专利名称：十七个大鼠源miRNA及其相应的miRNA前体和反义寡核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学专业领域，涉及属于大鼠源miRNA的十七个新miRNA、miRNA 前体和其反义寡核苷酸序列，以及在制备治疗神经再生药物中的用途。
背景技术：
周围神经损伤是常见的临床病症，而周围神经损伤后能够再生。miRNACmicroRNA, 微RNA)是一类具有19 25nt的RNA分子，由其前体分子在酶的作用下加工生成，其前体序列一般为70 120nt，广泛存在于生物体中。由于miRNA在各种生物体中具有保守性， 因此普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程；在动物机体，miRNA通过转录后调控许多基因和蛋白的表达，在发育、分化、增殖、细胞的存活与癌变以及神经系统等发挥重要作用。基础和临床研究表明，miRNA无论在正常生理过程还是在疾病过程中都是重要的调节因子。许多miRNA呈现组织特异性表达，因此在调控组织特异性和组织特异性基因的功能中发挥重大作用。近年来的研究发现miRNA与神经再生有着极为密切的关系，例如， miRNA在轴突生长及突触功能和可塑性等方面具有调控作用。虽然已经在各种生物发现了相当数量的miRNA，但仍不断有许多新的miRNA被挖掘，特别是那些在特定组织或特定阶段表达的miRNA。周围神经损伤和再生过程中，许多基因和蛋白的表达水平发生改变，而单个miRNA能够调控成千上百个靶基因的表达，因此作为转录后调控的miRNA的发现和功能鉴定对基于miRNA的周围神经损伤的修复具有十分重要的意义。
发明内容
由于各种意外造成的神经损伤的发病率逐年增加；而神经损伤后，再生能力差，致残率高，因此本发明针对神经损伤和治疗的生物分子的发现具有重要的应用价值。本发明以大鼠坐骨神经离断后的L4-6背根神经节和近端神经为材料进行miRNA 的Solexa测序。测序结果经过SOAP软件与大鼠基因组序列比对，MIREAP软件分析miRNA 前体的发夹结构，滤掉自由能大于-20 kcal/mol的候选miRNA，基于miRBaSel7.0过滤掉已报道的miRNA，MiPred软件进一步过滤掉功能上非保守的虚拟的miRNA前体等生物信息学分析，并进一步通过RT-PCR验证。然后对这些新的miRNA进行功能筛选，结果发现了十七个与增殖和迁移有关的miRNA。本发明所提供的miRNA克隆自大鼠坐骨神经离断后的L4-6 背根神经节和近端神经，成熟miRNA序列长度约为22nt，其前体序列具有miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA的结构特征。本发明的目的是提供十七个新的miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸序列，以及该发明所涉及的miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸在制备神经损伤药物中的用途。本发明的具体技术方案如下
本发明所提供的十七个大鼠源miRNA包含如下任一种序列
(l)miRNA-sxl 5' AACAG⑶GAUCUUCAAGUAGA ，染色体定位 xq21
5(2)miRNA-sx2
(3)miRNA-sx3
(4)miRNA-sx4
(5)miRNA-sx5
(6)miRNA-sx6
(7)miRNA-sx7
(8)miRNA-sx8
(9)miRNA-sx9
(10)miRNA-sxlO
(11)miRNA-sxll
(12)miRNA-sxl2
(13)miRNA-sxl3
(14)miRNA-sxl4
(15)miRNA-sxl5
(16)miRNA-sxl6
(17)miRNA-sxl7
