专利名称：组织工程神经移植物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学和生物医学工程领域，具体涉及含有细胞或者组织的组织工程神经移植物及其用途。
背景技术：
现实社会中交通事故、工伤事故、运动意外及临床手术等事件均会造成周围神经损伤，临床上但当中长距离的神经缺损不能依靠端对端的缝合来弥补神经缺失时，就不得不依靠移植物来桥接修复。近年来，基于生命科学与工程学的原理和技术发展起来的组织工程学为构建神经移植替代品提供了一条新的出路。采用组织工程技术修复神经损伤的研究主要集中在设计和构建新的组织工程神经桥接装置，目前这类桥接物通常是单独采用生物材料，通过将其加工成管状结构的神经引导通道，为神经的再生提供适当的空间和引导作用。但对于长距离、粗大神经缺损，这类单纯由生物材料组成的导管由于缺乏神经营养因子等微环境物质的支持，取得的修复效果非常有限。这可能是因为长距离神经缺损修复早期，神经断端内细胞分泌的神经营养因子有限，难以在长距离或较粗的神经导管中发挥作用。目前临床上自体神经移植仍然是治疗这类疾病最好的方法。因为供移植用的自体神经来源有限、产生新的创伤、组织结构和尺寸难以相匹配和移植供区长期失神经支配等原因， 导致自体神经移植应用的很大局限性。但自体神经移植治疗周围神经缺损良好的效果提示我们在神经缺损修复中需要有相关细胞提供生物微环境的作用，如果人工神经移植物上含有相关的细胞和组织，将能够提高缺损神经的修复效果。因此，理想的组织工程人工神经移植物应该包含支架材料、神经营养因子和种子细胞三部分。中国专利公开号CN1589913公开了一种用于修复周围神经缺损的组织工程化周围神经，使用神经胶质细胞或向神经胶质细胞分化的干细胞作为种子细胞，采用生物可降解材料构成的神经导管，同时应用复合有神经营养因子的控制释放微球，并含有细胞外基质。由于神经干细胞研究起步较晚，目前建立的神经干细胞系绝大多数来源于鼠，而鼠与人之间存在明显的种属差异，利若用自体细胞，由于神经干细胞和神经胶质细胞位于中枢神经系统，取材难度非常大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种带有活细胞或者组织的的壳聚糖人工神经移植物及其用途。本发明的技术解决方案是
一种组织工程神经移植物，其特征在于，所述的移植物包括(a)管状本体，所述管状本体是指用壳聚糖加工而成的管壁内分布丰富孔隙的导管，(b)包绕或者分布在所述管状本体孔隙内和表面的细胞或组织，所述的细胞包括骨髓干细胞、骨随间冲质干细胞、雪旺细胞或者背跟神经节组织一种或几种组合。上述管状本体为孔隙率50-90%、孔径50-300Mm的具有多孔结构、抗拉强度高的神
经导管。
上述管状本体内径为0. 5-8mm，壁厚0. l_3mm。上述管状本体在于是在不添加任何发泡剂、交联剂的情况下，通过弱酸溶解、注模、冷冻成型、中和固定、清洗、冷冻干燥等工艺制得。在制造过程中，通过改变壳聚糖溶液的浓度来调节导管管壁的孔隙率；通过改变冷冻成型温度和冷冻速度调节所生成的冰晶大小以控制壳聚糖导管管壁的孔径；通过改变壳聚糖的乙酰化程度以控制导管的降解速度。上述组织工程神经移植物包绕或者分布在所述管状本体孔隙内和表面的细胞或组织密度为1XIO6-IX 108/ml，来源于自体或异体。上述的组织工程神经移植物用于周围神经缺损和脊髓损伤，尤其是对粗大神经干长距离的缺损和陈旧性周围神经缺损。骨髓干细胞是存在于骨髓中的多能干细胞，包括造血干细胞和间充质干细胞两类。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓内造血干细胞以外的非造血干细胞，是造血微环境的重要组成部分。