专利名称：一种t-2烯霉素的注射制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤药物组合物，特别涉及一种含T-2烯霉素的注射制剂。
背景技术：
T-2烯霉素是由多种真菌产生的单端孢霉烯类物质。其结构式见下图
近年来国内外对T-2烯霉素开展了广泛的研究，对T-2烯霉素的毒理学作用有了更加全面的了解。T-2烯霉素具有较强的毒性作用，可直接刺激皮肤和黏膜，穿透上皮组织。该毒素几乎可以影响所有亚细胞水平的活动。据报道，T-2烯霉素具有多重毒性作用机制，如， 在机体内可诱导产生自由基，从而引起细胞核谷胱甘肽硫转移酶活性降低；能抑制小鼠的胸腺、骨髓和肝脏细胞DNA和蛋白的合成；能与胞浆膜上的脂质分子和蛋白质结合，进而影响膜功能；能抑制白细胞介素-2 mRNA合成酶，从而使得该mRNA生成量减少；能引起大鼠肝脏NADPH细胞色素c和NADH细胞色素沾还原酶活性降低，并伴随着脂肪过氧化能力和谷胱甘肽脱氢酶系活性升高；并能干扰大鼠肝脏细胞线粒体呼吸链的电子传递过程。进一步的研究表明，T-2烯霉素主要作用于细胞分裂旺盛的组织器官，如胸腺、骨髓、肝、脾、淋巴结、生殖腺及胃肠粘膜等，抑制这些器官细胞蛋白质和DNA合成，并可引起淋巴细胞中DNA单链的断裂。对家猪、家禽、牛等动物的毒性相对较强，对成年人的毒性作用低于幼儿。经呼吸道吸入中毒报道很少，主要是经口摄入后导致中毒。人类长期经口摄入T-2烯霉素会出现流涎、呕吐、腹痛、头痛、头晕等症状。最近研究表明，T-2烯霉素虽然具有一定的毒性作用，但也具有显著的广谱抗肿瘤活性，体外对癌症细胞具有极强的杀灭作用，纳克级的T-2烯霉素即可显著抑制白血病 K562细胞株、肺癌NCI-460细胞株、肝癌SMMC-7721细胞株、肺癌A549细胞株、人脑胶质瘤 U251细胞株、结肠腺癌LS174-T及LOVO株等肿瘤细胞株的生长。且对白细胞具有天然的靶向性。裸小鼠体内实验表明，将白血病K562细胞株接种至裸鼠皮下，制成实体瘤模型后，瘤内注射给予T-2烯霉素5mg/kg，每日一次，连续给药5天，可使实体瘤组织细胞坏死分解。 T-2烯霉素对消化道肿瘤有明确的化疗作用，化疗效果强于消化道一线化疗药物5-FU。国内发明专利CN200910019618. 1 (发明人厉保秋，申请人山东大学，公开公告日 2009年07月22日，公开公告号CN101485653A)、CN200910019619. 6(发明人厉保秋，申请人
3山东大学，授权公告日2011年2月2日，授权公告号CN101513399B)、CN200910014633. 7(发明人厉保秋，申请人山东大学，授权公告日2011年3月30日，授权公告号CN101491518B)、 CN200910019620. 9 (发明人厉保秋，申请人山东大学，授权公告日2010年12月8日，授权公告号CN101485654B)、CN200910014627. 1 (发明人厉保秋，申请人山东大学，申请日2009 年3月3日，公开公告号CN101491517A)、CN201010258665. 4(发明人厉保秋，申请人山东大学，申请日2009年3月3日，公开公告号CN101940565A)、CN201010258681. 3 (发明人厉保秋，申请人山东大学，申请日2009年3月3日，公开公告号CN101984963A)、201010258664. X(发明人厉保秋，申请人山东大学，申请日2009年3月3日，公开公告号CN101984962A)和 CN201010258682. 8 (发明人厉保秋，申请人山东大学，申请日2009年3月3日，公开公告号 CN101984964A)已经分别公开了 T-2烯霉素在治疗白血病、骨癌及骨髓增生异常、实体瘤、 前列腺癌、胰腺癌、脑肿瘤及肾细胞癌等癌症中的意图，其中发明专利CN200910014633.7 公开了一种T-2烯霉素的植入制剂，用于治疗实体瘤，具有理想的效果，且可以避免T-2烯霉素的毒性作用。然而，T-2烯霉素用于非实体瘤时，无法采用瘤内埋植给药，而口服或静脉注射给药，需要克服T-2烯霉素难溶于水、生物利用度低、口服或静脉注射给药存在副作用等问题，避免T-2烯霉素注射给药过程中对血管组织的刺激。