一种含两性霉素b的长效制剂的制作方法

专利名称：一种含两性霉素b的长效制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含胆甾醇通过小分子物以醚键接枝的聚乙二醇醚(简称PGC)的两性霉 素B的稳定的长效制剂。
背景技术：
两性霉素B ( Amphotericin B)又叫两性霉素乙；异性霉素，二性霉素，是由链霉菌 产生一种多烯类光谱抗真菌抗生素，与真菌细胞膜上的固醇类特别是麦角固醇有高亲和力， 在细胞膜上形成小分子通道，造成细胞内钾例子，核苷酸，氨基酸等小分子外漏，破坏细 胞的正常代谢而起到抑菌作用。
两性霉素B可与敏感真菌细胞膜上的甾醇结合，损伤膜的通透性，导致细胞内重要物 质如钾离子、核苷酸和氨基酸等外漏，从而破坏了细胞的TH常代谢而抑制其生长。通常临 床治疗所达到的药物浓度对真菌为抑菌作用，如药物浓度达到人体可耐受范围的高限时则 对真菌起杀菌作用。适用于下列真菌感染的治疗隐球菌病、北美芽生菌病、播散性念珠 菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病，由毛霉菌、酒曲菌属、犁头霉菌属、内胞霉属和蛙粪 霉属等所致的毛霉菌病，由申克孢子丝菌引起的孢子丝菌病，由烟曲菌所致的曲菌病等。 由于两性霉素B的明显毒性，故本品主要用于诊断己确立的深部真菌感染(如获培养或组织 学检查阳性则更佳)，且病情危重呈进行性发展者。对临床真菌感染征象不明显，仅皮肤或 血清试验阳性的患者不宜选用.
市售的可溶性两性霉素B含45y。两性霉素B， 35%脱氧胆酸钠和20%磷酸氢钠，已经上市 的产品中为可溶性两性霉素B与去氧胆酸加适量磷酸盐缓冲剂制成的无菌冻干粉针。检索 到与本发明相关的专利申请号为02155190. l发明名称两性霉素B脂质体及制备方法， 介绍了一种两性霉素B脂质体的制备方法，市售注射剂LD50约为2. 5 mg/kg，该专利中LD50 约为5.0mg/kg，我们研究对比发现，用本发明制备的两性霉素B长效制剂，LD50约为15.0 mg/kg，分别是上市普通制剂的6倍，两性霉素B脂质体的3倍，具有更好的安全性，非常 具有开发价值。
两性霉素B已经成为临床深度真菌感染危重病人不可缺少的治疗药物，增效减毒是制 剂研究的要点。

发明内容
本发明一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中所述微油滴中包含大量药理 活性物质，所述微油滴通过胆ffi醇通过小分子物以醚键接枝的聚乙二醇醚(PEG- (CH2) n-胆甾醇，其中n为整数，大小为2-10，以下简称PGC)将药理活性物质稳定在油滴中，碳 链长度为2-10，小分二醇选自乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、庚二醇、辛二 醇、任二醇、癸二醇中的一种，通过化学反应以醚键与胆甾醇和聚乙二醇相连，聚乙二醇 选自分子量为20()、 300、 400、 600和1000中的一种，比如PEG300- (CH》2 -胆甾醇、 PEG300- (CH2)广胆M醇、PEG400- (QU 4 -胆甾醇、PEG600- (CH》 -胆甾醇、PEG1000-(CH2) fi -胆甾醇等，PEG- (CH》n -胆甾醇用量以重量计为0. 01%-5%。；所述微滴的平均 粒径不大于1微米，所述乳液可以通过过滤除菌；所述乳液中可以加入冻干支持剂制成冻 干乳，冻干支持剂选自单糖、二糖、多糖或糖醇中的一种或两钟以上，具体包括麦芽糖、 乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇和右旋糖苷中的一种或几种的混 合物，更优选二糖类，所述的用量以重量计为1%-40%。
