用于治疗copd恶化的组合物和方法

专利名称：用于治疗copd恶化的组合物和方法
技术领域：
本公开涉及使用诸如抗体的抗-IL-IRl和抗-IL-I α拮抗剂治疗慢性阻塞性肺病(COPD)恶化的方法。
背景技术：
COPD代表严重且日益增加的全球健康问题。到2020年，COPD将由全球死亡最常见原因的第6位(其目前的)上升至第3位。在英国，COPD目前每年引起30，000例死亡，而在美国，认为其每年引起多达120，000例死亡(Lopez & Murray 1998)。临床上，COPD是异质性疾病，其涵盖两种主要的病理表现，两种表现的各个方面经常见于同一患者伴有纤维化和小气道阻塞的慢性阻塞性支气管炎，和伴有空间扩大和肺实质破坏的肺气肿、肺弹性的丧失和小气道的闭合(Barnes2004)。COPD的恶化在其对患者的延长的有害作用、加速疾病进展和高医疗保健成本方面具有重大意义(Wedzicha & Donaldson 2003)。白细胞介素(IL)-I是多功能细胞因子，其在免疫介导的疾病和感染期间的炎症反应中起重要作用。IL-I由受到细菌产物、病毒、细胞因子或免疫复合物的刺激后的各种细胞类型产生。IL-I展现对多种细胞类型的自分泌和旁分泌活性，促进炎症介导物如前列腺素、一氧化氮、细胞因子、趋化因子、金属蛋白酶和粘附分子的产生。发明概述COPD恶化是COPD患者的严重并发症。存在治疗COPD的恶化(C0PD恶化)的需要。这一独特的患者亚组(具有恶化或处于恶化时期的那些)具有与CCffD相关的增加的发病率和死亡率，包括显著疾病进展的增加的风险。一类此种试剂是特异性结合IL-IRl和抑制IL-IRl与IL-I α以及任选地IL-I β的结合的试剂。另一类试剂是特异性结合IL-I α和抑制IL-Ia结合IL-IRl的试剂。在某些实施方案中，本公开的试剂是拮抗剂。在某些实施方案中，本公开的试剂是抗体或抗体片段。本公开涉及治疗CCffD恶化的方法。在某些实施方案中，本公开涉及在有此需要的患者中减轻气道炎症的方法。在某些实施方案中，本公开涉及在有此需要的患者中增加肺功能的方法。在第一方面，本公开提供在有此需要的患者中减轻气道炎症的方法，其中所述患者是患有慢性阻塞性肺病(COPD)恶化的患者。该方法包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-IRl的抗体的组合物。例如，该抗体特异性结合IL-IRl和抑制IL-IRl与IL-Ia的结合。在某些实施方案中，该抗体还抑制IL-IRl与IL-I β的结合。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中治疗慢性阻塞性肺病(COPD)恶化的方法。该方法包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-IRl的抗体的组合物。例如，该抗体特异性结合IL-IRl和抑制IL-IRl与IL-I α的结合。在某些实施方案中，该抗体还抑制IL-IRl与IL-I β的结合。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中治疗coro恶化的方法，其中所述患者是由于人鼻病毒诱导的气道炎症而患有COPD恶化的患者。该方法包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-IRl的抗体的组合物。例如，该抗体特异性结合IL-IRl和抑制IL-IRl与IL-I α的结合。在某些实施方案中，该抗体还抑制IL-IRl与IL-I β的结合。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中治疗coro恶化的方法，其中所述患 者是由于病毒感染而患有COPD恶化的患者。该方法包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-IRl的抗体的组合物。例如，该抗体特异性结合IL-IR和抑制IL-IRl与IL-I a的结合。在某些实施方案中，该抗体还抑制IL-IRl与IL-I β的结合。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中治疗coro恶化的方法，其中所述患者是由于细菌感染而患有COPD恶化的患者。该方法包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-IRl的抗体的组合物。例如，该抗体特异性结合IL-IR和抑制IL-IRl与IL-I a的结合。在某些实施方案中，该抗体还抑制IL-IRl与IL-I β的结合。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中降低IL-Ia信号转导的方法，其中所述患者是患有慢性阻塞性肺病(COPD)恶化的患者。该方法包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-IRl和抑制IL-IRl与IL-I α结合的抗体的组合物。治疗的方法包括施用单次剂量，以及根据治疗时间表施用多于一次剂量。以下列出的各种特征适用于本公开的任何前述或下述方面(和实施方案)。在某些实施方案中，减轻气道炎症是治疗COPD恶化的方法的一部分。在某些实施方案中，减轻气道炎症包括降低嗜中性粒细胞向肺的流入。在某些实施方案中，治疗COPD恶化包括减轻气道炎症。在某些实施方案中，治疗COPD恶化包括降低嗜中性粒细胞向肺的流入。在某一实施方案中，抗体具有大于或等于约25千道尔顿的分子量。在某些实施方案中，抗体具有约150千道尔顿的分子量。在某些实施方案中，所述抗体抑制IL-IRl与IL-I α和IL-I β的结合。在某些实施方案中，所述抗体是人抗体。在某些实施方案中，所述抗体可特异性结合人IL-IRl。在某些实施方案中，所述抗体可特异性结合来自一种或多种非人灵长类物种的IL-IRl。在某些实施方案中，所述抗体不特异性结合鼠或啮齿动物IL-IRl。在某些实施方案中，所述方法是用于治疗COPD的治疗方案的一部分。在某些实施方案中，用于治疗COPD的治疗方案包括类固醇的施用。在某些实施方案中，COPD恶化由细菌感染、病毒感染或其组合引起。在某些实施方案中，在COPD恶化之前，所述患者患有分类为GOLD III期或GOLD IV期的C0PD。在某些实施方案中，当通过Biacore 测量时，所述抗体以50pM或更低的Kd特异性结合IL-IRl。在某些实施方案中，当通过Biacore 测量时，所述抗体以300pM或更低的Kd特异性结合IL-IRl。
在某些实施方案中，所述抗体与IL-IRa竞争结合IL-IRl。在某些实施方案中，施用是全身施用。在某些实施方案中，所述方法不包括所述组合物的鼻内施用。在某些实施方案中，所述方法不包括所述组合物的鼻内施用并且不包括所述组合物向肺的其他形式的局部施用。在某些其他实施方案中，拮抗剂经由两种不同的途径施用。此类施用可以是在相同时间或在不同时间。例如，在某些实施方案中，拮抗剂是全身(如静脉内)和鼻内施用。在其他实施方案中，拮抗剂经由全身途径和经由局部递送至肺的途径施用。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中减轻气道炎症的方法，其中所述患者是患有慢性阻塞性肺病(COPD)恶化的患者，包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-I α和抑制IL-I α与IL-IRl结合的抗体的组合物。相似地，包括IL-I α拮抗剂的施用。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中治疗慢性阻塞性肺病(COPD)恶化的方法，包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-Ia和抑制IL-I α与IL-IRl结·合的抗体的组合物。相似地，包括IL-I α拮抗剂的施用。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中治疗CCffD恶化的方法，其中所述患者是由于人鼻病毒诱导的气道炎症而患有COPD恶化的患者，包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-I α和抑制IL-I α与IL-IRl结合的抗体的组合物。相似地，包括IL-Ia拮抗剂的施用。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中治疗COPD恶化的方法，其中所述患者是由于病毒感染而患有coro恶化的患者，包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-I α和抑制IL-I α与IL-IRl结合的抗体的组合物。相似地，包括IL_1 α拮抗剂的施用。