5' UGGGGGACAGGGCAAGGUGG ,染色体定位 lql2 5' UGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGA ，染色体定位 19p 11 5' AUGUAAGUGUGUAUGUAUAUG，染色体定位 17ql2. 3 5' UAGGCUAGAAAGAGGUUGGGGA，染色体定位 lql2 5' UGAGGAUUACGAAGAGGAUGGU，染色体定位 5q35 5' GGUGGUGCAGGCAGGAGAGC，染色体定位lq32
5 ‘ ACCCGUCCCGUUCGUCCCCGGA,染色体定位 6ql 1 5' GGAGUUGGAGGUGAUCGUGAGC，染色体定位 10q24 5 ‘ UGGGGCACUCAGGAGGCUGCAG,染色体定位 1 lq23 5 ‘ UUGGGAGGAGCAGCUGAGGGA,染色体定位 2q34 5' UUGUGGCAACAAUGGCACGGCA，染色体定位 3q35 5' CAGGGUUACCUGUUGAGCUGC，染色体定位 3q35 5' CACAGCGGAGCUGGGCACUGGCGU，染色体定位 5q36 5' AUGGUAAUGGUGGUGGUGAUGG，染色体定位 8q24 5' AAUGUGACUCAGCUAUCUGAAC，染色体定位 8q24 5' UGGGGGCAGGCCGGAUCUA⑶G，染色体定位 xq21。
据此，本发明所提供的十七个大鼠源miRNA的前体RNA包含如下序列
(1)miRNA-sxl前体
5 ‘ CAAUUCUGAAAACAG⑶GAUCUUCAAGUAGAAAAAACACAAAAAAGG CA ⑶ UUUCUAUUUGAA ⑶ CAUCUCUUCUCCCUUUAA
(2)miRNA-sx2前体
5 ‘ GAGGCCA⑶UUGGGGGACAGGGCAAGGUGGGCAGUAGCUGACAGCCU GUUUACACUUGCCCUUUUUUCCCCAGGCUAUA⑶UCGGUU⑶GGCAGA
(3)miRNA-sx3前体
5 ‘ CGGAAUUCACUGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGACAGGAGACUAGAGAGU CUGCUUUGCCAUCUCUCUUGCAGGCAUGUGCCU
(4)miRNA-sx4前体
5 ‘ AUGUGUGUAUAUGUAAGUGUGUAUGUAUAUGUGUUUAUAUGAAUAUAC AUAUACAUACUCACGCACACAUACACGCAA
(5)miRNA-sx5前体
5 ‘ AUCGAUCCCCAUCCCAGCUUCCUUCCAGCCCUUGAU⑶UUCAGUAUG CACAUAGGCUAGAAAGAG⑶UGGGGAUGGGGAAAGA
(6)miRNA-sx6前体
5 ‘ UAAAACGGA⑶GAGGAUUACGAAGAGGAUGGUGUGGCUUUAAUAUUAG AACUUUACAGCAUCCUCUUCAUAAUCUUUACUCC⑶UUUAC
(7)miRNA-sx7前体
5 ‘ G⑶GGGGCUGG⑶GGUGCAGGCAGGAGAGCCAUUGAUCUAUUGC GGGCUCUACUCCCUGCCCCAGCCAGAGCACCCC
(8)miRNA-sx8前体5 ‘ CGCCGGGCGCACCC⑶CCCGUUCGUCCCCGGAC⑶UGCUCUCUG CCCCGGGAACGUCGAGACUGGAGCGCCCGAACUG
(9)miRNA-sx9前体
5 ‘ AGC⑶GAGCUGGA⑶UGGAG⑶GAUC⑶GAGC⑶GAAGACUGU GGUUGCCACAAGCACUUCCAACUGCAGAGCCACGCUC
(10)miRNA-sxlO前体
5 ‘ G⑶GGCCGA⑶GGGGCACUCAGGAGGCUGCAGCGACCCCG⑶C CUUGCUGCUGCUCCCCAGCACCCCUUUCGGCUCCCU
(11)miRNA-sxll前体
5 ‘ UUCCAGUUCAUUGGGAGGAGCAGCUGAGGGAUGCCUUUAACUUUC CCUGUGGAAUCUGCUCUUCCCAGGUGGAGU
(12)miRNA-sxl2前体
5 ‘ UAGUG⑶UAGUACUCUGC⑶UGUGGCCGCAGCAACCUCG⑶UCGA AUCCGA⑶CACGGCAUU⑶GGCAACAAUGGCACGGCAAAGGGCGCUU