本发明一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中药理活性剂为两性霉素B，两 性霉素B在乳液中的用量以重量计为0.01%-0.5°/。；乳液中包括至少一种可注射的油、表面 活性剂和稳定剂，其中
a) 可注射的油，可以是任何种类的植物油、动物油、化学改性制造油的一种或其混合 物，其中植物油选自豆油、亚麻子油、茶油、红花油、棉子油、玉米油、月见草油、花生 油、蓖麻油，动物油选自鱼油、鲱油、鲑鱼油或金枪鱼油，化学改性制造的油选自中链甘 油三酯、甘油单酯、甘油二酯、油酸乙酯、棕榈酸异丙酯、聚氧基氢化蓖麻油、长链或中 链脂肪酸或脂肪酸醇中的一种或两种以上的混合物，可注射的油在乳液中的用量以重量计 为1%-20%。
b) 表面活性剂，选自磷脂及其聚乙二醇衍生物、吐温、司盘、泊洛沙姆(poloxa鹏r)、 solutolHS15中的一种或几种，其中磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷 脂酰丝胺酸、鞘磷脂，磷脂聚乙二醇衍生物包括聚乙二醇2000 —磷脂酰乙醇胺
(PEG2000-DSPE)、聚乙二醇IOOO —磷脂酰胆碱，来源不同分为大豆磷脂和蛋黄卵磷脂， 优选蛋黄磷脂，吐温优选吐温80，泊洛沙姆优选泊洛沙姆188;所述表面活性剂的用量以 重量计为0. 5%-10%。
c) 稳定剂，选自甘油、油酸、亚油酸、胆酸钠、去氧胆酸钠、硬脂酸单甘油酯、油酸 乙酯、雾油酸乙酯中的一种或几种，以重量计为0. 20%。
本发明一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，进一步包含抗氧化剂a -生育酚及 其衍生物(如a —生育酚琥珀酸酯)、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA) 、 二 丁基羟基甲苯(BHT)中的一种或几种；还可以含有EDTA、三胺五乙酸和亚硫酸盐中的一种，还可以含有PH值调节剂如盐酸、磷酸、氢氧化钠、乳酸和柠檬酸中的一种。
本发明一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中两性霉素B和PGC通过研磨 溶解在油性组分中，两性霉素B和油性组分在水中形成稳定的分散相；其中分散相的平均 粒径《lum，其制备方法如下
a) 将两性霉素B和PGC加入油性组分，充分研磨制成油相，表面活性剂、稳定剂溶于 适量水中，于50 90'C高速搅拌制成水相，油水两相混合于50 9(TC高速搅拌制成初乳剂， 调节PH值5. 0 7. 0。
b) 取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳化 至乳滴平均粒径《1微米。
C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，热压灭菌既得。
本发明冻干乳其制备方法如下
a) 将两性霉素B和PGC加入油性组分，充分研磨制成油相，表面活性剂、稳定剂、冻 干支持剂溶于适量水中，于50 9(TC高速搅拌制成水相，油水两相混合于50 90'C高速搅 拌制成初乳剂，调节PH值5.0 7.0。
b) 取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳化 至乳滴平均粒径《微米。
C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，冷冻干燥后充氮气压盖既得。
冻干条件如下于零下40 — 5(TC预冻3—6h，升温至零下30 —零下l(TC，真空减压除 去大部分水分，再升温至ox:，继续真空减压除去水分，继续升温除去水分，得干燥的冻干 乳剂。
本发明制备的乳剂可以用于静脉给药、肌肉给药或局部给药。
具体实施例
实施例一