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中治疗COPD恶化的方法，其中所述患者是由于细菌感染而患有COPD恶化的患者,包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-I α和抑制IL-I α与IL-IRl结合的抗体的组合物。相似地，包括IL_1 α拮抗剂的施用。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中降低IL-Ia信号转导的方法，其中所述患者是患有慢性阻塞性肺病(COPD)恶化的患者,包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-I α和抑制IL-I α与IL-IRl结合的抗体的组合物。相似地，包括IL_1 a拮抗剂的施用。治疗的方法包括施用单次剂量，以及根据治疗时间表施用多于一次剂量。以下列出的各种特征适用于本公开的任何前述或下述方面(和实施方案)。在某些实施方案中，减轻气道炎症是治疗COPD恶化的方法的一部分。在某些实施方案中，减轻气道炎症包括降低嗜中性粒细胞向肺的流入。在某些实施方案中，治疗COPD恶化包括减轻气道炎症。在某些实施方案中，治疗COPD恶化包括降低嗜中性粒细胞向肺的流入。在某些实施方案中，所述抗体具有大于或等于约25千道尔顿的分子量。在某些实施方案中，所述抗体具有大约150千道尔顿的分子量。在某些实施方案中，所述抗体是人抗体。在某些实施方案中，所述抗体可特异性结合人IL-I α。在某些实施方案中，所述抗体可特异性结合来自一种或多种非人灵长类物种的IL-I α。在某些实施方案中，所述抗体不特异性结合鼠IL-I α。在某些实施方案中，所述方法是用于治疗COPD的治疗方案的一部分。在某些实施方案中，用于治疗COPD的治疗方案包括类固醇的施用。在某些实施方案中，COPD恶化由细菌感染、病毒感染或其组合引起。在某些实施方案中，在coro恶化之前，所述患者患有分类为 GOLD III 期或 GOLD IV 期的 COPD。在某些实施方案中，施用是全身施用。在某些实施方案中，所述方法不包括所述组合物的鼻内施用并且不包括所述组合物向肺的其他形式的局部施用。在某些实施方案中，所述方法不包括所述组合物的鼻内施用。在某些其他实施方案中，拮抗剂经由两种不同的途径施用。此类施用可以是在相同时间或在不同时间。例如，在某些实施方案中，拮抗剂是全身(如静脉内)和鼻内施用。在其他实施方案中，拮抗剂经由全身途径和经由局部递送至肺的途径施用。
在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中治疗coro恶化的方法，其中所述患者是由于人鼻病毒诱导的气道炎症而患有COPD恶化的患者。该方法包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合和抑制IL-IRl的IL-IRl拮抗剂的组合物。在某些实施方案中，IL-IRl拮抗剂特异性结合和抑制IL-IRl与IL-Ia和/或β的结合。在某些实施方案中，使用本文描述的任何测定评估拮抗作用。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中治疗COPD恶化的方法，其中所述患者是由于病毒感染而患有COPD恶化的患者。该方法包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合和抑制IL-IRl的IL-IRl拮抗剂的组合物。在某些实施方案中，IL-IRl拮抗剂特异性结合和抑制IL-IRl与IL-I α和/或β的结合。在某些实施方案中，使用本文描述的任何测定评估拮抗作用。在另一方面，本公开提供在有此需要的患者中治疗COPD恶化的方法，其中所述患者是由于细菌感染而患有COPD恶化的患者。该方法包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合和抑制IL-IRl的IL-IRl拮抗剂的组合物。在某些实施方案中，IL-IRl拮抗剂特异性结合和抑制IL-IRl与IL-I α和/或β的结合。在某些实施方案中，使用本文描述的任何测定评估拮抗作用。治疗的方法包括施用单次剂量，以及根据治疗时间表施用多于一次剂量。以下列出的各种实施方案适用于本公开的任何前述或下述方面(和实施方案)。在某些实施方案中，拮抗剂特异性结合和抑制人IL-IRl。在某些实施方案中，IL-IRl拮抗剂选自特异性结合IL-IRl和IL-IRa的人抗体。在某些实施方案中，IL-IRl拮抗剂是重组IL-IRa。在某些实施方案中，拮抗剂特异性结合IL-IRl和抑制IL-IRl与IL-I α的结合。在某些实施方案中，治疗COPD恶化包括减轻气道炎症。在某些实施方案中，治疗COPD恶化包括降低嗜中性粒细胞向肺的流入。在某些实施方案中，拮抗剂具有大于或等于约25千道尔顿的分子量。在某些实施方案中，所述方法是用于治疗COPD的治疗方案的一部分。在某些实施方案中，用于治疗COPD的治疗方案包括类固醇的施用。在某些实施方案中，拮抗剂与IL-IRa竞争结合IL-1R1。在某些实施方案中，施用是全身施用。在某些实施方案中，所述方法不包括所述组合物的鼻内施用。在某些实施方案中，所述方法不包括所述组合物的鼻内施用并且不包括所述组合物向肺的其他形式的局部施用。在某些其他实施方案中，拮抗剂经由两种不同的途径施用。此类施用可以是在相同时间或在不同时间。例如，在某些实施方案中，拮抗剂是全身(如静脉内)和鼻内施用。在其他实施方案中，拮抗剂经由全身途径和经由局部递送至肺的途径施用。在某些实施方案中，在COPD恶化之前，所述患者患有分类为GOLD III期或GOLDIV期的coro。本公开涵盖任何前述方面和实施方案的所有组合，以及与详述和实施例中列举的任何实施方案的组合。表格和图的简述图I显示在体外和在体内IL-I β活性受IL-IRl阻断的抑制。图IA显示在体外 抗体6抑制原代人CCffD肺成纤维细胞中IL-I β诱导的IL-6释放。图IB显示阿那白滞素(Anakinra)抑制小鼠肺中IL-I β诱导的嗜中性粒细胞介导的炎症。显示的数据是总嗜中性粒细胞计数，该数据是从用IL-I β +/-抗体治疗气管内攻击后4小时支气管肺泡灌洗液(BAL)定量的。图2是说明吸烟诱导的肺炎模型的图示。图3显示IL-I β阻断抑制吸烟诱导的肺炎。存在四幅图，显示对于研究中的不同组在图示中指示的研究终点从支气管肺泡灌洗液(BAL)定量的总细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，所述不同组即盐水对照组，室内空气或吸烟(CS)攻击；同种型对照组(ΜΑΒ005)，吸烟攻击；IL-IRl抗体(35F5)，吸烟攻击；或阿那白滞素(ALZET渗透泵)，吸烟攻击。图4显示IL-I α和IL_1 β在诱导嗜中性粒细胞炎症应答的香烟暴露模型中表达，该诱导依赖于IL-IRl但独立于半胱天冬酶-I。(A)显示IL-Ia和β在室内空气和吸烟暴露的小鼠中的表达的代表性图像。插图代表来自细胞间隙的巨噬细胞。IL-Ia(B)和β (C)蛋白的总水平通过ELISA从室内空气和吸烟暴露的动物(η=5只小鼠/组)的肺匀浆物测量。野生型和IL-IRl-缺陷(η=5只小鼠/组)(D-F)或半胱天冬酶_1_缺陷(G-I)小鼠(η=3-6只小鼠/组)经受室内空气或吸烟暴露。评估室内空气和吸烟暴露的小鼠的支气管肺泡灌洗液(BAL)中的总细胞(D和G)、单核细胞(Ε和H)和嗜中性粒细胞(F和I)。IL-Ia (J)和β (K)蛋白的总水平通过ELISA从室内空气和吸烟暴露的野生型和半胱天冬酶-I-缺陷小鼠(η=4-6只小鼠/组)的肺匀浆物中测量。图5显示IL-I α但不是IL_1 β的抗体阻断抑制吸烟诱导的炎症。吸烟暴露和室内空气对照小鼠保持未处理(无Rx)，或施用同种型抗体(IgG同种型)，或抗-IL-I α或抗-IL-I β阻断抗体。(A)计数支气管肺泡灌洗液(BAL) (η=4-5只小鼠/组)中的嗜中性粒细胞数。相对于无治疗室内空气对照动物(η=5只小鼠/组)的cxcl-1⑶和il- β (D)或cxcl-2、cxcl-10或cxcl5(F)转录物表达通过富鲁达(f Iuidigm)阵列评估，CXCL-I (C)和IL-I β (E)的总蛋白水平使用Meso Scale Discovery技术(MSD)测量(n=10只小鼠/组)。图6显示为COPD患者的镜像的吸烟暴露的小鼠中IL-IRl的表达模式并且是吸烟诱导的炎症的抗辐射的非造血细胞需要的。(A)来自室内空气和吸烟暴露的小鼠的代表性图像中的IL-IRl表达。(B)显示获自GOLD III COPD患者的肺活检中评估的IL-IRl的表达的代表性图像。(C)产生了各种嵌合小鼠(按骨髓供体基因型进入接受者基因型编码)。(D)计数来自暴露于室内空气或吸烟的骨髓嵌合小鼠(n=5-7只小鼠/组)的支气管肺泡灌洗液(BAL)的嗜中性粒细胞。