技术方案中，将SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和辅料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例均匀充分混合，烘干、过筛，制成的干燥粉末状散剂，成年奶牛的用量为I日lg，7日为I疗程。本发明的另一个目的是提供一种前述方法制备出来的防治奶牛生殖道感染的微生态制剂。以上概括的描述了本发明，可通过参照本文提供的某些具体实施例进一步理解本发明，这些实施例仅是为了说明而不是限制本发明。
图1:SQ0048和大肠杆菌混合培养图，横轴代表培养时间，纵轴代表活菌数，乳酸菌和病原菌混合培养时的培养比例设定为1:1和10: I ;A-SQ0048空白对照；B-与SQ0054以1:1比例混合培养；C-与大肠杆菌以1:1比例混合培养；D-与SQ0054以10: I比例混合培养；E-与大肠杆菌以10: I比例混合培养；F-大肠杆菌空白对照。图2:SQ0048和金黄色葡萄球菌混合培养图，横轴代表培养时间，纵轴代表活菌数，乳酸菌和病原菌混合培养时的培养比例设定为1:1和10:1 ；A-SQ0048空白对照；B-与SQ0054以1:1比例混合培养；C-与金黄色葡萄球菌以1:1比例混合培养；D-与SQ0054以10:1比例混合培养；E-与金黄色葡萄球菌以10: I比例混合培养；F-金黄色葡萄球菌空白对照。图3:SQ0054和大肠杆菌混合培养图，横轴代表培养时间，纵轴代表活菌数，乳酸菌和病原菌混合培养时的培养比例设定为1:1和10: I ;A-SQ0054空白对照；B-与SQ0048以1:1比例混合培养；C-与大肠杆菌以1:1比例混合培养；D-与SQ0048以10: I比例混合培养；E-与大肠杆菌以10: I比例混合培养；F-大肠杆菌空白对照。图4:SQ0054和金黄色葡萄球菌混合培养图，横轴代表培养时间，纵轴代表活菌数，乳酸菌和病原菌混合培养时的培养比例设定为1:1和10: I ;A-SQ0054空白对照；B-与SQ0048以1:1比例混合培养；C-与金黄色葡萄球菌以1:1比例混合培养；D-与SQ0048以10:1比例混合培养；E-与金黄色葡萄球菌以10: I比例混合培养；F-金黄色葡萄球菌空白对照。图5:SQ0048、SQ0054和大肠杆菌混合培养图，横轴代表培养时间，纵轴代表活菌数，乳酸菌和病原菌混合培养时的培养比例设定为1:1和10:1 ;A-SQ0048和SQ0054总体空白对照；B-SQ0048和SQ0054以1:1比例混合培养；C_与大肠杆菌以1:1比例混合培养；D-SQ0048和SQ0054以10:1比例混合培养；E_与大肠杆菌以10: I比例混合培养；F-大肠杆菌空白对照。图6:SQ0048、SQ0054和金黄色葡萄球菌混合培养图，横轴代表培养时间，纵轴代表活菌数，乳酸菌和病原菌混合培养时的培养比例设定为1:1和10: 1;A-SQ0048和SQ0054总体空白对照；B-SQ0048和SQ0054以1:1比例混合培养；C_与金黄色葡萄球菌以1:1比例混合培养；D-SQ0048和SQ0054以10:1比例混合培养；E_与金黄色葡萄球菌以10: I比例混合培养；F-金黄色葡萄球菌空白对照。
具体实施方式
实施例1.奶牛阴道内优势乳酸菌的分离鉴定首先经过的物料采集，菌落计数，菌体分离及数据分析，初步确定了健康及病变情况下奶牛牛阴道内菌体的分布情况。通过鉴别性培养基分离出55株乳酸菌，将分离的乳酸菌再次经过筛选，选出更为优良的8株乳酸菌进行了生理生化及分子生物学鉴定，这些乳酸菌在牛阴道内为优势种群，从中选择最佳的两株乳酸菌，这两株乳酸菌的生物学鉴定结果如下。为了方便公众获得，该两株乳酸菌可以通过国内商业渠道购买，分别为双奇公司的SQ00048和SQ00054乳酸菌。(I)乳酸菌I (双奇公司SQ00048菌株)的生物学鉴定a、菌株的鉴定生理生化鉴定:菌落呈规则圆形，边缘不整齐，突起，表面光滑湿润有光泽，菌落颜色初期为淡黄色，后期为灰白色，大小约为2_左右；革兰氏阳性杆菌，菌体较细、较短。长:2.97-5.38um宽:1.20-1.39um ;菌体无芽孢，不运动，触媒呈阴性，产过氧化氢；兼性厌氧；液体发酵呈均匀混浊状，底部菌体沉淀呈淡黄色；糖发酵结果附后。糖发酵结果