目前对于难溶于水、生物利用度低、给药后毒副作用较强的抗肿瘤药物，多采用复合溶剂系统提高药物生物利用度，但助溶效果较好的溶剂如聚氧乙烯蓖麻油、吐温-80等均存在显著的刺激性。因此目前倾向于将难溶于水、生物利用度低、给药后毒副作用较强的抗肿瘤药物制备成环糊精包合物、微球制剂等特殊制剂，以此提高药物的生物利用度和靶向性，降低药物对给药局部或血管系统的刺激性，但是糊精包合物、微球制剂等特殊制剂制备的药物，价格显著高于普通制剂，使得患者医疗费用负担加重。因此，制剂技术已经成为阻碍T-2烯霉素临床应用的关键技术。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种用于治疗肿瘤的T-2烯霉素注射制剂。具体地说是一种T-2烯霉素注射液。本发明的一方面提供了一种T-2烯霉素注射制剂，所述T-2烯霉素注射制剂由T-2 烯霉素和乙醇组成；所述乙醇的用量为每0. 5mg^2mg T_2烯霉素使用Iml乙醇；所述乙醇的纯度大于99. 4%。本发明的另一方面提供了一种Τ-2烯霉素注射制剂，所述Τ-2烯霉素注射制剂由Τ-2烯霉素、乙醇和增溶剂组成，所述乙醇的纯度大于98. 0% ；所述乙醇的用量为每 0. 5mg^lmg T-2烯霉素使用Iml乙醇；所述增溶剂的用量为每0. 5mg^l. OmgT-2烯霉素使用 0. 5mg增溶剂。所述增溶剂为聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、聚乙二醇400中的一种或两种。所述增溶剂为聚乙烯吡咯烷酮和柠檬酸。所述T-2烯霉素注射制剂中所用聚乙烯吡咯烷酮和柠檬酸的重量比为1:1。本发明人在处方研究中，惊奇的发现，采用纯度大于99. 4%的乙醇或采用纯度大于98. 0%的乙醇与某些助溶剂组成的复合溶剂作为T-2烯霉素注射制剂的溶媒和辅料，制成的T-2烯霉素注射液，经静脉滴注或推注达到治疗剂量后，其血管刺激性及对非肿瘤组织的毒副作用显著降低。组织分布研究进一步表明，纯度大于99. 4%的乙醇或采用纯度大于98. 0%的乙醇与某些助溶剂组成的复合溶剂作为T-2烯霉素注射液的溶媒和辅料，静脉注射后，T-2烯霉素由血液系统向分裂旺盛的肿瘤组织分布的速度显著加快，有利于提高T-2烯霉素的生物利用度，减轻其毒副作用，且本制剂制备工艺简单，利于工业化生产，具备突出的实质性特点和显著的进步。
图1 T-2烯霉素阳性对照组器官病理图片。图2 T-2烯霉素注射液静脉给药后在肿瘤及血液中含量比值变化图在大鼠体内的组织分布。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明 实施例1 T-2烯霉素注射液的配制
组方
T-2烯霉素40mg
乙醇(纯度99. 7%) 40ml 制备
将处方量的T-2烯霉素加到乙醇中，搅拌使其充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。实施例2 T-2烯霉素注射液的配制组方
T-2烯霉素40mg
乙醇(纯度99. 5%) 50ml 制备
将处方量的T-2烯霉素加到乙醇中，搅拌使其充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。实施例3 T-2烯霉素注射液的配制组方
T-2烯霉素12mg
乙醇(纯度99. 8%) 20ml 制备
将处方量的T-2烯霉素加到乙醇中，搅拌使其充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。实施例4 T-2烯霉素注射液的配制组方
T-2烯霉素30mg
乙醇(纯度99. 5%) 20ml 制备
将处方量的T-2烯霉素加到乙醇中，搅拌使其充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。
实施例5 T-2烯霉素注射液的配制组方
T-2烯霉素
乙醇(纯度99. 8%) 20ml 制备
将处方量的T-2烯霉素加到乙醇中，搅拌使其充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。实施例6 T-2烯霉素注射液的配制组方
