专利名称：一种马鹿鹿茸多肽及其治疗骨病的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体涉及一种源自马鹿鹿茸的多肽及其制备骨病的用途。
背景技术：
鹿茸为雄鹿的嫩角，带茸毛，含血液，是一种贵重的中药；鹿茸甘、咸，温，归肾、肝经，具有增强机体免疫力、抗衰老等功能。每年在鹿茸的生长期，骨轴的延伸很快，可达1 2cm/d，在90 120天内完成从骨细胞分化发育到成熟的全过程，相应表皮层也要增生、以便覆盖新增长的骨质，其生长速度是哺乳动物任何组织和器官无法比拟的，且每年鹿茸都进行周期性替换(鹿茸的再生)，一般要经过脱盘、生茸、骨化、脱落、再生茸的循环过程。鹿茸肽不仅是鹿茸每年1 2次生长、成熟所必须的组分，同时也是鹿茸组织细胞重要构成物质和分子信号传递的承载者。如缺失了相应多肽组分，鹿茸就会停滞发育，功能系统就会发生紊乱，甚至出现各种慢性病。人服用鹿茸多肽组分后，人体对其吸收表现出以下特点不需消化，直接优先吸收，吸收快速且以完整的形式被人体吸收；吸收肽不需消耗人体能量，肽是以自身的能量迫使人体吸收。吸收后不会有任何排泄物，对于因消化系统缺陷、障碍、损伤，而不能吸收营养者，具有较好的吸收的特点。这对于那些消化能力差、营养缺乏、身体虚弱者，有着重要的意义。现代医学也表明，鹿茸多肽中主要有胰岛素样生长因子、神经生长因子、表皮生长因子、转化生长因子及相关鹿茸多肽。药理学研究表明鹿茸多肽有免疫功效和抗肿瘤作用。马鹿(Cervus elaphus)是属于鹿科的一种，为大型鹿的一种。体形较大，体重200 公斤，身长2米余，背脊平直。新疆塔里木马鹿是中国马鹿品系中的一个地域性极强的亚种，仅分布于塔里木河中下游和车尔臣河下游地区，独特的环境造就了塔里木马鹿产茸能力高。
发明内容
本发明公开了一种马鹿鹿茸多肽，它是马鹿鹿茸的5 IOkD分子量的多肽总提物。本发明的5 IOkD分子量的马鹿鹿茸多肽总提物优选用下列方法制备将马鹿鹿茸粉碎后用醋酸钠缓冲液浸提，浸提液离心后的上清液经0. 45 μ m水系混合滤膜滤过，得总多肽粗提液，总多肽粗提液经乙醇沉淀除杂蛋白，先后经10000MWC0和 5000MWC0切向超滤膜包截留，取5000MWC0截留部分浓缩、冻干即得。醋酸钠缓冲液优选pH = 3. 5。其中马鹿鹿茸粉碎前优选先经乙醇水浸泡，烘干后在粉碎。浸提优选采用冰浴浸提。药效学试验显示，本发明的马鹿鹿茸多肽在治疗骨病方面药效要优于马鹿鹿茸总多肽。可用于治疗骨折、骨质疏松性骨折和骨质疏松症等疾病。下面是本发明的部分药效学试验及结果。
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一、鹿茸肽对成骨细胞增殖的作用的研究1.实验原理成骨细胞在骨形成过程中需要经历，细胞增殖、细胞分化及细胞矿化过程。在细胞生长早期，成骨细胞处于增殖状态，并且1型胶原分泌增加；细胞生长中期，增殖效果减缓，碱性磷酸酶(ALP)分泌增加，水解对骨矿化有抑制作用的无机焦磷酸盐，使骨矿化增强，并调节Ca2+，P3+浓度，增强骨矿化；细胞生长晚期，成骨细胞分泌骨保护素(0PG)，骨钙素 (OCN)，骨结合素(ON)等，促进骨矿化，并产生矿化结。2.受试药样A 新疆塔里木马鹿鹿茸总肽；样B 新疆塔里木马鹿鹿茸分子量大于IOkD的多肽总提物；样C 新疆塔里木马鹿鹿茸分子量5 IOkD多肽总提物；样D 东北梅花鹿鹿茸总肽；样E 东北梅花鹿鹿茸分子量大于IOkD的多肽总提物；样F 东北梅花鹿鹿茸分子量5 IOkD的多肽总提物；上述马鹿鹿茸总肽的提取方法可以参照相关文献，也可用下列方法提取将马鹿鹿茸干品锯成小段，浸入乙醇-水O 1)，4°C，浸泡7天，取出切片，37°C 烘干，干茸片打成粉末，称重，按每Ig加入5mmo 1/L NaA c-HAc缓冲液(pH 3. Q20mL，冰浴，搅拌浸提12h ；4°C，12000转/分钟离心20分钟，得上清；-0. ImPa, 0. 