专利名称：一种生物转化合成普拉特霉素a1的方法
技术领域：
本发明公开了一种以麦迪霉素为底物，利用耐热链霉菌突变株，生物转化合成普拉特霉素Al的方法。
背景技术：
大环内酯类抗生素能有效抗革兰氏阳性细菌、支原体、衣原体等，并且由于其可以口服施用以及毒性较低被划分为临床上重要的抗菌剂。麦迪霉素属于16-元环大环内酯类抗生素，是由生米卡链霉菌str印tomyces mycarofaciens (ATCC21454)以及放线菌的类似种产生的。麦迪霉素通过作用于细菌核糖体的50S亚基，阻碍细菌蛋白质的合成而发挥作用。抗菌性能与红霉素相似，对革兰阳性菌和支原体显示很强的抗菌作用。普拉特霉素Al(platenomycin Al)最早是A kio Kinumaki等从普特拉链霉 ^ streptomyces platensis subs p. Malvinus MCRL 0388 中^>畠出 *，当率刀·^·名力 YL704A1，经过了发酵液的浓缩、分离，制备出了相应的盐，并进行了结构确证和抑菌试验，发现该抗生素是一种新的、能够有效抑制革兰氏阳性菌的大环内酯类抗生素(Akio Kinumaki, Isao Takamori. J Antibiot (Tokyo) 1974 Feb ；27 (2) 102-6.)，而且其毒性很低。普拉特霉素Al与麦迪霉素主体结构基本相同，不同之处在于麦迪霉素各组分的碳霉糖环4”位上为丙酰基或丁酰基，而普拉特霉素Al的4”位上为异戊酰基。后来我国姜威等人在研究螺旋霉素酰基化过程中，也发现了中间体普拉特霉素Al (又命名为生技霉素AO)，文中报道了这一化合物的分离，性质及结构(姜威孙承航金文藻中国抗生素杂志2002年第07期)，但至今为止对于普拉特霉素Al的生产方法没有后续研究。耐热链霉菌Str印tomyces thermophilus是一种具有重要工业价值的链霉菌，它能够生物转化泰乐菌素生产乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)。已有的研究表明分别负责乙酰基化和异戊酰基化功能的基因为acyA基因和acyBl基因，以及acyBl的正调节基因acyB2。 本实验室对原有的耐热链霉菌进行了紫外诱变，筛选出了能够转化麦迪霉素为普拉特霉素 Al的诱变菌株，并命名为ST-1，该菌株已经于2010年7月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区大屯路中科院微生物所(邮编 100101)，保藏编号为 CGMCC No. 4040。本发明建立一种以麦迪霉素为底物，利用耐热链霉菌的突变株ST-1，生物转化合成普拉特霉素Al的新生产方法；并且提供了一种新的从转化后的发酵液中提取、纯化普拉特霉素Al的方法，该方法摒弃了传统的溶媒萃取法，在减少环境污染，简化萃取步骤的同时，获得了较纯的普拉特霉素Al固体。
发明内容
本研究的主要目的是提供一种生物转化合成普拉特霉素Al的方法，即以麦迪霉素为底物，利用ST-I，生物转化合成普拉特霉素Al。本研究的另一目的是提供最适的转化合成普拉特霉素Al的发酵条件，其具体条件如下1培养基条件该菌的种子培养基组分为大豆粉，玉米淀粉，酵母提取物，K2HPO4, MgSO4 · 7H20。发酵转化过程中使用培养基组分为玉米淀粉，大豆粉，酵母提取物，MgSO4 · 7H20， K2HPO4, ΚΗ2Ρ04。发酵过程中，因为泡沫的产生，需要在培养基中加入消泡剂，如硅油、植物油或表面活性剂。2培养条件温度、PH及培养时间种子培养过程中的温度和pH =ST-I是好氧菌，在pH6. 0-8. 0范围内，培养温度为 250C _35°C条件下，生长良好。种子培养时间为M-48小时，其中最优生长条件为pH7. 0，温度为34°C，培养时间为30小时。发酵转化过程中的温度和pH:发酵培养基在pH6.0-8.0范围内，温度为 250C _35°C条件下能够进行生物转化，最优发酵条件为pH7. 0，温度为30°C。3发酵过程分为摇瓶和发酵罐两种水平，培养基的碳源、氮源和无机盐组成成分和含量是具有较大差异的，发酵罐培养基的碳源需要在发酵过程中流加葡萄糖。