两性霉素BO. 01% 1.0%、 PEG300- (CH》,-胆甾醇0. 01% 2. 0%、生育酚0. 1% 1. 0%、 磷脂1.0°/。 6.0%、泊洛沙姆188 1.0% 6. 0%、植物油1% 10%、油酸1.0% 6. 0%，甘油2 %—6%，注射用水添至100ml。
称取两性霉素B 25mg、加入生育酚0.6g、 PEG300- (CH2) 4 -胆蹈醇0.2g、 10g注射用 大豆油、0.3g油酸，充分研磨制成油相；称取蛋黄卵磷脂1.0g、泊洛沙姆188 2.0g、甘油 3g，加入处方量的水于5(TC 8(TC高速搅拌使充分分散，制成水相。油水两相混合，于50 'C 8(TC高速搅拌制成初乳剂；取初乳剂，注射用水定容至处方量，调节PH值为5.0 7.0，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径《1微米，除菌过滤，充氮气灌装，灭菌既 得。
注整个生产过程需要充氮气保护。
实施例二
两性霉素BO. 01% 1.0%、 PEG400- (CH》广胆甾醇0. 01% 2. 0%、 a-生育酚琥珀酸酯 0.1% 1. 0%、磷脂1. 0% 6. 0%、去胆酸钠0. 1% 1. 0%、植物油1% 10%、油酸1. 0% 6. 0%, 麦芽糖10g、蔗糖10g，注射用水添至100ml。
称取两性霉素B200mg、 PEG600- (CH》e -胆^醇0.4g、 a-生育酚琥珀酸酯0. 6g、加 入3g中链油、加入3g大豆油和0. 3g油酸充分研磨制成油相；称取大豆卵磷脂2. Og、去胆 酸钠0.2g、麦芽糖10g、蔗糖10g，加入处方量的水于5(TC 8(TC高速搅拌使充分分散， 制成水相；油水两相混合，于5(TC 8(TC高速搅拌制成初乳剂，取初乳剂，注射用水定容 至处方量，调节PH值为5.0 7.0，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径《1微 米，除菌过滤，充氮气灌装，低温冷冻干燥既得。
注整个生产过程需要充氮气保护。
实施例三
两性霉素BO. 01% 1. 0%、 PEG300- (CH2).，-胆甾醇0. 01% 2. 0%、 PEG2000-DSPEO. 01% 1. 0%、生育酚0. 1% 1, 0%、磷脂1. 0% 6. 0%、泊洛沙姆188 1. 0% 6. 0%、植物油1% 10%、 中油酸1.0% 6. 0°/。，甘油2%—6%，注射用水添至100ml。
称取两性霉素B 100mg、加入生育酚0.6g、 PEG300- (CH2) 4 -胆甾醇0.2g、注射用大 豆油3g、中链油3g、 0.3g油酸，充分研磨制成油相；称取蛋黄卵磷脂1.2g、泊洛沙姆188 2.4g、 PEG2000-DSPEO. lg、甘油3.6g，加入处方量的水于50。C 8(TC高速搅拌使充分分散， 制成水相；油水两相混合，于5(TC 80'C高速搅拌制成初乳剂；取初乳剂，注射用水定容 至处方量，调节PH值为5.0 7.0，转移至高压乳匀机中，反复乳化至乳滴平均粒径《1微 米，除菌过滤，充氮气灌装，灭菌既得。
注整个生产过程需要充氮气保护。实施例四(血管刺激性试验)
试验药物本发明两性霉素B乳剂，北京金方华医药科技有限公司提供，两性霉素B 注射液组，自制，试验时用0.9%氯化钠注射液配制成5%溶液。
试验动物健康家兔，体重2. 1 2.3kg。
试验方法取健康家兔10只，雌雄各半，按体重及性别分为0. 9%氯化钠注射液对照组
和两性霉素B剂组以及两性霉素B注射液对照药组，每组2只，两性霉素B乳剂组和两性 霉素B注射液组于家兔左耳耳缘按临床给药浓度静脉滴注10ml/kg，滴注速度lml/分，每 日l次，连续7日。对照组同法静脉滴注0.9%氯化钠注射液。除每次给药时及给药后观察 给药局部表现外，于末次静脉滴注后剪下药侧耳廓，常规固定后，在距静脉滴注入针近心 端lcm处，每隔lcrn切取0. 5cm宽标本，共取3块标本。切片染色，进行镜下病理观察， 结果见下表