45 μ m水系混合滤膜滤过，滤出液为马鹿鹿茸干品总多肽粗提液，乙醇沉淀除杂蛋白，上清液冻干得淡黄色粉末。获得马鹿鹿茸总肽。上述马鹿鹿茸分子量大于IOkD的多肽总提物的提取方法可以参照相关文献，也可用下列方法提取将马鹿鹿茸干品锯成小段，浸入乙醇-水O 1)，4°C，浸泡7天，取出切片，37°C 烘干，干茸片打成粉末，称重，按每Ig加入5mmo 1/L NaA c-HAc缓冲液(pH 3. 5) 20mL, 冰浴，搅拌浸提12h ；4°C, 12000转/分钟离心20分钟，得上清；-0. ImPa,0. 45 μ m水系混合滤膜滤过，滤出液为马鹿鹿茸干品总多肽粗提液，乙醇沉淀除杂蛋白，每IOOOmL经 IOOOOMffCO (PES)切向超滤膜包截留浓缩至约50mLj#> IOkD组分(Mr > 10000)，冻干得淡黄色粉末。样C的新疆塔里木马鹿鹿茸分子量5 IOkD多肽总提物用实施例1方法制备得到。样F参照实施例1的方法，只是原料换成东北梅花鹿鹿茸。3.实验方法1)成骨细胞培养采用酶消化法培养大鼠成骨细胞，取新生SD大鼠(雌雄不限)，取出颅骨，清理骨膜、血管等结缔组织，PBS清洗颅骨3遍至白色，并剪成ImmX Imm的骨片。加入0. 25%胰蛋白酶于37°C消化20min，以清除纤维组织；加入0. II型胶原酶于37°C振荡消化60min。 细胞消化液经200目筛网过滤，于1000r/min离心lOmin，沉淀细胞用α -MEM+10% FBS制成悬液，重复上述II型胶原酶消化步骤。将2次消化获得的细胞混勻，并接种于培养瓶内， 置于5% CO2培养箱中培养。每2 3天换液一次，倒置显微镜下严密观察细胞生长状况，待细胞长满瓶底80%，用0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化传代培养。取生长良好的第3 代细胞用于实验及细胞功能鉴定。2)大鼠成骨细胞鉴定碱性磷酸酶(ALP)染色取第3代成骨细胞，以1 X IO6细胞/孔，接种于6孔板中。 培养2天，用95%乙醇固定15min，PBS洗涤3次，用BCIP/NBT染色法进行ALP染色。根据 BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒说明，将适量BCIP/NBT充分覆盖细胞样品，室温避光孵育 Mh，蒸馏水冲洗。自然干燥，置于显微镜下观察。细胞矿化结染色将第3代成骨细胞，以1 X IO6细胞/孔，接种于6孔板中。待细胞80%汇合，将α -MEM+10% FBS培养基更换为α -MEM+10% FBS+IOmM β甘油磷酸二钠盐 +50 μ g/ml维生素C诱导培养基。细胞培养14天，进行茜素红染色。95%乙醇固定lOmin， 蒸馏水洗3次；37°C，0.5%茜素红染色30min。蒸馏水冲洗，自然干燥，置于显微镜下观察。3)细胞增殖测定将第3代成骨细胞以IX IO5细胞/孔，接种于96孔培养板。培养24h后更换低血清α -MEM,分别加入10_7g/ml，10 Vml, 10_5/ml不同肽段的鹿茸肽，每组重复5孔。给药 1(1，3(1，7(1，每孔加入0.51^/1111 MTT 20 μ 1，于37°C、5% CO2条件下继续孵育4h，弃去培养液，加入DMSO 150 μ 1，振荡lOmin，于酶标仪570nm波长下测定个孔的吸光度值。