种子培养液接种到发酵培养基中的接种量为2% _10%，摇瓶的最优接种量为6 %，发酵罐的最优接种量为3%。摇瓶转化时，当种子在发酵培养基中生长约30-40小时后，一次性补入底物，底物麦迪霉素的配制，是利用磷酸调PH至酸性，使麦迪霉素完全溶解转变成盐溶液后，补入培养液中，继续转化48-60小时；发酵罐转化时，当种子在发酵罐中培养30-40小时后，通过蠕动泵流加补麦迪霉素底物盐溶液，补48hr，停止补料后，继续培养12-20小时，当普拉特霉素Al的转化量达到最高值下罐。4液相检测普拉特霉素Al 生物转化过程中，取10_30ml发酵液，加入同等体积的 50%甲醇，超声波处理30min-lhr，再经过0. 45um滤膜过滤发酵液，处理过的样品进行高效液相检测，检测麦迪霉素转化成普拉特霉素Al的转化率。本发明的另一目的是提供一种普拉特霉素Al的提取、纯化工艺，采用了酸提取、 碱沉淀的技术方案。具体步骤如下1 一次酸溶发酵液中的麦迪霉素被大部分转化成普拉特霉素Al，用无机酸或有机酸溶液调节发酵液成酸性，PH达2-6，优选pH3-4使发酵液中的普拉特霉素Al溶解出来， 搅拌，离心或膜过滤，得到“普拉特霉素Al —次酸溶液”。2碱沉淀除杂质上述“普拉特霉素Al —次酸溶液”加入碱性溶液调PH7. 0-8. 0， 优选PH为7. 0-7. 5，发酵液离心或过滤，去除一部分沉淀杂质，保留发酵液滤液。3上述发酵液滤液继续加入碱性溶液调PH9. 0-11. 0，优选9. 0-10. 0,发酵液离心或过滤，得到“普拉特霉素Al —次碱沉淀”。 4 “普拉特霉素Al 一次碱沉淀”中加入酸性溶液调P H2-6，优选pH3_4，溶解该沉淀，得到“普拉特霉素Al盐溶液”。5 “普拉特霉素Al盐溶液”中加入碱性溶液调PH9. 0_11，优选9. 0-10. 0,发酵液离心或过滤，得到“普拉特霉素Al次碱沉淀”，对该沉淀物进行常规精制、干燥处理，得到较纯的“普拉特霉素Al碱固体物”成品。6 “普拉特霉素Al碱固体物”继续用ODS或三硅酸镁层析柱进行层析分离，分段收集，结合高效液相色谱检测，收到纯度较高的“普拉特霉素Al甲醇溶液”，蒸干浓缩得到高纯度的普拉特霉素Al固体。本发明普拉特霉素Al的提纯方法，所述的碱性溶液包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水中的一种；所述的酸性溶液包括硫酸、盐酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸中的一种。
以下，结合附图来详细说明本发明原理和实施方案，其中图1ST-1摇瓶水平转化麦迪霉素发酵液的高效液相2普拉特霉素Al的结构3ST-1发酵罐水平转化麦迪霉素发酵液的高效液相4提取纯化后的高纯度普拉特霉素Al高效液相图
具体实施例方式下面通过具体的实施方案叙述本发明中，除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养剂组分、含量、培养条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。实施例1 以麦迪霉素为底物，摇瓶水平生物转化合成普拉特霉素Al。1种子培养方法从改良高氏一号培养基上挑取ST-I单菌落，接入种子摇瓶培养基中，种子摇瓶培养基装量为50ml/500ml摇瓶，34°C摇床，200RPM培养30hr。2发酵转化方法取3ml种子培养液接种于发酵摇瓶培养基中，发酵摇瓶培养基装量为50ml/500ml 摇瓶，30°C发酵35hr后，向培养液中加入麦迪霉素底物，继续转化50hr后，下摇床。3液相检测麦迪霉素和普拉特霉素Al取发酵液10ml，加入50%甲醇10ml，超声波处理30min，0. 45um滤膜过滤发酵液， 处理过的样品进行LC-MS，检测到分子量为842的峰。高效液相结果如图1所示，保留时间 5. 9min的峰为麦迪霉素，保留时间10. Omin的峰为普拉特霉素Al，表明麦迪霉素被转化成普拉特霉素Al，普拉特霉素Al的结构图如图2。以下是该实例中应用到的一些培养基成分(包含一些单项的制备方法)ST-I种子摇瓶培养基大豆粉15g，玉米淀粉 30g，酵母提取物 2g，K2HPO4 0. 5g，MgSO4 · 7 H2O 0. 5g，自来水 1000ml，pH 7·0。发酵摇瓶培养基玉米淀粉30g，大豆粉 30g，酵母提取物 2g，MgSO4 · 7 H2O 5g，K2HPO4 100g， KH2P0460g,消泡剂 0. 2ml,自来水 1000ml，PH 7. 0o