表l:血管刺激性试验
项目兔耳廓血管扩张红肿有无炎细胞浸润
0. 9%氯化钠注射液对照组—
两性霉素B注射液+++++
两性霉素B乳剂(实施例1)——一
两性霉素B冻干乳剂(实施例2)一—
两性霉素B乳剂(实施例3)——一—
备注"++"严重、"+ "少许、"—"无
前后粒径无显著变化。 实施例五(小鼠急性毒性试验)
取清洁级小鼠40只，分成四组，尾静脉注射，观察动物发应情况，连续观察七天，记 录动物毒性发应情况和死亡动物分布，计算出LD50值，统计结果如下
表3:小鼠尾静脉注射LD50值
实施例1实施例2实施例3市售产品
LD50值15.20 mg/kg15. 20 rag/kg17.00 mg/kg2. 45mg/kg
结果表明本发明两性霉素B冻干乳剂毒性较上市产品分别提高了5 — 7倍，具有市场
开发价值。实施例六(家兔药动力学比较)
试验药物本发明两性霉素B乳剂(按实施例三制备)，两性霉素B注射液组，市售 制剂，试验时用0. 9%氯化钠注射液配制成5%溶液。 试验动物健康家兔，体重2. 1 2.3kg。
试验方法将6只家兔禁食过夜后，随机分为两组，分别交叉从耳缘静脉注射两性霉
素B或市售制剂，给药剂量为lmg/kg。于给药后即刻0.25、 0.5、 1、 2、 3、 5、 8、 12、 16、 24h、 36h从耳缘静脉采取血样2 3ml，置肝素抗凝管中，3000r/min离心10min后分离血 浆，按"血浆样品的处理与测定"处理分析。
试验结果由血药浓度的数据可知在0 36h范围内，两性霉素B乳剂的血药浓度均 高于相应时间市售制剂的血药浓度。两性霉素B乳剂给药后体内血药浓度峰值Cmax为 8.517mg/l，在给药后3h降至4. 262 mg/1，然后缓慢地下降，在给药后24h内，两性霉素 B乳剂的平均血药浓度在8. 517 1. 221 mg/1范围内，在给药后24-36h内，两性霉素B乳 剂的平均血药浓度在1.221 0.251呢/1范围内，而市售制剂给药后，24h内的浓度在 2.558 0. 009mg/l范围内，只有在0 12h内，血药浓度为2. 408 0. 290mg/l才能高于有 效抑菌浓度(O.MOmg/l)，可见两性霉素B乳剂体在体内的抗菌作用要比市售制剂持久， 其抗菌疗效也会更优于市售注射剂。
权利要求
1、一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中所述微油滴中包含大量药理活性物质，所述微油滴通过胆甾醇通过小分子物以醚键接枝的聚乙二醇醚(PEG-(CH2)n-胆甾醇，其中n为整数，大小为2-10)将药理活性物质稳定在油滴中，碳链长度为2-10，小分二醇选自乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、庚二醇、辛二醇、任二醇、癸二醇中的一种，通过化学反应以醚键与胆甾醇和聚乙二醇相连，聚乙二醇选自分子量为200、300、400、600和1000中的一种，PEG-(CH2)n-胆甾醇用量以重量计为0.01％-5％。
2、 根据权利要求l中的乳液，所述乳液中可以加入冻干支持剂制成冻千乳，冻干支持 剂选自单糖、二糖、多糖或糖醇中的一种或两钟以上，具体包括麦芽糖、乳糖、蔗糖、 葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇和右旋糖苷中的一种或几种的混合物，更优 选二糖类，所述的用量以重量计为1%-40%。
3、 根据权利要求l-3中的乳液，其中药理活性剂为两性霉素B，两性霉素B在乳液中 的用量以重量计为0. 01%-0. 5%。