4)碱性磷酸酶(ALP)活力测定将第3代成骨细胞，以1 X IO6细胞/孔，接种于6孔板中。培养24h后更换低血清 α -ΜΕΜ，分别加入 l(T7g/ml，10_6g/ml，10_5/ml 不同肽段的鹿茸肽。给药 3d，7d，"TritonX-lOO 提取蛋白，并用BCA法定量检测蛋白。依据碱性磷酸酶检测试剂盒说明，在96孔板中加入 20 μ 1蛋白上清液与100 μ 1 PNPP溶液。于37°C下孵育15min，中止反应，于酶标仪405nm 波长下测定个孔的吸光度值。5)统计学处理所有实验数据均采用统计学方法处理。均值间差异比较采用组间t检验，数据统计均以平均值士标准差(h )表示，以P < 0. 05(*)，P < 0. 01 (#)，P < 0. 001 (*#)为显
著水平。4、试验结果1)不同的鹿茸肽对成骨细胞增殖影响骨折、骨质疏松骨折及骨质疏松，成骨细胞都扮演这重要的角色，在骨折恢复过程中成骨细胞在骨形成中需要经历，细胞增殖、细胞分化及细胞矿化过程。在细胞生长早期， 成骨细胞处于增殖状态，并且1型胶原分泌增加；细胞生长中期，增殖效果减缓，碱性磷酸酶(ALP)分泌增加，水解对骨矿化有抑制作用的无机焦磷酸盐，使骨矿化增强，并调节Ca2+， P3+浓度，增强骨矿化，达到促进骨愈合，骨再生的效果。结果见表1，表1显示，新疆塔里木马鹿鹿茸肽(样A、样B、样C)均显著促进成骨细胞增殖作用(*P < 0. 05，**P < 0. 01或 ***P < 0. 001)。药效明显好于梅花鹿鹿茸肽。并且，新疆塔里木马鹿鹿茸分子量5 IOkD 多肽总提物药效明显好于新疆塔里木马鹿鹿茸总肽和新疆塔里木鲜马鹿鹿茸分子量大于 IOkD的多肽总提物。提示新疆塔里木马鹿鹿茸分子量5 IOkD多肽总提物可以通过促进成骨细胞增殖达到治疗骨折、骨质疏松骨折及骨质疏松的目的。表1鹿茸肽对不同时间点成骨细胞增殖作用
权利要求
1.一种马鹿鹿茸多肽，其特征是它是马鹿鹿茸5 IOkD分子量的多肽总提物。
2.权利要求1的马鹿鹿茸多肽，由以下方法制备将马鹿鹿茸粉碎后用醋酸钠缓冲液浸提，浸提液离心后的上清液经0. 45 μ m水系混合滤膜滤过，得总多肽粗提液，总多肽粗提液经乙醇沉淀除杂蛋白，先后经10000MWC0和5000MWC0切向超滤膜包截留，取5000MWC0截留部分浓缩、冻干即得。
3.权利要求1的马鹿鹿茸多肽，其中马鹿鹿茸是新疆塔里木马鹿鹿茸。
4.权利要求1的马鹿鹿茸多肽用于制备治疗骨病的药物的用途。
5.权利要求4的用途，其中骨病是骨折。
6.权利要求4的用途，其中骨病是骨质疏松性骨折。
7.权利要求4的用途，其中骨病是骨质疏松症。
全文摘要
本发明涉及医药领域，具体涉及一种源自马鹿鹿茸的多肽及其制备骨病的用途。其特征是本发明为马鹿鹿茸5～10kD分子量的多肽总提物，下列方法制备将马鹿鹿茸粉碎后用醋酸钠缓冲液浸提，浸提液离心后的上清液经0.45μm水系混合滤膜滤过，得总多肽粗提液，总多肽粗提液经乙醇沉淀除杂蛋白，先后经10000MWCO和5000MWCO切向超滤膜包截留，取5000MWCO截留部分浓缩、冻干即得。本发明多肽可用于治疗骨病，特别是骨折、骨质疏松性骨折和骨质疏松症。
文档编号A61P19/08GK102429923SQ20111041024
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者刘中天, 姜宁, 季晖, 尚靖, 杨代正, 武嘉林, 洪勇, 陈雪梅, 马芹, 高向东 申请人:新疆华世丹药业股份有限公司, 新疆华世丹药物研究有限责任公司