cxcl-1 (E)、gm-csf (F)和mmp-12(G)的表达通过富鲁达阵列测量(n=6-8只小鼠/组)。图7显示IL-IR拮抗剂抑制急性肺炎的鼠吸入LPS模型中LPS介导的炎性细胞向肺的流入。存在四幅图，显示吸入攻击后48小时的研究终点时从BAL定量的总细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。显示了接受无治疗(幼稚的)、媒介物或阿那白滞素(经由ALZET泵)和盐水或LPS吸入攻击的动物组的数据。图8显示在体外IL-IRl阻断减轻人鼻病毒(HRV)诱导的炎症。图8A显示BEAS_2b/H292(上皮细胞系)细胞的HRV14感染和IL-IRl拮抗剂治疗的研究方案。图8B显示IL-IRl拮抗剂治疗对BEAS-2b/H292细胞的HRV14依赖的IL-8释放的作用。图8C显示BEAS_2b细胞的HRV14感染和IL-IRl拮抗剂治疗的替代研究设计。图8D显示使用该方案降低BEAS-2B 细胞中HRV诱导的IL-8释放的阿那白滞素的剂量范围。图SE显示阿那白滞素和IL-IRl抗体二者对于降低原代正常人支气管上皮(NHBE)细胞中针对HRV14的IL-8应答的效力，相比之下，使用同种型对照抗体未见效应。图9显示IL-IRl抗体减轻急性鼻病毒诱导的肺炎的小鼠模型中病毒诱导的炎症。显示的组用磷酸盐缓冲盐水(PBS)、同种型对照抗体(MAB005)或抗-IL-IRl抗体(35F5)腹膜内或鼻内以所示的剂量处理，和用PBS、HRV-Ib或UV-照射的HRVlb(UV-HRVlb)鼻内处理。测量的细胞是HRV或盐水施用后24hr在研究终点从BAL定量的总细胞。抗体或盐水在HRV之前24小时施用。

图10显示IL-IRl受体阻断或缺陷对吸烟、吸烟+病毒或吸烟和病毒模拟诱导的炎症的影响。图IOA显示BEAS-2B细胞中的吸烟+IL-IRl拮抗剂研究设计。图IOB显示阿那白滞素对吸烟诱导的IL-8释放的剂量依赖效应。图IOC显示BEAS-2B细胞中的吸烟+病毒+IL-IR拮抗剂(阿那白滞素)研究设计。图IOD显示阿那白滞素抑制当使用吸烟和病毒二者作为炎症刺激物时见到的增加的IL-8释放。图IOE显示在吸烟暴露的精密肺切片(precision cut lung slice) (PCLS)中IL-1R1缺陷减弱针对病毒刺激物的肺固有应答。用病毒模拟物聚I :C离体(ex vivo)刺激从室内空气或吸烟暴露的野生型和IL-IRl-缺陷动物产生的PCLS。相对于室内空气对照模拟刺激的PCLS (数据未显示)的cxcl-1 (图IOE中最左侧的图)、cxcl-2(图IOE中居中的图)、和cxcl-5(图IOE中最右侧的图)的表达通过实时定量RT-PCR评估(n=7-14个来自3个独立实验的肺切片)。图11显示IL-IRl缺陷和IL-I α抗体阻断减弱吸烟暴露的小鼠的HlNl流感病毒感染模型中恶化的炎症。(A-C)室内空气或吸烟暴露野生型或IL-IRl-缺陷小鼠用媒介物灌输或用HlNl甲型流感病毒感染。感染后五天，计数来自支气管肺泡灌洗液(BAL)(η=19-20只小鼠/组)的总细胞数(A)、单核细胞⑶和嗜中性粒细胞(C)数。(D-F)用同种型或IL-I α阻断抗体每天处理的室内空气和吸烟暴露野生型小鼠用媒介物灌输或用HlNl甲型流感病毒感染。感染后五天，计数来自BAL(n=4-5只小鼠/组)的总细胞数(D)、单核细胞(E)和嗜中性粒细胞(F)数。图12显示在COPD的恶化期间COPD患者中的IL-1 α和IL-1 β水平。图A显示疾病的稳定或恶化时期过程中通过痰测量的COPD患者中的IL-I α和IL-I β水平。蓝色条-恶化的时期；红色线IL-I α和绿色线IL-I β。图B显示增加的IL-I β水平与COPD肺中的细菌存在相关。图13显示IL-I α和IL_1 β在COPD患者的肺中增加。代表性图像显示在获自GOLD I/II期COPD患者的肺活检中评估的IL-I a (A)和β⑶的表达。(C)计数获自每个患者(η=5，非COPD ;和n=9，COPD GOLD I_II期患者)的两种活检样品的阳性细胞。统计学显著性使用广义线性混合效应模型以负二项分布(调整离差)确定以考虑同一患者的多次取样。箱线图的须代表1-99百分位数。如下对来自同一活检样品的肺切片进行上皮中IL-Ia⑶和β (E)染色的评分0，无染色；1，偶见染色；2，显著的局灶性染色；3，显 著的弥散性染色。使用分层威尔科克森秩和检验(Wilcoxon Ranksum test)比较染色类别(0、1、2和3)的频率，并以图形表示(块的大小与频率成正比)。非CCffD和COPD样品之间的IL-Ia上皮染色无显著差异，但是CCffD对比非COPD样品，IL-I β染色显著不同(p〈0.0001)。IL-Ia和β的水平在获自处于稳定疾病(F)、恶化发作(G)及恶化后7天
(H)和35天(I)的登记患者的痰样品中测量。IL-Ia和β水平在所有就诊中显著相关。表Ia列出了抗体1-3中每一个的CDR的氨基酸序列。表Ia按出现的顺序分别公开了 SEQ ID NO 2-3、11、2-3、12、2-3、13-15、14-15 和 14-18。表Ib列出了抗体4-10中每一个的CDR的氨基酸序列。表Ib按出现的顺序分别公开了 SEQ ID NOS 2-3、19、2-3、20、2-4、2-3、21、2-3、22、2-3、23、2-3、24、6-7、6-7、6-7、6-7、6-7、6-7、6-7、25-26、8 和 27-30。详述⑴引言炎症已被充分确立为COPD的标志，在COPD恶化过程中炎症增加(在恶化时期增加)。然而，驱动这些炎症应答的分子机制了解很少。本文公开了用于减轻气道炎症的方法和治疗COro恶化的方法。具体地，所述方法包括使用结合IL-1R、抑制IL-Id和/或IL-I β的抗体。气道炎症的减轻可通过测量促炎性介导物和副产物的减少(如细胞因子或炎性细胞的流入)在微观水平测量或通过coro严重度的慢性阻塞性肺病全球倡议(GlobalInitiative for Chronic Obstructive Lung Disease) (GOLD)五期分级所分类的增加的肺功能在宏观水平测量。平滑肌的肥大、气道组织的慢性炎症和气道壁所有部分的总体增厚可减小患有coro的患者中的气道直径。气道周围组织的炎症和水肿也可降低气道的直径。气道壁中的组织释放的炎症介导物可用作气道平滑肌收缩的刺激物。减少炎症介导物的产生和释放的疗法可降低平滑肌收缩、气道的炎症和水肿。炎症介导物的实例是细胞因子、趋化因子和组胺。产生和释放炎症介导物的组织包括气道平滑肌、上皮和肥大细胞。用本文公开的组合物和方法进行的治疗可降低气道细胞产生或释放炎症介导物的能力。释放的炎症介导物的减少将减轻慢性炎症以及COPD恶化时期过程中所见的急性炎症，从而增加气道内径，并且还可降低气道平滑肌的高反应性。细胞因子的IL-I家族由i^一种个体成员组成，其中的四种，即IL-I a、IL-I β ,IL-18 & IL-lRa(IL-l受体拮抗剂)，已被更全面地表征并与多种疾病中的病理过程相联系
(I)。IL-I以两种不同的形式存在；IL-Ia和IL_1β，不同基因的产物。这些蛋白在氨基酸水平是相关的，IL-I α和IL-I β共有22%同源性，而IL-I α和IL-IRa共有18%同源性。IL-I β与IL-IRa共有26%同源性。IL-1 α、IL-1 β &IL_lRa的基因位于人染色体2ql4中的相似区域(2，3)。IL-I α和IL-1 β 二者均被合成为31_kDa前体肽，该前体肽被裂解以产生17kDa成熟IL-Ia和IL-I β。IL-I β由包括上皮细胞和巨噬细胞的多种细胞类型产生。其在被半胱氨酸蛋白酶半胱天冬酶-UIL-I β转化酶(ICE) (4))裂解后从细胞释放。IL-Ia被钙蛋白酶(calpain)蛋白酶裂解，并可保留在质膜上，其在质膜上似乎经由直接的细胞与细胞接触激活细胞(5)。前-IL-I α在其氨基末端含有核定位序列，这可导致激活多种细胞途径⑶。IL-IRa是天然存在的IL-I系统抑制剂。其作为衍生自可变mRNA剪接和可变翻译起始的四种不同同工型产生。IL-IRa的17kDa分泌同工型表达为22_25kDa的可变糖基化物类(7，8)，现在称为811^-11^。18kDa胞内同工型称为icIL-lRal(9)。同工型icIL_lRa2 通过从位于icIL-lRal和sIL-IRa第一外显子之间的外显子的可变转录剪接产生(10)。还鉴定了称为icIL-lRa3的第三种16kDa胞内同工型(11)。KiNLRLT'(也称为阿那白滞素)是人白细胞介素-I受体拮抗剂(IL-IRa)的重组、非糖基化形式。KINERET 与天然人IL-IRa的不同之处在于其在氨基末端具有单个甲硫氨酸残基的添加。KlNLRl: !'"由153个氨基酸组成和具有17. 3千道尔顿的分子量。KINERET 被批准用于治疗中度至重度活动性类风湿性关节炎。阿那白滞素(本文称作阿那白滞素和/或KINERET”是拮抗IL-IRl信号转导的IL-IRl拮抗剂的实例。在某些实施方案中，本公开的方法包括施用IL-IRl拮抗剂，如阿那白滞素或IL-IRa的相似形式。IL-I α 和 IL-1 β 通过结合跨膜受体 IL-1R1 (人 IL-1R1 为 RefSeqNM_00877)发挥其生物效应，IL-IRl属于IL-I受体家族。IL-I受体家族有三个成员；IL_1受体