T-2烯霉素
乙醇(纯度99. 7%) 20ml 制备
将处方量的T-2烯霉素加到乙醇中，搅拌使其充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。实施例7 T-2烯霉素注射液的配制组方
T-2烯霉素38mg
乙醇(纯度99. 8%) 20ml 制备
将处方量的T-2烯霉素加到乙醇中，搅拌使其充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。实施例8 T-2烯霉素注射液的配制
组方
T-2烯霉素20mg
乙醇(纯度98. 6%) 22ml 聚乙二醇40019mg
制备
将处方量的T-2烯霉素、乙醇、聚乙二醇400混合，搅拌使T-2烯霉素充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。 实施例9 T-2烯霉素注射液的配制
组方
T-2烯霉素IOmg
乙醇(纯度99. 1%)19ml
聚乙二醇4004mg
柠檬酸ang 制备
将处方量的T-2烯霉素、乙醇、聚乙二醇400和柠檬酸混合，搅拌使T-2烯霉素充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。
实施例10 T-2烯霉素注射液的配制组方
T-2烯霉素16mg
乙醇(纯度99. 7%) 24ml
6聚乙烯吡咯烷酮6mg
制备
将处方量的T-2烯霉素、乙醇和聚乙烯吡咯烷酮混合，搅拌使T-2烯霉素充分溶解后， 灭菌、分装、保存即可。 实施例11 T-2烯霉素注射液的配制
组方
T-2烯霉素30mg
乙醇(纯度99. 7%)36ml
聚乙烯吡咯烷酮IOmg
聚乙二醇4005mg 制备
将处方量的T-2烯霉素、乙醇、聚乙二醇400和聚乙烯吡咯烷酮混合，搅拌使T-2烯霉素充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。
实施例12 T-2烯霉素注射液的配制
组方
T-2烯霉素30mg
乙醇(纯度99. 7%)54ml
聚乙烯吡咯烷酮8mg
柠檬酸8mg 制备
将处方量的T-2烯霉素、乙醇、柠檬酸和聚乙烯吡咯烷酮混合，搅拌使T-2烯霉素充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。
实施例13 T-2烯霉素注射液的配制
组方
T-2烯霉素30mg
乙醇(纯度99. 7%)34ml
聚乙烯吡咯烷酮IOmg
柠檬酸IOmg 制备
将处方量的T-2烯霉素、乙醇、柠檬酸和聚乙烯吡咯烷酮混合，搅拌使T-2烯霉素充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。
实施例14 T-2烯霉素注射液的配制
组方
T-2烯霉素30mg
乙醇(纯度99. 7%)42ml
聚乙烯吡咯烷酮Hmg
柠檬酸Hmg 制备
将处方量的T-2烯霉素、乙醇、柠檬酸和聚乙烯吡咯烷酮混合，搅拌使T-2烯霉素充分
7溶解后，灭菌、分装、保存即可。 实施例15 T-2烯霉素注射液的配制
组方 T-2烯霉素乙醇(纯度99. 7%) 聚乙烯吡咯烷酮
30mg 39ml 9. 5mg 9. 5mg
柠檬酸制备
将处方量的T-2烯霉素、乙醇、柠檬酸和聚乙烯吡咯烷酮混合，搅拌使T-2烯霉素充分溶解后，灭菌、分装、保存即可。实施例16 T-2烯霉素注射液的毒性实验
KM小鼠，体重30 g 40g，雌雄各半随机分为7组每组20。实验组六组，分别尾静脉注射给予实施例1、5、8、9、12、14所制注射液(以T-2烯霉素lmg/kg体重剂量给药);阴性对照组尾静脉注射给予生理盐水；阳性对照组尾静脉注射给予T-2烯霉素乙醇溶液(乙醇浓度为95%，按体积比计算；以T-2烯霉素0. 5mg/kg体重剂量给药)。每日给药1次，连续给药7 天，给药期间及给药后1-7天每日进行进行大体观察、血液学、血生化、尿生化检查，给药后第1、3、5、7天每天各组每天处死5只动物进行病理解剖，光学显微镜下进行病理检查。大体观察发现阳性对照组给药后呕吐发生率为92%，第4次给药后，小鼠进食量显著减少；实验组呕吐发生率最高为3% (实施例8所制静脉注射剂)，各实验组与对照组二者相比均存在显著差异(P<0. 