(13)miRNA-sxl3前体
5 ‘ AGACACCCGGCAGG⑶UACCUGUUGAGCUGCAGCAGAAAG⑶GA AUGCAGCCUCUG⑶CACCCUCCCCAGGAU⑶CA
(14)miRNA-sxl4前体
5 ‘ CAUCCUGACCCACAGCGGAGCUGGGCACUGGC⑶CACGCA⑶CCU UGUUGCCACCCCUGGCUCUGCUGGAUCUCAGGGCUGG
(15)miRNA-sxl5前体
5 ‘ CAUCAUCAUCAUCAUCAUCAUCAUCAUUAUCAUCAUCAUCAUGCAAAG UGAUGGUAAUG⑶GGUG⑶GAUGGUGGAGAUGAU
(16)miRNA-sxl6前体
5 ‘ GACAGUUUGCAAU⑶GACUCAGCUAUCUGAACA⑶CACCCCAAUGU CAGACAGCUGA⑶CACUCUGCAAAUU⑶CA
(17)miRNA-sxl7前体
5 ‘ CCUCAGUCCCUGGGGGCAGGCCGGAUCUAGUG⑶GACGAGAGAGC CCUAGAU⑶GGUCCCUGCGCCCAUAGGACAG⑶GAGC。
据此，本发明所提供的十七个大鼠源miRNA的反义寡核苷酸包含如下任一种序列
(l)mi RNA-sxl反义3S核苷酸5'UCUACUUGAAGAUCACCU⑶U(2)miRNA-sx2反义3S核苷酸5'CCACCUUGCCC腳CCCCCA(3)miRNA-sx3反义3S核苷酸5'UCUGCUCU⑶CAUUCUACCCACA(4)miRNA-sx4反义3S核苷酸5'CAUAUACAUACACACUUACAU(5)miRNA-sx5反义3S核苷酸5'UCCCCAACCUCUUUCUAGCCUA(6)miRNA-sx6反义3S核苷酸5'ACCAUCCUCUUCGUAAUCCUCA(7)miRNA-sx7反义3S核苷酸5'GCUCUCCUGCCUGCACCACC(8)miRNA-sx8反义3S核苷酸5'UCCGGGGACGAACGGGACGGGU(9)miRNA-SX9反义寡核苷酸5'
(10)miRNA-sx 10反义寡核苷酸
(11)miRNA-sxll反义寡核苷酸
(12)miRNA-sxl2反义寡核苷酸
(13)miRNA-sxl3反义寡核苷酸
(14)mi RNA-sx 14反义寡核苷酸
(15)mi RNA-sx 15反义寡核苷酸
(16)mi RNA-sx 16反义寡核苷酸
(17)miRNA-sxl7反义寡核苷酸
GCUCACGAUCACCUCCAACUCC
5 ‘CUGCAGCCUCCUGA⑶GCCCCA
5 ‘UCCCUCAGCUGCUCCUCCCAA
5 ‘UGCC⑶GCCAUUGUUGCCACAA
5 ‘GCAGCUCAACAGGUAACCCUG
5 ‘ACGCCAGUGCCCAGCUCCGCU⑶G
5 ‘CCAUCACCACCACCAUUACCAU
5 ‘GUUCAGAUAGCUGA⑶CACAUU
5 ‘CACUAGAUCCGGCCUGCCCCCA。本发明提供的miRNA及其前体序列、反义寡核苷酸序列也可采用化学合成的方法得到；为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征，可对其进行硫代修饰或甲氧基修饰，也可采取两种方法结合修饰。本发明提供的miRNA及其前体序列、反义寡核苷酸序列可用于制备治疗周围神经损伤修复的药物。可以以其单独或混合形式为有效组分配制成非肠道给药制剂，依据给药模式、受害者的体征以适量剂量给药，也可采用基因治疗的方法，以治疗或病毒为表达载体，使其在周围神经损伤部位高效表达。
具体实施例方式现将本发明结合具体实施例做进一步说明。1.动物模型构建和样品制备
成年雄性 SD 大鼠(180 220g)被麻醉后(10 mg/kg xylazine, 95 mg/kg keUamine, acepromazine 0.7 mg/kg),左后肢外侧坐骨神经被切开一个1 cm长的切口，然后皮肤被缝合。动物饲养在合适的温度和湿度条件下进行，每天12 h光照，自由饮水和采食。坐骨神经切断后的0，1，4，7和14天，处死大鼠，取大鼠坐骨神经离断后的L4-6背根神经节和坐骨神经缺口处向上0. 5 cm的近端神经用于分析。提取和Solexa测序