I(IL-1R1 (80kDa)，IL-IRII (68kDa)和 IL-I 受体辅助蛋白(IL-IRacP)。IL-IRl 和 ILlRacP在细胞膜中形成复合物以产生在结合IL-Ia或IL-I β后能够进行信号转导的高亲和力受体。IL-IRa结合IL-IRl但不与IL-IRAcP相互作用。IL-1 α、IL-1 β和IL-IRa还结合IL-RII, IL-RII不具有胞内信号转导结构域。IL-IRl被称为信号转导受体，原因是配体结合和与IL-IRAcP复合后，经由其213个氨基酸残基的胞质尾启动信号转导(12)。目前的文献表明，IL-IRII仅作为‘诱饵受体’在细胞表面或以可溶形式在胞外起作用(13)。调控IL-IRl与IL-I α和/或IL-I β的结合是用于调控IL-I信号转导的方法。IL-I信号转导在许多慢性炎症疾病中具有重要作用。在某些实施方案中，本公开包含通过施用特异性结合IL-IRl和通过至少抑制与至少IL-I α的结合抑制IL-IRl活性的IL-IRl抗体来抑制IL-I信号转导(作为COPD恶化的治疗的一部分)。在某些实施方案中，该抗体还抑制IL-IRl与IL-I β的结合。在某些实施方案中，本公开包含通过施用IL-IRl拮抗剂(IL-1R1的拮抗剂)来抑制IL-I信号转导(作为COPD恶化的治疗的一部分)。前述IL-IRl抗体是IL-IRl的此类拮抗剂的实例。其他实例包括阿那白滞素和IL-IRa的天然存在的形式。在某些实施方案中，本公开包含通过施用特异性结合IL-Ia和抑制IL-I α与IL-IRl结合的IL-I α抗体来抑制IL-I信号转导(作为COPD恶化的治疗的一部分)。
本文描述了这些方法和可以在这些方法中使用的组合物的其他特征。(ii)术语在继续进一步详细地描述本公开之前，应理解本公开不限于特定的组合物或方法步骤，因为这些都可以变化。必须注意，如本说明书和所附的权利要求书中所使用的，除非上下文明确另外指明，否则单数形式“一个/ 一种(a)”、“一个/ 一种(an)”和“该(the)”包括复数指代物。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所涉及的领域的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo, Pei-Show,第 2 版，2002，CRC Press ；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第 3版，1999，Academic PressjPOxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修订版，2000，Oxford University Press，为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的一般词典。氨基酸在本文中可通过它们通常所知的三字母符号或由IUPAC-IUB生化命名委员会建议的单字母符号表示。类似地，核苷酸可通过它们通常所接受的单字母代码表示。除非另外指明，否则抗体的可变结构域、互补决定区(CDR)和构架区(FR)中的氨基酸编号遵循Kabat定义，如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda1MD. (1991)中所列的。使用这一编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有更少或另外的氨基酸，对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或向其中的插入。例如，重链可变结构域可包括H2的残基52之后的单一氨基酸插入(残基52a，根据Kabat)和重链FR残基82之后的插入残基(如残基82a、82b和82c等，根据Kabat)。给定抗体的残基的Kabat编号可通过在同源性区域将抗体的序列与“标准”Kabat编号的序列比对来确定。构架残基的最大比对经常要求在编号系统中插入“间隔”残基，以用于Fv区。此外，由于种间或等位基因趋异，任何给定Kabat位点编号的特定个体残基的身份可在抗体链与抗体链间不同。如本文所用，术语“抗体(antibody) ”和“抗体(antibodies) ”,也称为免疫球蛋白，涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、至少两种不同的表位结合片段形成的多特异性抗体(如，双特异性抗体)、人抗体，人源化抗体、骆骑源化(camelised)抗体、嵌合抗体、单链Fv(ScFv)、Fab片段、F(ab' ) 2片段、展现期望的生物活性的抗体片段(如抗原结合部分)、二硫键连接的Fv (dsFv)、和抗-独特型(抗-Id)抗体(包括,如,针对本公开的抗体的抗-Id抗体)、细胞内抗体、和以上任何一项的表位结合片段。具体地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有至少一个抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何同种型(如，IgG, IgE, IgM, IgD, IgA和IgY)、亚同种型(如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或同种异型(如，Gm,如 Glm(f、z、a 或 x)、G2m(n)、G3m(g、b或c)、Am、Em和Km(l、2或3))。抗体可衍生自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等或其他动物诸如鸟类(如鸡)。在某些实施方案中，抗体可基于其分子量进一步描述。在某些实施方案中，分子量大于或等于25千道尔顿。在某些实施方案中，所述抗体是包含恒定区的全长抗体。如本文所用，术语“拮抗剂”指抑制生物活性的化合物。例如IL-IRl拮抗剂是IL-IRl信号转导的拮抗剂。例如，结合IL-IRl和经由IL-IRl抑制IL-1 α和/或IL-1 β信号转导的化合物是IL-IRl拮抗剂。中和抗体，如特异性结合IL-IRl和抑制IL-IRl与IL-Ia和/或IL-Ιβ的结合的抗体是IL-IRl拮抗剂的实例。IL-IRa化合物，如阿那白滞素，是IL-IRl拮抗剂的另一实例。在某些实施方案中，拮抗剂可以是蛋白。在某些实施方案中，拮抗剂可以是非多肽拮抗剂，如核酸或小分子。当过量的抗体使与受体结合的配体的量减少至少50%、60%或80%，以及更通常地大于约85%(如在体外竞争性结合测定中所测量的)时，抗体抑制配体与受体的结合。如本文所用，术语“气道”意指暴露于空气的受试者的部分或整个呼吸系统。因此“气道”包括上和下气道通路，其包括但不限于气管、支气管、细支气管、末端和呼吸性细支气管、肺泡小管和肺泡囊。气道包括鼻窦、鼻道、鼻粘膜和鼻上皮。气道还包括但不限于喉、喉头、气管支气管树和扁桃体。
如本文所用，术语“IL-1R1”意指白细胞介素I受体I。人IL-IRl的核酸和氨基酸序列是可公开获得的(RefSeq ΝΜ_000877)。在一些实施方案中，IL-IRl可以是人或食蟹猴IL-IRl。如本文其他地方所述的，IL-IRl可以是重组的，和/或可以是糖基化的或未糖基化的。如本文所用，术语“IL-la ”或“IL-Ια (IL-lalpha)”意指白细胞介素Ia。人IL-Ia的核酸和氨基酸序列是可公开获得的(RefSeqNM_000575. 3)。在一些实施方案中，IL-I α可以是人或食蟹猴IL-I α。如本文其他地方所述的，IL-I α可以是重组的，和/或可以是糖基化的或未糖基化的。如本文所用，术语“IL-Ιβ ”或“IL-Ιβ (IL-Ibeta) ”意指白细胞介素1β。人IL-I β的核酸和氨基酸序列是可公开获得的(RefSeq ΝΜ_000576)。在一些实施方案中，IL-I β可以是人或食蟹猴IL-I β。如本文其他地方所述的，IL-I β可以是重组的，和/或可以是糖基化的或未糖基化的。如本文所用，术语“几何平均(Geomean) ”(也称为几何平均(geometric mean)),指数据集的对数值的平均值转换回以10为底的数字。T这要求存在至少两次测量，如至少