05)，且实验组呕吐症状相对较轻。提示阳性对照组药物对胃肠道粘膜系统产生了较强的刺激。实验过程中观察小鼠皮肤，阳性对照组小鼠尾部、腹部皮肤出现显著的出血性瘀点，眼睛出现充血症状，实验组小鼠尾部、腹部皮肤出血性瘀点显著少于实验组，提示实施例1、5、8、9、12、14所制的T-2烯霉素注射液可显著减轻T-2烯霉素对血管组织的刺激。实验结束处死各组小鼠，取小鼠心脏、肝脏、肺脏、脾脏及肾脏，大体观察发现阳性对照组小鼠肝脾肿大出血，各器官制作病理切片，显微镜下观察各组动物的病理变化。结果表明，阳性对照组小鼠均存在不同程度的心肌出血及肝、肺、肾脏出血现象，结果见图1。实验组未发现明显异常。提示T-2烯霉素注射液可减轻T-2烯霉素对血管及其它脏器的刺激作用。实施例17 T-2烯霉素注射液在荷瘤小鼠体内的组织分布实验
C-57小鼠4-6周龄，体重15-25g，雄性，将Lewis肺癌细胞，接种于实验小鼠右前肢根部腹侧皮下，每只接种2. OX IO7个肿瘤细胞，总体积0. 20ml。2周后肿块长大，用于实验。将荷瘤小鼠随机分为4组，实验组单次尾静脉注射给予实施例1所制的T-2烯霉素注射液(以T-2烯霉素0. 5mg/kg体重剂量给药)。阳性对照组尾静脉注射给予T-2烯霉素乙醇溶液(乙醇浓度为95%，按体积比计算；以T-2烯霉素0. 5mg/kg体重剂量给药)。各组动物每日给药1次，连续给药3天。给药后第1、2、8、12、16、对小时每组5只小鼠，采血后，处死，取出肿瘤组织，测定血浆及肿瘤组织T-2烯霉素的相对含量，计算肿瘤组织中T-2 烯霉素含量与血浆中T-2烯霉素含量的比值[T=(肿瘤组织中T-2烯霉素含量)/ (血浆中 T-2烯霉素含量)，结果见图2。
由图2可见，T-2烯霉素注射液静脉注射给药后可显著提高T-2烯霉素在肿瘤组织的分布，且能够使肿瘤组织中T-2烯霉素维持在高浓度大40小时。而T-2烯霉素乙醇溶液静脉注射给药后T-2烯霉素在肿瘤组织的分布较低。提示T-2烯霉素注射液可以提高T-2 烯霉素生物利用度，并可改善T-2烯霉素的组织分布。实施例18 T-2烯霉素注射液的稳定性实验
对实施例1、3、7、11、14所得T-2烯霉素注射液进行稳定性实验。(1)强光照射试验将T-2烯霉素注射液在4 000 Ix光照下分别放置5天和10 天后进行观测，结果发现，与放置前相比，注射剂仍保持澄清透明。(2)高湿度试验将T-2烯霉素注射液放在密闭器皿中分别于25 %、75%及92 .5 %相对湿度条件下放置，5天和10天后考察稳定性。与放置前相比，静脉注射剂仍保持澄清透明，未见药物析出。(3)高温试验将T-2烯霉素注射液放在密闭器皿中并分别置于40、60、80 °C 条件下，5天和10天后考察稳定性。与放置前相比，仍保持澄清透明，未见药物析出。(4)加速试验将T-2烯霉素注射液4000rpm离心10 min,仍保持澄清透明，未见药物析出。(5)常温留样考察将T-2烯霉素注射液在温度25°C、相对湿度75 %条件下分别放置1、2、3、6、12、对月，仍保持澄清透明，未见药物析出。因T-2烯霉素本身在光照和高温条件下，能够稳定存在。因此，T-2烯霉素注射液的稳定性实验主要是观察T-2烯霉素在选定的溶剂系统中，在强光、高温、高湿等条件下， 是否会出现药物析出等制剂问题。由实验结果可见，T-2烯霉素注射液稳定性较强，符合制剂技术要求，即使在高湿条件下，仍能稳定存在一定时间。实施例19 T-2烯霉素体外细胞毒及对肿瘤细胞生长的抑制作用 (1)细胞
正常细胞丄拟9 (小鼠成纤维细胞)、CHL (仓鼠肺细胞)
人肿瘤细胞系MCF-7(乳腺癌)、H印G-2 (肝癌)、K562 (白血病)、Α549 (肺癌)、U251(人脑胶质瘤)、DU145 (前列腺癌)、RPMI8226 (多发性骨髓瘤)。(2)阳性对照注射用丝裂霉素