近年来的研究表明MSCs具有全能干细胞的特点，有报道MSCs可跨胚层分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、神经细胞、雪旺氏细胞，并表达神经组织细胞表型蛋白如NGF、MAP-2、CNPase, GFAP, 0X-42及 SlOO等相关因子，以改善神经再生过程中的微环境。近年来研究显示，MSCs在体内、外可诱导分化为雪旺氏样细胞，并可促进周围神经损伤的修复。研究发现，将MSCs植入硅胶管内， 可以促进大鼠及犬坐骨神经再生。雪旺氏细胞的主要功能之一是形成髓鞘。髓鞘是脊椎动物神经系统内围绕神经轴突高度特化的膜性结构，生理功能主要是促使钠离子顺利通过、传导神经冲动和防止神经冲动扩散的绝缘作用。髓鞘再生，使轴突重新获得包绕是恢复轴突生理功能的前提。同时， 雪旺氏细胞还具有分泌神经营养因子如NGF、BDNF CNTF、FGF，产生细胞外基质CEM和细胞黏附分子CAM等功能，为支持和引导轴突再生，轴突再生提供良好的环境。本发明采用种子细胞相对于现有技术中采用的神经干细胞和神经胶质细胞而言， 骨髓间充质干细胞具有自我更新、高度增殖等干细胞特点，并具有分化为雪旺氏细胞的潜能，骨髓干细胞、骨髓间充质干细胞和雪旺氏细胞来源丰富，取材方便，容易分离纯化，而且为同种同体细胞来源，无免疫排斥反应，更适于作为良好的种子细胞，用于构建组织工程化神经，特别是用于对粗大神经干长距离的缺损和陈旧性周围神经缺损的修复。此外，骨髓间充质干细胞和雪旺氏细胞具有分泌表达神经营养因子的功能，与现有技术相比，采用本发明所述的组织工程神经移植物无需再附加外源的神经营养因子就能够提高缺损神经的修复效果，其制备工艺与现有技术相比也更简便。下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施例方式
实施例1自体骨髓干细胞的壳聚糖组织工程神经的制备
用浓度为2%的乳酸溶解壳聚糖得到壳聚糖的浓度为1.5%溶液。然后将溶液注入模具，经-60°C冷冻预成型后，将材料退出模具，放入5%氢氧化钠溶液，中和材料中的酸，固定成型后，用蒸馏水将过量的碱及生成的盐清洗干净后，后经冷冻干燥得到含神经营养因子的壳聚糖人工神经移植物，孔隙率87%，平均孔径为220-289 μ m。自体骨髓干细胞富集流程抽取受试者骨髓约40ml，肝素抗凝，注意尽量避免凝块形成，将骨髓在超净台内转移到2支50ml无菌离心管内，分别用PBS等比稀释并混勻，吸取FIC0LL10-20ml/管X4管，倾斜离心管，将骨髓悬液分别沿壁缓慢加到FICOLL表面，使之形成清晰的分界面，220C，1350转/分，离心30分钟，关刹车，平稳取出离心管，于超净台中将中间白膜层吸出，至于无菌离心管中，加入PBS至40ml混勻，1500转/分，离心5分钟，
弃上清；
一次性注射器吸取预先制备好的自体骨髓干细胞悬液，通过输液软管注入细胞悬液， 注满为止。保持移植入壳聚糖导管内的细胞密度是lX108/ml，将导管内注满为止。根据壳聚糖导管的内径和长度规格的不同注入的细胞总量不同。这样得到含自体骨髓干细胞的壳聚糖组织工程神经。实施例2自体骨髓间冲质干细胞(MSCs)的壳聚糖组织工程神经
用浓度为2%的醋酸溶解壳聚糖得到壳聚糖的浓度为洲溶液。然后将溶液注入模具， 经-70°C冷冻预成型后，将材料退出模具，放入到10%碳酸钠溶液中，中和材料中的酸固定成型后，用蒸馏水将过量的碱及生成的盐清洗干净后，然后经冷冻干燥得到壳聚糖人工神经移植物，孔隙率72%，平均孔径为130-180 μ m。自体骨髓间冲质干细胞富集流程
(一)细胞分离
1.抽取受试者骨髓约40ml，肝素抗凝，注意尽量避免凝块形成
2.将骨髓在超净台内转移到2支50ml无菌离心管内，分别用PBS等比稀释并混勻
3.吸取FIC0LL10-20ml/管X4管，倾斜离心管，将骨髓悬液分别沿壁缓慢加到FICOLL 表面，使之形成清晰的分界面
4.22°C，1350转/分，离心30分钟，关刹车
5.平稳取出离心管，于超净台中将中间白膜层吸出，至于无菌离心管中
6.加入PBS至40ml混勻，1500转/分，离心5分钟，弃上清