底物配制及补料方法将IOg麦迪霉素放入IOOml蒸馏水中，利用磷酸调整pH值至3. 0，使麦迪霉素完全溶解，用0. 22微米无菌过滤器过滤除菌，制得麦迪霉素补料液，取2ml麦迪霉素加入50ml 发酵液中。检测效价用流动相的配制乙腈甲酸铵=阳45，甲酸铵溶液浓度为0. 1M，检测波长为232nm。实施例2 以寿迪霉素为底物，发酵罐水平牛物转化合成普拉特霉素Al。1种子培养方法从改良高氏一号培养基上挑取ST-I单菌落，接入种子摇瓶培养基中，种子摇瓶培养基装量为50ml/500ml摇瓶，34°C摇床，200RPM培养30hr。2、50L发酵罐放大实验 本发酵过程分为两个发酵阶段(1)菌体培养阶段，将900ml种子液接种到发酵液中，50L发酵罐中的发酵液装量为30L，在培养温度为30°C，发酵罐转速为200rpm，通气量为20vvm的条件下培养35hr ；在该阶段进行过程中，菌体大量生长，为下一步的生物转化提供足够的转化细胞。(2)生物转化阶段，以后，通过蠕动泵流加补料液，补料液分别为10%麦迪霉素溶液和60%葡萄糖溶液，流加速度分别为40ml/hr和13ml/hr，补料时间为48小时，停止补料后，继续培养iair (培养条件如菌体培养阶段)后，普拉特霉素Al的转化量达到最高值，下罐。生物转化过程中每8hr取IOml发酵液经过处理后，进行LC-MS检测，得到普拉特霉素Al，高效液相结果如图3，保留时间5. 9min的峰为麦迪霉素，保留时间10. Imin的峰为普拉特霉素Al，表明麦迪霉素被转化成普拉特霉素Al。以下是该实例中应用到的一些培养基成分(包含一些单项的制备方法)发酵罐中的发酵培养基玉米淀粉30g，大豆粉 30g，酵母提取物 4g，MgSO4 · 7 H2O 5g，K2HPO4 100g， KH2P0460g,消泡剂 0. 2ml,自来水 1000ml, PH 7. 0-7. 2。底物配制将90g麦迪霉素放入900ml蒸馏水中，利用磷酸调整pH值至3. 0，使麦迪霉素完全溶解，使用0. 22微米无菌过滤器过滤除菌，制得麦迪霉素补料液将390g葡萄糖溶于蒸馏水，定容至650L，制得葡萄糖补料液。实施例3 普拉特霉素Al提取、纯化过程1得到ST-I转化麦迪霉素的发酵液30L，，用40%磷酸调节发酵液PH达4. 0，溶解发酵液中的普拉特霉素Al，搅拌lhr，用5%的硅藻土作为助滤剂，4000rpm，离心30min，得到含有“普拉特霉素Al —次酸溶液”。2上述“普拉特霉素Al 一次酸溶液”中加入40%氢氧化钠溶液调PH到7. 0，搅拌 Ihr，4000rpm,离心30min，弃沉淀，这一步骤去除掉大部分发酵液中的杂蛋白，保留上清。3上一步发酵液上清中继续加入40%氢氧化钠调PH9. 0，搅拌lhr，4000rpm，离心 30min,得到沉淀为“普拉特霉素Al 一次碱沉淀”。4 “普拉特霉素Al 一次碱沉淀”中加入40%磷酸调P H 4. 0，搅拌30min，溶解该沉淀，4000rpm离心30min，保留上清。进一步去除了部分杂质，得到“普拉特霉素Al磷酸盐溶液”。
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5 “普拉特霉素Al磷酸盐溶液”中加入40%氢氧化钠溶液调PH9. 5，搅拌lhr， 4000rpm离心30min，得到沉淀为“普拉特霉素Al 二次碱沉淀”，该碱沉淀于40°C烘干，用纯甲醇溶解，离心，去除沉淀，该沉淀大部分为不溶于甲醇的盐类杂质，取上清液浓缩蒸干，得到“普拉特霉素Al固体粗品” 20g，用高效液相的方法测得，该粗品的纯度大约为60%。6 “普拉特霉素Al固体粗品”2g用ODS层析柱进行分离，采用直径5cm，高为60cm 的ODS柱，样品用50%甲醇水溶解，甲醇水的梯度从50%-80%逐渐提高，分段收集，结合高效液相色谱检测，最后80%甲醇水洗脱出普拉特霉素Al，“普拉特霉素Al甲醇溶液”蒸干浓缩，得到普拉特霉素Al固体lg，进行高效液相检测，如图4，保留时间9. 5min的峰为普拉特霉素Al，其纯度大于90%。