2、优选至少5、更优选至少10次重复。本领域技术人员将理解，重复的次数越多，几何平均值越稳健。重复次数的选择可由本领域技术人员判定。如本文所用，术语“单克隆抗体”指特异性结合同一表位的大致均一的抗体群体的抗体。术语“mAb”指单克隆抗体。此处方便地指出，本文所使用的“和/或”应视为具体公开有或无另一组分时两个指定特征或组分中的每一个。例如“A和/或B”应视为具体公开⑴A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个，如同本文单独列出其中的每一个。如本文所用，术语“恶化”指相对于患者的基线状况的COPD症状的加剧。在某些实施方案中，coro恶化可被定义为疾病天然过程中以下特征的事件超出正常的每天变化的患者的基线肺功能、呼吸困难、咳嗽和/或痰的变化，急性发作和可以为患有潜在COPD的患者的药物治疗变化的正当理由。在某些实施方案中，COPD的恶化可以是呼吸短促和/或喘鸣症状的突然增加和/或脓性痰(含有脓汁的痰)产生的增加。(iii)抗体和拮抗剂本公开的治疗COPD恶化的方法包括施用包含结合IL-IRl或IL-Ια的拮抗剂和/或抗体的组合物。在某些实施方案中，拮抗剂可以是结合和抑制靶标，在一些情形中通过其他配体防止结合的蛋白、核酸或小分子。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体是结合和抑制IL-IRl的IL-IRl抗体(美国公布第20040097712号；和US20100221257，各自通过引用并入本文)。在某些实施方案中，所述抗体特异性结合IL-IRl，如人IL-IRl。在某些实施方案中，所述抗体结合IL-IRl和抑制IL-IRl与IL-Ia和/或IL-I β的结合。在某些实施方案中，所述抗体是人抗体。在某些实施方案中，所述抗体与抗体6结合相同的表位或与抗体6竞争结合IL-IRl。在某些实施方案中，所述抗体与IL-IRa竞争结合IL-IRl。在某些实施方案中，本公开的抗体不与IL-IRa竞争结合IL-1R1。举例来说，本文提供了特异性结合IL-IRl的示例性人抗体。这些人抗体的⑶R的氨基酸序列在表Ia和Ib中列出。这些抗体中的一个(抗体6)的VH和VL的氨基酸序列以及其种系化形式在本文提供。特异性结合IL-IRl的示例性啮齿动物抗体是来自BDPharmingen/BD Biosciences 的可商购的 35F5 抗体。·在另一实施方案中，示例性人抗体包括美国公布第20040097712号中公开的那些，包括US 20040097712的图5、6、7、8、9、10和11中公开的26F5、27F2和15C4，这些图通过引用明确并入本文。本文提供了这些抗体的氨基酸序列。特异性结合IL-IRl和抑制与IL-I α和/或IL-I β结合的这些和其他抗体是在本发明的方法中有用的示例性IL-IRl抗体。此类抗体也是IL-IRl拮抗剂的实例。另外的示例性IL-IRl拮抗剂包括阿那白滞素或IL-IRa的其他形式。可适合用于本公开的方法的IL-IRl或IL-Ia的另外的拮抗剂已公开在至少以下国际专利申请中W02004/022718 ；W02005/023872 ；W02007/063311 ；W02007/063308 ；W02005/086695 ;TO1995/014780 和 TO 2006/059108。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的化合物特异性结合IL-I a和抑制IL-I α与IL-IRl的结合。示例性化合物是特异性结合IL_1 α的抗体，如来自R&DSystems (目录号MAB4001)的可商购的抗体ALF161。可描述用于所要求保护的方法的抗体和拮抗剂的示例性特征在下文描述。在另一实施方案中，对于30pM IL-I β存在下抑制IL-Ιβ诱导的人全血中的IL-6产生，用于所要求保护的方法的抗体或拮抗剂具有低于InM的平均IC5(I。在另外的实施方案中，平均IC5tl低于800pM、低于700pM、低于600pM、低于500pM、低于400pM、低于300pM、低于200pM或低于ΙΟΟρΜ。本公开的拮抗剂(抗体或非抗体拮抗剂)结合IL-IRl或IL-I α和以例如高效价中和IL-IRl或IL-I α。中和意指抑制IL-1R1或IL_1 α的生物活性。本公开的拮抗剂可中和IL-IRl的一种或多种生物活性，通常用于所要求保护的方法的拮抗剂抑制ILla和ILl β 结合 IL-IRl0在某些实施方案中，所述抗体或拮抗剂特异性结合和抑制人IL-IRl。在某些实施方案中，所述抗体或拮抗剂特异性结合和抑制人IL-I α。在某些实施方案中，所述抗体或拮抗剂还可结合和中和非人IL-IRl或IL-I α，意即在人以外的物种中天然存在的IL-IRl或IL-I α直系同源物。在某些实施方案中，所述非人物种是一种或多种非人灵长类物种，如食蟹猴。
结合特异性可在例如标准竞争测定中确定或展现。用于测量IL-IRl或IL-I α的中和的合适测定包括，例如，配体受体生化测定和表面等离子体共振(SPR)(如，BIAC0RE )。IL-IRl或IL-Ια抗体和拮抗剂的结合动力学和亲和力(表示为平衡解离常数Kd)可以如使用表面等离子体共振(BIAC0RE )确定。本公开的抗体和拮抗剂一般对IL-IRl或IL-I α，如人IL-IRl或IL-I具有低于约InM的亲和力(Kd)，和在一些实施方案中，具有低于约500pM、400pM、300pM、250pM、200pM、IOOpM的KD，在其他实施方案中具有低于约50pM的KD，在其他实施方案中具有低于约25pM的KD，在其他实施方案中具有低于约IOpM的KD，在其他实施方案中具有低于约IpM的Kd。许多方法可用来测量抗体或拮抗剂对其抗原的结合亲和力，一种此类方法是KinExA。动力学排除测定(Kinetic Exclusion Assay) (KinExA)是能够测量抗原/抗体相 互作用的平衡解离常数以及缔合和解离速率常数的通用免疫测定平台(从根本上说，流量荧光分光光度计)。因为KinExA是在获得平衡后进行的，所以是用于测量高亲和力相互作用的Kd的有利技术，高亲和力相互作用的解离速率可能非常低。KinExA的使用对于其中抗体和抗原的亲和力高于表面等离子体共振分析可以准确预测的亲和力的这一情形是特别适合的。KinExA 方法可如 Drake 等人(2004) Analytical Biochemistry 328,35-43 中的描述进行。在本公开的一个实施方案中，本公开的抗体或拮抗剂以对IL-IRl具有300pM或更低的Kd的特异性，如使用KinExA方法所测量的。可选地，200pM或更低、IOOpM或更低、50pM或更低、20pM或更低的KD，或IOpM或更低或IpM或更低的KD。生物活性的抑制可以是部分的或完全的。拮抗剂可抑制IL-IRl生物活性，如CYNOM-Kl细胞中IL-I β诱导的IL-8释放或HeLa细胞中IL-I α和IL-I β诱导的IL-8释放达100%，或可选地达至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%的不存在拮抗剂下诱导最大可能活性的50%或80%的IL-I α或β浓度的活性。拮抗剂可抑制IL-I α生物活性，如HeLa细胞中IL-I α诱导的IL_8释放达100%，或可选地达至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%的不存在拮抗剂下诱导最大可能活性的50%或80%的IL-I α浓度的活性。拮抗剂的中和效价一般表示为IC5tl值，除非另外指明，否则IC5tl值以ηΜ计。在功能测定中，IC5tl是降低生物应答达其最大值的50%的拮抗剂浓度。在配体结合研究中，IC5tl是降低受体结合达最大特异性结合水平的50%的浓度。IC5tl可通过将％最大生物应答作为拮抗剂浓度的log的函数绘图和使用软件程序如Prism(GraphPad Software Inc. ,La Jolla,CA,USA)以将数据拟合S形函数产生IC5tl值来计算。效价可使用技术人员已知和/或本文所述或引用的一种或多种测定来确定或测量。拮抗剂的中和效价可表示为几何平均值。在某些实施方案中，拮抗剂对IL-IRl或IL-Ια活性的中和使用本文描述的测定或表明拮抗剂结合和中和IL-IRl或IL-I α的任何标准测定来展示。可用于确定拮抗剂与IL-IRl或IL-I α的结合的其他方法包括ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀、亲和层析和生化测定。用于所要求保护的方法的本公开的拮抗剂可对人IL-IRl或IL-I α具有与对其他物种的IL-IRl或IL-I α相似或更强的亲和力。拮抗剂对人IL-IRl或IL_1 α的亲和力可以与对食蟹猴IL-IRl或IL-I α的亲和力相似，或例如在5或10-倍内。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的本公开的拮抗剂包含，包含一个或多个⑶R的IL-IRl结合基序，如构架内的‘CDR集’。