用1Trizol提取总RNA，Solexa测序送北京基因组研究所(BGI)进行。18 30 nt的小RNA经过凝胶纯化，连接到Solexa测序接头，连接产物被纯化、逆转录和PCR扩增。扩增产物经过凝胶纯化后进行测序，测序得到的图像文件被转换成数字信号，在移去杂质信号和接头序列后，结果被计算机分析处理。新miRNA的预测
从Solexa测序得到的小分子RNA序列首先用SOAP软件与大鼠基因组序列比对； MIREAP用来分析候选miRNA的发夹结构；滤掉自由能大于_20 kcal/mol的候选miRNA ； 基于miRBaSel7. 0，过滤掉已报道的miRNA ；MiPred进一步过滤掉功能上非保守的虚拟的 miRNA 前体(pre-miRNA)。RT-PCR 分析
同Solexa测序的小分子RNA用来进行定量RT - PCR分析；10 ng的RNA用茎环逆转录引物和TaqMan反转录试剂盒(ABI)逆转录到cDNA。然后进行PCR实验，用三蒸水作为阴性模板对照，进行PCR分析。
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对施万细胞的作用
根据miRNA成熟体的序列，分别设计合成了它们的mimic及inhibitor，用DMEM培养基培养施万细胞，利用Lipofectamine RNAiMAX (invitrogen)反转入细胞，对孔板 mimic 用量为 6 pmol, inhibitor 用量为 12 pmol, 96 孑L板 mimic 用量为 1. 2 pmol, inhibitor用量为2.4 pmol,培养液为无血清的DMEM，按说明书操作。5_8小时后加含 10%血清的完全培养液。培养36小时后，分别进行迁移和增殖实验。1)迁移实验运用Transwell小室(BD公司)进行迁移实验。首先在小室的下室面包被fibernection，然后将转染miRNA的施万细胞消化后调整细胞密度至1 X IO5种入 transwell中，上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0. 05%-0. 2% BSA。下室采用加入500μ1含FBS的培养基。常规培养M h后结晶紫染色，染色后Leica DC 300F 正置显微镜进行观察和拍照，随机选取10个视野计数细胞个数；也可以用醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm测其OD值，间接反映迁移细胞数。2)增殖实验运用BrdU ELISA KIT (Roche)进行增殖实验。具体实验步骤根据说明书，简单描述如下，将转染36小时的96孔板中的细胞中加入BrdU标记液，孵育4 h后固定，经一抗及二抗孵育后Leica DC 300F正置荧光显微镜进行观察和拍照，随机选取10 个视野计数细胞个数；也可以酶标仪上检测其OD值，间接反映增殖细胞数。
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权利要求
1.十七个大鼠源miRNA，其特征在于包含如下任一个miRNA序列(1)miRNA-sxl5' AACAG⑶GAUCUUCAAGUAGA，染色体定位 xq21(2)miRNA-sx2 5 ‘ UGGGGGACAGGGCAAGGUGG,染色体定位 lql2(3 ) miRNA-sx3 5 ‘ UGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGA，染色体定位 19p 11(4)miRNA-sx45' AUGUAAGUGUGUAUGUAUAUG，染色体定位 17ql2. 