7.重复步骤6
8.加入MESENCULT培养液IOml，吹打均勻
9.取细胞悬液20μ 1于EP管中，再加入白细胞稀释液ISOul稀释，于振荡器混勻，取 20 μ 1加到细胞计数板上
10.计数四象限细胞总数的均数XIO-E6为总细胞数
11.以2-5X IOE7/皿的密度计算所需培养的皿数
12.加入培养液及细胞悬液保证终体积为7-8ml，轻轻摇勻放入孵箱
(二)M小时第一次换液
1.观察细胞状态，是否污染，污染的细胞直接丢弃，禁止于操作间打开培养皿
2.没有污染的细胞放在超净台中，将培养液反复冲洗培养皿底后吸出所有培养液
3.镜下观察，若发现红细胞很多，可用PBS再冲洗一遍
4.加入培养液7-8ml，放入孵箱
5.以后每3天换液一次，每次半量换液，直到细胞生长达到培养皿底部的70-80%传代
(三)MSCs传代
1.观察细胞状态(同上) 2.未污染的培养皿置于超净台中，吸出所有培养液并保存于无菌离心管中
3.以PBS3-細1/皿冲洗培养皿底并弃去(洗去残留培养液)4.每皿加入3-鈿1，37度预温的胰酶，置于孵箱保温
5.3分钟后镜下观察细胞是否变圆，若仍为梭形，可继续消化1-2分钟
6.取出培养皿，每皿加入5-6ml旧培养液中和胰酶
7.吹打至所有细胞悬浮
8.收集细胞悬液，1500转/分离心，弃上清
9.加入Iml新鲜培养液，混勻
10.计数(可不加白细胞稀释液，其余同上)
11.按2-5XIOE5/皿将细胞接种到培养皿中，并加入新鲜培养液，使终体积达7-8ml， 放入孵箱
12.传代后的细胞3-4天半量换液1次，细胞生长面积达培养皿底部80-90%需再传代
(四)MSCs冻存
1.1-8步骤同上
2.冻存细胞终浓度为2-5X10E6/ml，计算需要冻存的管数和体积
3.按(培养液+细胞)白蛋白DMS0=7:2:1冻存
4.注意DMSO要缓缓加入细胞悬液，并在加入过程中要不断混勻
5.盖紧冻存管管盖，塑料膜封口，在瓶身记录姓名、细胞代数及数目、冻存时间
6.冻存管外以2-3块纱布包裹，先置于4度冰箱2小时，-20度冰箱4小时，最后放入-80度冰箱(可直接置于-80度冰箱)
(五)MSCs解冻
1.从冰箱取出冻存管，以冰块运输
2.解开纱布但保留塑料膜，手持冻存管于37度水浴中不断晃动，以使细胞在1分钟内完全解冻
3.擦干水迹，酒精消毒后置于超净台中，揭开塑料膜，打开管盖
4.将冻存管内细胞悬液移入离心管，加入生理盐水+5%白蛋白洗涤，混勻，1500转/ 分离心5分钟
5.重复上述步骤1次 (六)收集MSCs
1.在细胞传代过程中直接收集MSCs或收集解冻后经过洗涤的MSCs，加入含20%白蛋白的生理盐水制成细胞悬液备用
2.取1滴计数
3.台盼兰等体积稀释后计算细胞活性计数100个细胞，拒染数X1%
4.MSCs用于辅助治疗前需进行流式细胞仪鉴定细胞类型；染色体检测排除二倍体变异；输注前行病原学检测；细胞悬液皮试
一次性注射器吸取预先制备好的自体骨髓间充质干细胞悬液，伸入壳聚糖导管内，边退边注入细胞悬液，注满为止，吻合口进针处缝合密封。保持移植入壳聚糖导管内的MSCs 细胞密度是lX108/ml，将导管内注满为止。根据壳聚糖导管的内径和长度规格的不同注入的细胞总量不同。这样得到含自体骨髓间冲质干细胞的壳聚糖组织工程神经。实施例3雪旺氏细胞的壳聚糖组织工程神经用浓度为2%的柠檬酸酸溶解壳聚糖得到壳聚糖的浓度为5%溶液，然后将溶液注入模具，经-80°C冷冻预成型后，将材料退出模具，放入到5%氢氧化钠溶液中，中和材料中的酸固定成型后，用蒸馏水将过量的碱及生成的盐清洗干净后，然后经冷冻干燥得到壳聚糖人工神经移植物，孔隙率51%，平均孔径为57-96 μ m。将上述制备的壳聚糖人工神经导管高压消毒备用。于实验前一天，DMEM+15%FBS完全培养基中浸泡Mh。背根神经节取自胚胎16d SD大鼠L4，5，6。在预备好的丝管两端各植入3个DRG，于生物反应器中用DMEM+15%FBS培养Id后，换成97%neurobasal+2%B27+l%g Iutaminate的神经元培养基继续培养6d。取新生Id SD大鼠坐骨神经，通过反复植块法得到较纯的雪旺氏细胞将平均密度为8X 106/ml雪旺氏细胞用微量注射器注入已植有DRG 的管腔内，于生物反应器内分别培养2、3和4周后，观察丝管内细胞的生长状态。等雪旺氏细胞布满导管后即为含雪旺氏细胞的组织工程神经。实施例4用组织工程化周围神经修复SD大鼠坐骨神经缺损3个月的动物实验