⑶R集包含选择以下的一个或多个⑶R HCDRl、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2和LCDR3 (其中H指重链和L指轻链)。在一个实施方案中，⑶R集包含表Ia或Ib中所列的HCDR3，任选地与选自以下的一个或多个⑶R组合HCDRl、HCDR2、IXDRl、IXDR2和IXDR3，如表Ia或Ib中所列的。在另一实施方案中，CDR集包含表Ia或Ib中所列的HCDR3和IXDR3，任选地与选自以下的一个或多个⑶R组合HCDR1、HCDR2、LCDRl 和 LCDR2，例如选自以下的一个或多个 CDR :HCDR1、HCDR2、LCDRl 和 LCDR2，如表Ia或Ib中所列。在另一实施方案中，⑶R集包含表Ia或Ib中所列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体是具有表Ia中所示的CDR的抗体。简要而言，分离具有表Ia中所示的CDR序列集的人亲代抗体分子(参见抗体I)。通过优化过程，产生编号2-3的一组人抗体克隆，具有衍生自亲代⑶R序列的⑶R序列和具有表 Ia中所示位置的修饰。因此，例如，可从表Ia中看到，抗体2具有亲代HCDRl、HCDR2、IXDRl和LCDR2，和具有亲代HCDR3序列，其中=Kabat残基100E被替代为T，Kabat残基100F被替代为V，Kabat残基100G被替代为D，Kabat残基100H被替代为A，Kabat残基1001被替代为A，Kabat残基101被替代为V和Kabat残基102被替代为D。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体是具有表Ib中所示的CDR的抗体。简要而言，分离具有表Ib中所示的CDR序列集的第二亲代人抗体分子(参见抗体4)。通过优化过程，产生编号5-10的一组人抗体克隆，具有衍生自亲代⑶R序列的⑶R序列和具有表Ib中所示位置的修饰。因此，例如，可从表Ib中看到，抗体5具有亲代HCDR1、HCDR2、LCDRl和LCDR2，和具有亲代HCDR3序列，其中Kabat残基100A被替代为A，Kabat残基100B被替代为P，Kabat残基100C被替代为P，Kabat残基100D被替代为P，Kabat残基100E被替代为L，Kabat残基100F被替代为G和Kabat残基1001被替代为G。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体或拮抗剂是具有表Ia或Ib中所列的一个或多个(1、2、3、4、5或6)CDR的人抗体。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体是具有表Ia或Ib中所列的CDR的人抗体，其中所述CDR中的一个或多个具有一个或多个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入。例如，在某些实施方案中，此类抗体相对于抗体I或抗体4的亲代序列具有一至五(1、2、3、4或5)个添加、置换、缺失和/或插入，并保留特异性结合IL-IRl的能力。在某些实施方案中，所述抗体或拮抗剂具有抗体6的CDR。在某些实施方案中，所述抗体是抗体6的种系化形式。在某些实施方案中，所述抗体包含抗体6的VH和/或VL或其种系化形式。本文提供了抗体6的氨基酸序列和抗体6的种系化形式。在某些实施方案中，所述抗体结合与抗体6相同或大致相同的表位。在某些实施方案中，所述抗体与抗体6竞争结合IL-IRl。在某些实施方案中，所述抗体或拮抗剂包含具有以下置换或缺失中的一个或多个的抗体1HCDR3 Kabat 残基 100E 替代为 T ；Kabat残基100F替代为V或L ;
Kabat 残基 100G 替代为 D ；Kabat残基100H替代为A或P ;Kabat残基1001替代为A或P ;Kabat残基101替代为V或G ;Kabat残基102替代为D或V。在某些实施方案中，所述抗体或拮抗剂包含具有以下置换或缺失中的一个或多个的抗体4HCDR3
Kabat残基100A替代为A或E ;Kabat 残基 100B 替代为 P、Q 或 A ;Kabat 残基 100C替代为 P、Y、S 或L;Kabat 残基 100D 替代为 P、G 或 A ;Kabat残基100E替代为L或V ;Kabat 残基 100F 替代为 G、V 或 P ;Kabat 残基 100G 替代为 V ；Kabat 残基 100H 替代为 Y ；Kabat残基1001替代为G或D ;Kabat残基100J替代为A或缺失。Kabat 残基 101 替代为 F ；Kabat 残基 102 替代为 V。在某些实施方案中，所述抗体或拮抗剂包含具有以下置换中的一个或多个的抗体1LCDR3 Kabat残基94替代为H或A ;Kabat残基95替代为A ；Kabat残基95A替代为E或R ;Kabat残基95B替代为Q或V ;Kabat残基97替代为H或L。在一些实施方案中，所述抗体或拮抗剂可包含具有以下置换中的一个或多个的抗体 4LCDR3 Kabat 残基 94 替代为 A、V、D、H、L或 R;Kabat残基95替代为G、R或A ;Kabat 残基 95A 替代为 G、L、A、V 或 D ;Kabat 残基 95B 替代为 H、R、A 或D ;Kabat残基96替代为H、P或A。Kabat残基97替代为H、V或Q。在某些实施方案中，所述抗体或拮抗剂包含具有以下置换或添加中的一个或多个的抗体6HCDR3 Kabat残基100A替代为G或A ;Kabat 残基 100B 替代为 S、P 或 A ;Kabat 残基 100C替代为 D、P、S 或L;
Kabat 残基 100D 替代为 Y、P 或 A ;Kabat残基100E替代为T或L ;Kabat 残基 100F 替代为 T、G 或 P ;Kabat 残基 100G 替代为 V ；Kabat 残基 100H 替代为 Y ；Kabat残基1001替代为G或D ;抗体6中缺失的Kabat残基100J复原为A或F ;
Kabat 残基 101 替代为 D ；Kabat 残基 102 替代为 I。在一些实施方案中，所述抗体或拮抗剂包含具有以下置换中的一个或多个的抗体6LCDR3 Kabat 残基 94 替代为 S、A、D、H、L 或 R ;Kabat残基95替代为L、G或A ;Kabat 残基 95A 替代为 S、G、A、V 或 D ;Kabat 残基 95B 替代为 G、R、A 或D ;Kabat残基96替代为S、P或A。Kabat残基97替代为L、H或Q。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的拮抗剂可以是与IL-IRa和/或与具有表Ia和Ib中所列的CDR的抗体竞争或交叉竞争结合IL-IRl的拮抗剂。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的拮抗剂是与具有表Ia和Ib中所列的CDR的抗体结合相同表位的拮抗剂。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的拮抗剂是与抗体6或包含抗体6的CDR的抗体结合相同表位的拮抗剂。拮抗剂之间的竞争可在体外容易地测定，例如使用ELISA和/或通过标记特定报告分子至一种拮抗剂，其可以在一种或多种其他未标记的拮抗剂存在下被检测，使得能够鉴定结合相同表位或重叠表位的拮抗剂。此类方法是本领域普通技术人员容易获知的，并在本文更详细地描述。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的IL-IRl或IL-Ia抗体是人、嵌合或人源化抗体。抗体可以是单克隆抗体，特别是人、鼠、嵌合或人源化来源的，其可根据本领域技术人员熟知的标准方法获得。在某些实施方案中，所述拮抗剂是非抗体拮抗剂。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的IL-IRl拮抗剂是包含与抗体6的VH结构域具有至少60、70、80、85、90、95、98或99%氨基酸序列同一性的VH结构域，或包含表Ia或Ib中所示的HCDR集(如，HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)的抗体。所述抗体分子可任选地还包含与抗体6的VL结构域具有至少60、70、80、85、90、95、98或99%氨基酸序列同一性的VL结构域，或具有表Ia或Ib中所示的IXDR集(如，IXDR1、IXDR2和/或IXDR3)。可用于计算两个氨基酸序列的％同一性的算法包括，如BLAST[14]、FASTA[15]或Smith-Waterman算法[16]，如采用默认参数。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的IL-IRl拮抗剂是包含人抗体26F5、27F2或15C4的VH结构域和/或人抗体26F5、27F2或15C4的VL结构域的抗体。