权利要求
1.一种用于防治奶牛生殖道感染的微生态制剂的制备方法，具体步骤为:将SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和辅料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例充分混合，制成片剂、胶囊及散剂。
2.根据权利要求1所述的微生态制剂的制备方法，其中SQ00048的菌粉的制备过程为: SQ00048的最佳发酵时间为8h，发酵温度为40°C，厌氧培养；将所得发酵液15000g离心30分钟，弃去上清液，得到湿菌泥，加入保护剂，搅拌均匀，倾注进冻干机中冻干，得到白色粉末状菌粉；其中，SQ00048的最佳发酵培养基:1.2%乳糖，0.8%牛肉膏，0.4%柠檬酸三胺，0.4%乙酸钾，0.04%硫酸镁，0.05% L-半胱氨酸盐酸盐，0.08%吐温-80。
3.根据权利要求1所述的微生态制剂的制备方法，其中SQ00054的菌粉的制备过程为: SQ00054的最佳发酵时间为8h，发酵温度为40°C，厌氧培养；将所得发酵液15000g离心30分钟，弃去上清液，得到湿菌泥，加入保护剂，搅拌均匀，倾注进冻干机中冻干，得到白色粉末状菌粉；其中 ，SQ00054的最佳发酵培养基^^蔗糖^^^牛肉膏，。.25%磷酸氢二钠，0.25 %磷酸二氢钾，0.01 %硫酸镁，0.05 % L-半胱氨酸盐酸盐，0.1 %吐温-80。
4.根据权利要求2-3所述的微生态制剂的制备方法，其中保护剂成分及添加比例为:在300ml体系中加入20ml 50%脱脂奶粉，5ml 5%蔗糖。
5.根据权利要求1所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，将SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和辅料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例充分混合，用压片机压制成两面扁平的片剂，平均片重0.4g，片剂Ig重活菌数为200亿左右，成年奶牛的用量为I日2片，7日为I疗程。
6.根据权利要求1所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，将SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和辅料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例充分混合，装在以明胶为主要原料制成的圆筒状胶壳中的胶囊中，胶囊体积为0.48ml, I胶囊体积活菌数为200亿左右，成年奶牛的用量为I日2粒，7日为I疗程。
7.根据权利要求1所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，将SQ00048菌粉和SQ00054菌粉和辅料乳糖、蔗糖，按照1:1的比例均匀充分混合，烘干、过筛，制成的干燥粉末状散剂，成年奶牛的用量为I日lg，7日为I疗程。
8.根据权利要求1-7所述方法制备出来的防治奶牛生殖道感染的微生态制剂。
全文摘要
本发明的一个目的在于提供一种可以预防和治疗奶牛生殖道感染的微生态制剂。通过将健康奶牛阴道内最具有优势的乳酸菌分离出来并进行鉴定，然后选择最佳的两种乳酸菌，通过小鼠的安全性检测，检测其无毒，在将其进行对病原菌拮抗性的检测，结果显示拮抗效果明显。采用这两株菌种为原料，将其发酵制备成菌粉后混合，再回归到患有疾病的动物体内，既利于菌株的定植，又有抑制病原菌的作用，并且克服了化学药物对机体的损害，解决了药物在机体内的残留问题，而且利于奶牛产母畜。
文档编号A61P31/00GK103070890SQ201110231919
公开日2013年5月1日 申请日期2011年8月15日 优先权日2011年8月15日
发明者黄少磊, 刘彦民, 龚虹, 付艳茹, 刘斌, 冯谦, 夏少明, 张春霞, 邰海欧 申请人:内蒙古双奇药业股份有限公司