3(5)miRNA-sx55' UAGGCUAGAAAGAG⑶UGGGGA，染色体定位 lql2(6)miRNA-sx65' UGAGGAUUACGAAGAGGAUGGU，染色体定位 5q35(7)miRNA-sx75' G⑶GGUGCAGGCAGGAGAGC，染色体定位lq32 (8 ) miRNA-sx8 5' ACCC⑶CCCGUUCGUCCCCGGA，染色体定位 6ql 1(9)miRNA-sx95' GGAGUUGGAGGUGAUCGUGAGC，染色体定位 10q24(10)miRNA-sxlO5' UGGGGCACUCAGGAGGCUGCAG，染色体定位 llq23(11)miRNA-sx 11 5' UUGGGAGGAGCAGCUGAGGGA，染色体定位 2q34(12)miRNA-sxl25' UU⑶GGCAACAAUGGCACGGCA，染色体定位 3q35(13)miRNA-sxl35' CAGG⑶UACCUGUUGAGCUGC，染色体定位 3q35(14)miRNA-sxl45' CACAGCGGAGCUGGGCACUGGCGU，染色体定位 5q36(15)miRNA-sxl55' AUGGUAAUG⑶GGUG⑶GAUGG，染色体定位 8q24(16)miRNA-sxl65' AAU⑶GACUCAGCUAUCUGAAC，染色体定位 8q24(17)miRNA-sxl75' UGGGGGCAGGCCGGAUCUA⑶G，染色体定位 xq21。
2.权利要求1所述的鼠源miRNA，其特征在于包含该序列进行了硫代修饰、甲氧基修饰或两者的结合修饰。
3.权利要求1所述的鼠源miRNA，其特征在于该序列通过化学合成获得。
4.权利要求1所述的鼠源miRNA，其特征在于该序列通过构建真核细胞表达载体进行表达获得。
5.权利要求4所述的鼠源miRNA，其特征在于所述载体为质粒载体或病毒载体。
6.根据权利要求1所述十七个大鼠源miRNA的前体RNA，其特征在于包含如下任一个包含如下序列(1)miRNA-sxl前体·5 ‘ CAAUUCUGAAAACAG⑶GAUCUUCAAGUAGAAAAAACACAAAAAAGG CA ⑶ UUUCUAUUUGAA ⑶ CAUCUCUUCUCCCUUUAA(2)miRNA-sx2前体·5 ‘ GAGGCCA⑶UUGGGGGACAGGGCAAGGUGGGCAGUAGCUGACAGCCU GUUUACACUUGCCCUUUUUUCCCCAGGCUAUA⑶UCGGUU⑶GGCAGA(3)miRNA-sx3前体·5 ‘ CGGAAUUCACUGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGACAGGAGACUAGAGAGU CUGCUUUGCCAUCUCUCUUGCAGGCAUGUGCCU(4)miRNA-sx4前体·5 ‘ AUGUGUGUAUAUGUAAGUGUGUAUGUAUAUGUGUUUAUAUGAAUAUAC AUAUACAUACUCACGCACACAUACACGCAA(5)miRNA-sx5前体·5 ‘ AUCGAUCCCCAUCCCAGCUUCCUUCCAGCCCUUGAU⑶UUCAGUAUG CACAUAGGCUAGAAAGAG⑶UGGGGAUGGGGAAAGA(6)miRNA-sx6前体·5 ‘ UAAAACGGA⑶GAGGAUUACGAAGAGGAUGGUGUGGCUUUAAUAUUAG AACUUUACAGCAUCCUCUUCAUAAUCUUUACUCC⑶UUUAC(7)miRNA-sx7前体·5 ‘ G⑶GGGGCUGG⑶GGUGCAGGCAGGAGAGCCAUUGAUCUAUUGC GGGCUCUACUCCCUGCCCCAGCCAGAGCACCCC(8)miRNA-sx8前体·5 ‘ CGCCGGGCGCACCC⑶CCCGUUCGUCCCCGGAC⑶UGCUCUCUG CCCCGGGAACGUCGAGACUGGAGCGCCCGAACUG(9)miRNA-sx9前体·5 ‘ AGC⑶GAGCUGGA⑶UGGAG⑶GAUC⑶GAGC⑶GAAGACUGU GGUUGCCACAAGCACUUCCAACUGCAGAGCCACGCUC(10)miRNA-sxlO前体·5 ‘ G⑶GGCCGA⑶GGGGCACUCAGGAGGCUGCAGCGACCCCG⑶C