使用含雪旺氏细胞的组织工程神经修复SD大鼠坐骨神经缺损1厘米3个月，术后M周通过电生理学、组织形态学、神经示踪技术、超微结构观察等多种手段、多指标综合评价，电生理可以检测到坐骨神经复合动作电位，结果显示再生的纤维排列整齐，坐骨神经修复效果较好。实施例5用组织工程化周围神经修复犬坐骨神经缺损5厘米的动物实验
使用含自体骨髓间冲质的组织工程神经修复犬大鼠坐骨神经缺损5厘米，术后1周到 6个月，定期、动态观察犬术肢运动功能恢复情况。结果显示，术后所有动物左股手术创口处未见明显感染迹象，体温正常，饮食正常，体重逐渐增长，且活泼好动。术后6月，自体MSCs 组织工程化神经组(TENG组)和自体神经组(坐骨神经切断5cm后原位缝合，autologous 组)动物行走自如，上下楼梯和双后肢站立时术肢能够发力，整个运动姿态相当协调；结果显示，自体MSCs组织工程化神经成功修复犬坐骨神经缺损5cm，术后6个月粗大的坐骨神经干缺损被再生的神经组织重建，肌复合动作电位恢复，轴突的物质运输功能得以重现，靶肌得到再生神经的重新支配，实现结构与功能的重建。
权利要求
1.一种组织工程神经移植物，包括(a)管状本体，所述管状本体是指用壳聚糖加工而成的管壁内分布丰富孔隙的导管，(b)包绕或者分布在所述管状本体孔隙内和表面的细胞或组织，其特征在于，所述细胞或组织包括骨髓干细胞、骨髓间冲质干细胞、雪旺细胞或者背跟神经节组织一种或几种组合。
2.根据权利要求1所述组织工程神经移植物，其特征在于所述管状本体为孔隙率 50-90%、孔径50-300Mm的具有多孔结构、抗拉强度高的神经导管。
3.根据权利要求2所述组织工程神经移植物，其特征在于所述管状本体内径为 0. 5-8mm，壁厚 0. l_3mm。
4.根据权利要求1-3所述组织工程神经移植物，其特征所述管状本体在于是在不添加任何发泡剂、交联剂的情况下，通过弱酸溶解、注模、冷冻成型、中和固定、清洗、冷冻干燥等工艺制得。
5.根据权利要求1所述组织工程神经移植物，其特征在于所述包绕或者分布在所述管状本体孔隙内和表面的细胞或组织密度为1XIO6-IX 108/ml。
6.根据权利要求1所述组织工程神经移植物，其特征在于所述的细胞或者组织包括来源于自体或异体。
7.根据权利要求1所述组织工程神经移植物的用途，其特征在于所述的组织工程神经移植物用于周围神经缺损和脊髓损伤的修复。
8.根据权利要求7所述组织工程神经移植物的用途，其特征在于所述周围神经缺损和脊髓损伤为粗大神经干长距离的缺损和陈旧性周围神经缺损。
全文摘要
本发明公开了一种含神经营养因子的壳聚糖人工神经移植物及制备方法，壳聚糖人工神经移植物是在不添加任何发泡剂、交联剂的情况下，通过弱酸溶解、注模、成型、中和固定、清洗、冷冻干燥等工艺，将壳聚糖加工成具有多孔结构、抗拉强度高的神经导管。在神经导管中含有治疗作用的包绕或者分布在所述管状本体孔隙内和表面的细胞或组织，包括自体骨髓干细胞、自体骨随间冲质干细胞、雪旺细胞或者背跟神经节组织或其组合，该组织工程化神经可用于修复周围神经缺损，同时也可应用于脊髓损伤的修复。
文档编号A61L27/36GK102343114SQ20111032447
公开日2012年2月8日 申请日期2011年10月24日 优先权日2011年10月24日
发明者丁斐, 刘红, 杨宇民, 汤欣, 顾剑辉, 顾晓松 申请人:南通大学