权利要求
1.一种发酵转化麦迪霉素为普拉特霉素Al的方法，其特征在于以麦迪霉素为前体， 利用耐热链霉菌(Sti^ptomyces thermophilus) ST-1，进行生物转化生产普拉特霉素Al。
2.一种如权利要求1所述发酵转化麦迪霉素为普拉特霉素Al的方法，包括如下步骤(1)将在种子培养基中培养好的种子液接入发酵培养基开始发酵；(2)当发酵过程中补入底物麦迪霉素和葡萄糖，进行生物转化合成普拉特霉素Al；(3)对含有普拉特霉素Al的发酵液进行提取、分离、纯化，得到高纯度普拉特霉素Al。
3.如权利要求1所述的生物转化合成普拉特霉素Al的方法，其特征在于发酵培养基菌种接种量为2-10% ；发酵温度为25°C -35°C ；发酵转化过程中，菌种培养30_40hr后开始补入麦迪霉素底物。
4.如权利要求1所述生物转化合成普拉特霉素Al的发酵条件，其特征在于耐热链霉菌ST-I的种子培养基组分为大豆粉，玉米淀粉，酵母提取物，K2HPO4, MgSO4 · 7H20 ；发酵转化培养基组分为玉米淀粉，大豆粉，酵母提取物，MgSO4 · 7H20, K2HPO4, KH2PO4 ；种子培养温度为25°C -35°C、pH为6. 0-8. 0，种子培养时间为24-48小时，发酵转化温度为25°C _35°C、 PH为6. 0-8. 0 ；种子在发酵培养基中生长约30-40小时后，一次性补入底物麦迪霉素。
5.如权利要求3所述生物转化合成普拉特霉素Al的发酵条件，其特征在于所述底物麦迪霉素为麦迪霉素可溶性盐溶液。
6.一种普拉特霉素Al的提取、分离、纯化方法，包括如下步骤(1)一次酸溶用无机酸或有机酸调节发酵液成酸性，PH达2-6，搅拌，离心或膜过滤， 得到普拉特霉素Al的一次酸溶液；(2)碱沉淀除杂质上述“普拉特霉素Al—次酸溶液”加入碱性溶液调pH7. 0-8. 0，发酵液离心或过滤，保留发酵液滤液；(3)上述发酵液滤液继续加入碱性溶液调pH9.0-11. 0，发酵液离心或过滤，得到“普拉特霉素Al —次碱沉淀”；(4)“普拉特霉素Al —次碱沉淀”中加入酸性溶液调pH2. 0-6. 0，溶解该沉淀，得到“普拉特霉素Al盐溶液”；(5)“普拉特霉素Al盐溶液”中加入碱性物质调pH9. 0-11，发酵液离心或过滤，得到 “普拉特霉素Al 二次碱沉淀”，对该沉淀物进行常规精制、干燥处理，得到较纯的“普拉特霉素Al碱固体物”成品；(6)“普拉特霉素Al碱固体物”用ODS或三硅酸镁层析柱进行层析分离，分段收集，结合高效液相色谱检测，收到纯度较高的“普拉特霉素Al碱甲醇溶液”，蒸干浓缩得到高纯度的普拉特霉素Al固体。
7.—种如权利要求6所述麦迪霉素转化普拉特霉素Al的提取、分离、纯化方法，其特征在于所述的碱性溶液包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水中的一种。
8.—种如权利要求6所述麦迪霉素转化普拉特霉素Al的提取、分离、纯化方法，其特征在于所述的酸性溶液包括硫酸、盐酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种生物转化合成普拉特霉素A1的方法，本发明技术方案如下在ST-1作用下，以麦迪霉素为底物，通过生物转化的方法合成普拉特霉素A1，以及从转化后的发酵液中提取、分离、纯化，得到高纯度普拉特霉素A1。用此方法生产普拉特霉素A1的技术先进，工艺简单，适用于工业化生产。另外后提取技术摒弃了传统意义上的有机溶媒萃取法，减少环境污染，简化提纯步骤，降低生产成本，更适用于工业化生产。
文档编号C12R1/465GK102344946SQ20101024204
公开日2012年2月8日 申请日期2010年8月2日 优先权日2010年8月2日
发明者吴家鑫, 曹芹, 葛辛玫, 蔡健, 郑应华, 齐鹏 申请人:中牧实业股份有限公司