4、 根据权利要求1-4中的乳液，其中包括至少一种可注射的油、表面活性剂和稳定剂， 其中a) 可注射的油，可以是任何种类的植物油、动物油、化学改性制造油的一种或其 混合物，其中植物油选自豆油、亚麻子油、茶油、红花油、棉子油、玉米油、月见草油、花生油、蓖麻油，动物油选自鱼油、鲱油、鲑鱼油或金枪鱼油，化学改性制造的油选自 中链甘油三酯、甘油单酯、甘油二酯、油酸乙酯、棕榈酸异丙酯、聚氧基氢化蓖麻油、 长链或中链脂肪酸或脂肪酸醇中的一种或两种以上的混合物，可注射的油在乳液中的用 量以重量计为1%-20%。b) 表面活性剂，选自磷脂及其聚乙二醇衍生物、吐温、司盘、泊洛沙姆(poloxamer)、 solutolHS15中的一种或几种，其中磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、 磷脂酰丝胺酸、鞘磷脂，磷脂聚乙二醇衍生物包括聚乙二醇2000 —磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)、聚乙二醇IOOO—磷脂酰胆碱，来源不同分为大豆磷脂和蛋黄卵磷脂， 优选蛋黄磷脂，吐温优选吐温80，泊洛沙姆优选泊洛沙姆188;所述表面活性剂的用量 以重量计为0. 5%-10%。c) 稳定剂，选自甘油、油酸、亚油酸、胆酸钠、去氧胆酸钠、硬脂酸单甘油酯、 油酸乙酯、亚油酸乙酯中的一种或几种，以重量计为0. 1%-20%。
5、 据权利要求1一2中的乳液，其特征在于进一步包含抗氧化剂a-生育酚及其衍生物 (如a —生育酚琥珀酸酯)、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(KiA)、 二丁基羟基甲苯QHT)中的一种或几种。
6、 根据权利要求l一2中的乳液其特征在于还可以含有EDTA、三胺五乙酸和亚硫酸盐 中的一种，还可以含有PH值调节剂如盐酸、磷酸、氢氧化钠、乳酸和柠檬酸中的一 种。
7、 根据权利要求l中的乳液，其中两性霉素B通过研磨溶解在油性载体中，两性霉素 B和油性载体在水中形成稳定的分散相；其中分散相的平均粒径《luro。
8、 根据权利要求1-8中的乳液，其制备方法如下a) 将两性霉素B和PEG- (CH2) n-胆甾醇加入油性组分，充分研磨制成油相，表 面活性剂、稳定剂溶于适量水中，于50 9(TC高速搅拌制成水相，油水两相混合于50 9(TC高速搅拌制成初乳剂，调节PH值5. 0 7. 0。b) 取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳 化至乳滴平均粒径《1微米。C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，热压灭菌既得。
9、 根据权利要求1-8中的冻干乳，其制备方法如下a) 将两性霉素B和PEG- (CH2) n -胆甾醇加入油性组分，充分研磨制成油相，表 面活性剂、稳定剂、冻干支持剂溶于适量水中，于50 9(TC高速搅拌制成水相，油水 两相混合于50 9(TC高速搅拌制成初乳剂，调节PH值5. 0 7. 0。b) 取上述(a)中初乳剂，注射用水定容至处方量，转移至高压乳匀机中，反复乳 化至乳滴平均粒径《1微米。C)取上述(b)的乳剂除菌过滤后分装，冷冻干燥后充氮气压盖既得。
全文摘要
本发明公开了一种包含微油滴于水性介质中的水包油乳液，其中所述微油滴中包含大量两性霉素B药理活性物质，所述微油滴通过“胆甾醇通过小分子物以醚键接枝的聚乙二醇醚”(PEG-(CH₂)n-胆甾醇)将两性霉素B稳定在油滴中，可以制成稳定的乳液和冻干乳剂，制成的乳剂与上市产品相比具有明显的缓释效果。
文档编号A61K9/107GK101450039SQ20071019490
公开日2009年6月10日 申请日期2007年12月6日 优先权日2007年12月6日
发明者张文芳 申请人:张文芳