CUUGCUGCUGCUCCCCAGCACCCCUUUCGGCUCCCU(11)miRNA-sxll前体·5 ‘ UUCCAGUUCAUUGGGAGGAGCAGCUGAGGGAUGCCUUUAACUUUC CCUGUGGAAUCUGCUCUUCCCAGGUGGAGU(12)miRNA-sxl2前体·5 ‘ UAGUG⑶UAGUACUCUGC⑶UGUGGCCGCAGCAACCUCG⑶UCGA AUCCGA⑶CACGGCAUU⑶GGCAACAAUGGCACGGCAAAGGGCGCUU(13)miRNA-sxl3前体·5 ‘ AGACACCCGGCAGG⑶UACCUGUUGAGCUGCAGCAGAAAG⑶GA AUGCAGCCUCUG⑶CACCCUCCCCAGGAU⑶CA(14)miRNA-sxl4前体·5 ‘ CAUCCUGACCCACAGCGGAGCUGGGCACUGGC⑶CACGCA⑶CCU UGUUGCCACCCCUGGCUCUGCUGGAUCUCAGGGCUGG(15)miRNA-sxl5前体·5 ‘ CAUCAUCAUCAUCAUCAUCAUCAUCAUUAUCAUCAUCAUCAUGCAAAG UGAUGGUAAUG⑶GGUG⑶GAUGGUGGAGAUGAU(16)miRNA-sxl6前体·5 ‘ GACAGUUUGCAAU⑶GACUCAGCUAUCUGAACA⑶CACCCCAAUGU CAGACAGCUGA⑶CACUCUGCAAAUU⑶CA(17)miRNA-sxl7前体·5 ‘ CCUCAGUCCCUGGGGGCAGGCCGGAUCUAGUG⑶GACGAGAGAGC CCUAGAU⑶GGUCCCUGCGCCCAUAGGACAG⑶GAGC。
7.权利要求6所述的鼠源miRNA的的前体RNA，其特征在于该序列通过化学合成获得。
8.权利要求6所述的鼠源miRNA的的前体RNA，其特征在于该序列通过构建真核细胞表达载体进行表达获得。
9.权利要求8所述的鼠源miRNA的的前体RNA，其特征在于所述载体为质粒载体或病毒载体。
10.根据权利要求1所述的十七个大鼠源miRNA的反义寡核苷酸包含如下任一种序列(DmiRNA-sxl反义寡核苷酸5'(2)miRNA-SX2反义寡核苷酸5'(3)miRNA-SX3反义寡核苷酸5'(4)miRNA-SX4反义寡核苷酸5'(5)miRNA-SX5反义寡核苷酸5'(6)miRNA-sx6反义寡核苷酸5'(7)miRNA-SX7反义寡核苷酸5'(8)miRNA-SX8反义寡核苷酸5'(9)miRNA-SX9反义寡核苷酸5'(10)miRNA-sx 10反义寡核苷酸(11)miRNA-sxll反义寡核苷酸(12)miRNA-sxl2反义寡核苷酸(13)miRNA-sxl3反义寡核苷酸(14)mi RNA-sx 14反义寡核苷酸(15)mi RNA-sx 15反义寡核苷酸(16)mi RNA-sx 16反义寡核苷酸(17)miRNA-sxl7反义寡核苷酸
11.权利要求10所述的的十七个大鼠源miRNA反义寡核苷酸，该核苷酸选自DNA或)
12.权利要求10所述的鼠源miRNA的反义寡核苷酸，其特征在于该序列通过化学合成获得。
13.权利要求10所述的鼠源miRNA的反义寡核苷酸，其特征在于该序列通过构建真核细胞表达载体进行表达获得。
14.权利要求14所述的鼠源miRNA的反义寡核苷酸，其特征在于所述载体为质粒载体或病毒载体。
15.权利要求1，6，10任一项所述十七个大鼠源miRNA、其前体RNA、其反义寡核苷酸及其表达载体在制备治疗周围神经损伤药物中的用途。RNA
全文摘要
本发明提供了十七个与大鼠坐骨神经离断过程相关的miRNA序列、其前体序列和反义寡核苷酸序列，以及其在制备治疗周围神经损伤药物中的用途。
文档编号A61P25/02GK102329799SQ20111032448
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月24日 优先权日2011年10月24日
发明者丁斐, 于彬, 周松林, 李石营, 王勇军, 顾晓松, 顾芸 申请人:南通大学