在某些实施方案中，所述拮抗剂是包含人抗体26F5的VH和VL结构域或人抗体27F2的VH和VL结构域，或人抗体15C4的VH和VL结构域的人抗体。在其他实施方案中，用于所要求保护的方法的IL-IRl拮抗剂是包含1、2、3、4、5或6个人抗体26F5、27F2或15C4的CDR的抗体。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的IL-IRl拮抗剂是包含与人抗体26F5、27F2或15C4的VH结构域具有至少80%、85%、90%、95%、99%或99%同一性的VH结构域和/或与人抗体26F5、27F2或15C4的VL结构域具有至少80%、85%、90%、95%、99%或99%同一性的VL结构域的抗体。用于所要求保护的方法的抗体可还包含抗体恒定区或其部分，如人抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可在其C-末端连接至包括人C或C λ链的抗体轻链恒定结构域。相似地，基于VH结构域的拮抗剂可在其C-末端连接至免疫球蛋白重链的整体或部分(如CHl结构域)，该免疫球蛋白重链衍生自任何抗体同种型，如IgG、IgA、IgE和IgM和任何同种型亚类，特别是IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。IgGl由于其易于制造和稳定性如半衰期所以是有利的。调控拮抗剂功能和/或性质如稳定可变区的任何合成或其他恒定区变体在本公开中可能也是有用的。
此外，可能期望根据本公开修饰本文所述的氨基酸序列，特别是人重链恒定区的序列，以将该序列改编为期望的同种异型，如高加索群体中发现的同种异型。在某些实施方案中，所述抗体可包括人种系基因序列的构架区，或是非种系化的。因此，构架可被种系化，其中构架内的一个或多个残基被改变以匹配最相似的人种系构架中等同位置的残基。因此，用于所要求保护的方法的拮抗剂可以是分离的人抗体分子，其具有包含人种系构架如人种系IgG VH构架中的HCDR集的VH结构域。所述拮抗剂还可具有包含如人种系IgG VL构架中的IXDR集的VL结构域。在某些实施方案中，所述抗体可包含用非天然存在的或非标准氨基酸替代一个或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修改为非天然存在的或非标准形式，或向序列中插入一个或多个非天然存在的或非标准氨基酸。序列中改变的数目和位置的实例在本文其他地方描述。天然存在的氨基酸包括20种“标准” L-氨基酸，通过其标准单字母代码标识为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非标准氨基酸包括可掺入到多肽主链或由对现有氨基酸残基的修饰得到的任何其他残基。非标准氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的。多种天然存在的非标准氨基酸是本领域已知的，如4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙酰基丝氨酸等[17]。在其Ν-α位置衍生的那些氨基酸残基将只能位于氨基酸序列的N-末端。一般而言，氨基酸是L-氨基酸，但其可以是D-氨基酸。因此改变可包含将L-氨基酸修饰或替代为D-氨基酸。氨基酸的甲基化、乙酰基化和/或磷酸化形式也是已知的，且本公开中的氨基酸可进行此类修饰。在某些实施方案中，所要求保护的方法中使用的抗体使用一个或多个选定VH和/或VL基因的随机诱变以产生整个可变结构域内的突变来产生。此类技术由Gram等人[18]描述，其使用易错PCR。在一些实施方案中，在整个可变结构域或CDR集内生成一个或两个氨基酸置换。可使用的另一方法是对VH或VL基因的⑶R区的直接诱变。此类技术由Barbas等人[19]和Schier等人[20]公开。所有上述技术同样是本领域已知的，并且技术人员将能够使用此类技术来使用本领域的常规方法提供本公开的拮抗剂。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体或拮抗剂是抗体片段。片段的实例包括(i)Fab片段，其由VL、VH、恒定轻链结构域(CL)和恒定重链结构域I (CHl)结构域组成；(ii) Fd片段，其由VH和CHl结构域组成；(iii) Fv片段，其由单一抗体的VL和VH结构域组成；(iv)dAb片段[21、22、23]，其由VH或VL结构域组成；(V)分离的CDR区；(vi)Fiah1 ) 2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点的肽接头连接[24、25]；(viii)双特异性单链Fv 二聚体(例如WO 1993/011161中所公开的)和(ix)通过基因融合构建的“双链抗体”、多价或多特异性片段(例如W094/13804和[26]中所公开的)。Fv,scFv或双链抗体分子可通过掺入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定[27]。还可生成包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(Minibodies) [28]。结合片段的其他实例是Fab’，其与Fab片段的不同在于在重链CHl结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，和Fab’-SH，其是其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带自由巯基的Fab’片段。在某些实施方案中，合适的片段可获自本文公开的人或啮齿动物抗体中的任一种。在其他实施方案中，合适的片段获自与本文所述的抗体中的任一种结合相同表位或与任何此类抗体竞争结合抗原的人或啮齿动物抗体。 在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体或拮抗剂被标记、被修饰以增加半衰期和类似性质。例如，在某些实施方案中，所述抗体或拮抗剂是化学修饰的，如通过聚乙二醇化或通过掺入到脂质体中。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的拮抗剂可在非抗体分子内包含抗原结合位点，一般通过非抗体蛋白支架中的一个或多个CDR如CDR集提供，如以下进一步讨论的。抗原结合位点可借助在非抗体蛋白支架，如纤连蛋白或细胞色素B等[29、30、31]上排列CDR而提供，或通过将蛋白支架内的环上的氨基酸残基随机化或突变以赋予对期望靶标的结合特异性而提供。用于在蛋白中工程化新的结合位点的支架已由Nygren等人[31]详述。抗体模拟物的蛋白支架公开于W0200034784，其通过引用整体并入本文，其中发明人描述了包括具有至少一个随机化环的纤连蛋白III型结构域的蛋白(抗体模拟物)。向其中嫁接一个或多个CDR如HCDR集的合适的支架可由免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员提供。支架可以是人或非人蛋白。非抗体蛋白支架的优点是它可在比至少一些抗体分子更小和/或更易于制造的支架分子中提供抗原结合位点。拮抗剂的小尺寸可赋予有用的生理性质，如进入细胞、深入穿透组织或到达在其他结构内的靶标、或结合靶抗原的蛋白腔的能力。非抗体蛋白支架中抗原结合位点的使用综述于WeSS，2004[32]。典型的是具有稳定主链和一个或多个可变环的蛋白，其中一个或多个环的氨基酸序列被特异性或随机地突变以产生结合靶抗原的抗原结合位点。此类蛋白包括金黄色葡萄球菌(S. aureus)的蛋白A的IgG结合结构域、转铁蛋白、四连接素、纤连蛋白(如第10纤连蛋白III型结构域)、脂笼蛋白以及Y晶体(gamma-crystalline)和其他Aff ilin 支架(Scil蛋白)。其他方法的实例包括合成的基于环蛋白(cyclotide)-具有分子内二硫键的小蛋白的“微体(Microbodies) ”、微生物蛋白(Microproteins) (Versabodies , Amunix Inc,Mountain View, California, USA)和锚蛋白重复蛋白(DARPins, Molecular Partners AG,Ziirich-Schlieren, Switzerland)。此类蛋白还包括小的、工程化的蛋白结构域,如,例如免疫结构域(参见例如，美国专利公布第2003/082630和2003/157561号)。免疫结构域含有抗体的至少一个互补决定区(CTR)。在某些实施方案中，拮抗剂可包含其他氨基酸，如形成肽或多肽，如折叠的结构域，或赋予分子除了结合抗原的能力之外的另一功能特征。拮抗剂可携带可检测的标记，或可缀合至毒素或靶向部分或酶(如经由肽键或接头)。