(3)方法采用细胞毒类抗肿瘤的“磺酰罗丹明染色法(SRB法)检测。供试品配制取T-2烯霉素注射液1ml，加入9ml DMSO,配制成浓度为0. 5mg/ml 的溶液，再用 RPMI 1640 完全培养基稀释为 0. 025ng/ml、0. 25ng/ml、2. 5ng/ml、25ng/ml、 250ng/ml、2500ng/ml、25000ng/ml 的使用浓度。细胞培养将细胞复苏后用细胞所需相应完全培养基置37°C，5%0)2培养箱中培养、传代，培养至对数生长期。细胞接种将培养至对数生长期的细胞用0. 25%胰酶消化，加完全培养基吹打成细胞悬液，取少许细胞悬液加等量0. 4%台盼蓝染液染色后显微镜下计数，贴壁细胞调整浓度至2X IO5个/ml，悬浮细胞调整浓度至5X IO5个/ml，以ΙΟΟμΙ/孔接种于96孔板，置 370C，5%C02培养箱中培养M小时。受试物处理细胞实验组每孔加入ΙΟΟμΙ各浓度的供试品液，阴性对照加入等量的完全培养基，空白对照为不加细胞的完全培养基，每组设6个平行，置7°C，5%C02培养箱中继续培养M小时。贴壁细胞检测(SRB法)细胞培养24h后，取出培养板，于每孔加入50μ1预冷的 50%三氯乙酸(TCA)，终浓度为10%，板置4°C 1小时。取出用蒸馏水洗5遍，除去三氯乙酸、 培养液、低分子量代谢物、血清蛋白，空气中干燥。待完全干燥后每孔加入1%的醋酸配制的 0. 4%的SRBlOOPl，室温下染色15分钟 30分钟。倒掉染液，用1%醋酸洗5次，去除未结合的染料，空气中干燥后用PH 10. 5的lOmmol/L的非缓冲Tris碱液150μ1溶解。在平板振荡器上震荡5min，于波长490nm处，酶联免疫监测仪测定各孔的光吸收值。记录数值得出各浓度细胞的生长抑制率，运用SPSS13. 0软件得出IC50值。悬浮细胞检测(SRB法)细胞培养M小时后，取出培养板，于每孔加入50μ1预冷的80%三氯乙酸(TCA)，终浓度为16%，静置5分钟，板置4°C 1小时。取出用蒸馏水洗5遍， 除去三氯乙酸、培养液、低分子量代谢物、血清蛋白，空气中干燥。待完全干燥后每孔加入1% 的醋酸配制的0. 4%的SRBlOOPl，室温下染色15分钟 30分钟。倒掉染液，用1%醋酸洗5 次，去除未结合的染料，空气中干燥后用PH 10. 5的lOmmol/L的非缓冲Tris碱液150μ1溶解。在平板振荡器上震荡5min，于波长490nm处，酶联免疫监测仪测定各孔的光吸收值。记录数值得出各浓度细胞的生长抑制率，运用SPSS13. 0软件得出IC50值。(4)结果T-2烯霉素对正常细胞抑制作用的抑制率及IC50值 表1 T-2烯霉素对肿瘤细胞抑制作用的抑制率及IC50值
权利要求
1.一种T-2烯霉素注射制剂，其特征在于所述T-2烯霉素注射制剂由T-2烯霉素和乙醇组成；所述乙醇的用量为每0. 5mg^2mg T_2烯霉素使用Iml乙醇；所述乙醇的纯度大于 99. 4%ο
2.—种Τ-2烯霉素注射制剂，其特征在于所述Τ-2烯霉素注射制剂由Τ-2烯霉素、乙醇和增溶剂组成，所述乙醇的纯度大于98. 0% ；所述乙醇的用量为每0. 5mg^lmg T_2烯霉素使用Iml乙醇；所述增溶剂的用量为每0. 5mg^l. OmgT-2烯霉素使用0. 5mg增溶剂。
3.根据权利要求2所述的T-2烯霉素注射液制剂，其特征在于所述增溶剂为聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、聚乙二醇400中的一种或两种。
4.根据权利要求3所述的T-2烯霉素注射液制剂，其特征在于所述增溶剂为聚乙烯吡咯烷酮和柠檬酸。
5.根据权利要求4所述的T-2烯霉素注射液制剂，其特征在于所述T-2烯霉素注射制剂中所用聚乙烯吡咯烷酮和柠檬酸的重量比为1:1。
全文摘要
本发明公开了一种T-2烯霉素的注射制剂，该注射制剂主要由T-2烯霉素和乙醇溶液构成，也可添加一种或两种増溶剂，如聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸等。实验研究表明，本发明的T-2烯霉素注射液不仅可以提高T-2烯霉素的生物利用度，也可以减轻T-2烯霉素静脉注射给药的毒性，并且提高T-2烯霉素在肿瘤组织的分布。
文档编号A61K47/34GK102357072SQ201110345019
公开日2012年2月22日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者厉保秋, 厉凌子, 高继友 申请人:济南环肽医药科技有限公司