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的拮抗剂或抗体的半衰期是至少约4至7天。在某些实施方案中，平均半衰期是至少约2至5天、3至6天、4至7天、5至8天、6至9天、7至10天、8至11天、8至12天、9至13天、10至14天、11至15天、12至16天、13至17天、14至18天、15至19天或16至20天。在另一实施方案中，本公开提供包容器的制品。容器包括含有本文公开的拮抗剂或抗体的组合物，和说明组合物可用于治疗COPD恶化和/或COPD恶化的症状的包装说明书或标签。·在其他实施方案中，本公开提供试剂盒，试剂盒包含含有本文公开的拮抗剂或抗体的组合物，和将组合物施用于需要治疗的受试者的说明。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体或拮抗剂包含变体Fe区。SP，非天然存在的Fe区，例如包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基的Fe区。本公开的变体Fe区还涵盖包含氨基酸缺失、添加和/或修饰的Fe区。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体或拮抗剂具有大于或等于约25千道尔顿的分子量。在其他实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体或拮抗剂具有大于或等于约50、约75、约90、约100、约110或约125千道尔顿的分子量。在其他实施方案中，抗体或拮抗剂具有大于或等于约150千道尔顿的分子量。本公开涵盖了具有前述特征的一个或多个的任何组合的抗体和拮抗剂的使用。例如，特异性结合IL-IRl和抑制IL-Ia和/或IL-I β的结合以及可具有前述特征的任何一个或多个的抗体或拮抗剂可用于本文所述的方法。相似地，特异性结合IL-I α和抑制IL-Ia与IL-IRl的结合以及可具有前述特征的任何一个或多个的抗体或拮抗剂可用于本文所述的方法。(iV)使用方法在某些实施方案中，所要求保护的方法中使用的抗体和拮抗剂可用于治疗和/或预防COPD的恶化。在某些实施方案中，所要求保护的方法中使用的抗体和拮抗剂可用于在COPD的恶化期间增加肺功能。在某些实施方案中，所要求保护的方法中使用的抗体和拮抗剂可用于降低恶化的持续时间。在某些实施方案中，所要求保护的方法中使用的抗体和拮抗剂可用于降低恶化的频率。在某些实施方案中，所要求保护的方法中使用的抗体和拮抗剂可用于在恶化期间减轻气道炎症。在某些实施方案中，所要求保护的方法中使用的抗体和拮抗剂可用于在恶化期间降低IL-I信号转导。在某些实施方案中，所要求保护的方法中使用的抗体和拮抗剂可用于在恶化期间减轻IL-I a和IL-I β信号转导。在某些实施方案中，COPD的恶化是由于肺的感染(如，病毒感染、人鼻病毒诱导的气道炎症、细菌感染)或空气污染(如，吸烟)。在某些实施方案中，减轻气道炎症是治疗COPD恶化的方法的一部分。在某些实施方案中，减轻气道炎症包括降低炎性细胞向肺的流入。在某些实施方案中，治疗COPD恶化包括减轻炎性细胞向肺的流入。在某些实施方案中，炎性细胞是嗜中性粒细胞。在某些实施方案中，炎性细胞是巨噬细胞。在某些实施方案中，炎性细胞是淋巴细胞。在某些实施方案中，炎性细胞是单核细胞。在某些实施方案中，治疗COPD恶化包括减轻气道炎症。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体具有大于或等于约25千道尔顿的分子量。在某些其他实施方案中，所用的抗体具有大于或等于约50、60、75、100、110、125或150千道尔顿的分子量。在某些实施方案中，所用的抗体具有约150千道尔顿的分子量。相似地，在某些实施方案中，使用具有任何前述范围的分子量的非抗体拮抗剂。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体可用于治疗和/或预防COPD的症状的恶化。在某些实施方案中，COPD的恶化的症状包含以下的一个或多个增加的气喘、增加的咳嗽和痰产生、痰的颜色和/或稠度的变化、喘鸣、胸闷、发烧。COPD的恶化代表患者的基线、平均COPD状况的变化，其可通过例如评估肺功能来评估。慢性阻塞性肺病的全球倡议(GOLD)制定了 COPD严重度的五期分级来指导治疗方法(Executive Summary:Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of COPD (2009年更新))。在这些患者中，0期定义特征为咳嗽、痰和气喘而无气流阻塞的经典临床症状(如，正常的呼吸量测定)的状况。I期定义以下患者具有〈70%的一秒用力呼气量(FEVl)/用力肺活量(FVC)，和预测>80%的FEVl，有或无可能意识到或意识不到的疾病状态的慢性症状。II期(FEV1/FVC〈70%、FEV130 - 79%)根据患者在亚阶段IIb经历更大的恶化速率而分成亚阶段IIa(FEV150 - 79%)和IIb (FEV130 - 49%)，恶化速率继而与健康状态不利地相关。然而，亚阶段IIb在本领域和本文中经常被称为III期。最后，IV期(FEV1/FVC〈70%和FEV1〈30%预测、低氧血症、或右心衰竭的临床迹象)预期与最差的健康状态相关。因此，在某些实施方案中，本公开的方法可用于治疗患有I期或更高GOLD评分COPD的患者，如恶化之前所测量的。在某些实施方案中，本公开的方法可用于治疗患有II期或更高GOLD评分COPD的患者。在某些实施方案中，本公开的方法可用于治疗患有III期或更高GOLD评分COPD的患者，如恶化之前所评估的。在某些实施方案中，本公开的方法可用于治疗患有IV期GOLD评分COPD的患者，如恶化之前所评估的。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体可用于预防或减轻由病毒感染、细菌感染和/或环境因素引起的COPD的症状的恶化。在某些实施方案中，环境因素是吸烟。在某些实施方案中，细菌感染与LPS有关。在某些实施方案中，病毒感染是人鼻病毒(HRV)感染。在某些实施方案中，提供了在有此需要的患者中治疗COPD恶化的方法，其中所述患者是由于人鼻病毒诱导的气道炎症而患有COPD恶化的患者,该方法包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-IRl和抑制IL-IRl与IL-I α结合的抗体的组合物。HRV感染导致具有增加的炎性细胞因子的嗜中性粒细胞流入。宿主炎症应答，特别是IL-8，在普通感冒症状的病理发生中起关键作用。在患有慢性肺病的患者中，这可导致潜在呼吸状况的症状的恶化。三分之二的COPD恶化之前有病毒感染症状。40%的住院的急性恶化患者的鼻和/或痰样品中有HRV存在。因此，治疗患有由于人鼻病毒诱导的气道炎症导致的coro恶化的患者代表可显著降低coro恶化风险和显著改善患有coro的患者的健康的重要干预。因此，本发明组合物和方法可用于治疗、减轻和预防由HRV或其他气道病毒感染诱导的COPD恶化。
在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体是人、嵌合或人源化抗体。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体是抗体片段，如具有大于或等于25千道尔顿的分子量的片段。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体或拮抗剂可特异性结合人IL-IRl或IL-I α。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体或拮抗剂可特异性结合来自人和/或来自一个或多个非人灵长类物种的IL-IRl或IL-I α。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体不特异性结合鼠IL-IRl或IL-I α。在某些实施方案中，所述方法是通过管理COPD恶化治疗COPD的治疗方案的一部分。在某些实施方案中，用于治疗COPD的治疗方案包括类固醇的施用。在某些实施方案中，当通过Biacore 测量时，抗体或拮抗剂以50pM或更低的Kd特异性结合人IL-IRl或IL-Ια。在某些实施方案中，用于所要求保护的方法的抗体是抗体6或6gl (种系化的)。在某些实施方案中，抗体或拮抗剂与IL-IRa竞争结合IL-IRl。在某些实施方案中，施用是全身施用。在某些实施方案中，所述方法不包括所述组合物的鼻内施用。在某些实施方案中，所述方法包括经由两种施用途径施用拮抗剂全身的和局部的。例如，拮抗剂全身施用，如静脉内和鼻内或经由至肺的局部施用的其他形式施用。在某些实施方案中，所述方法包 括以低于或等于一天一次的给药方案施用所述组合物。在某些实施方案中，在治疗之前、治疗期间或治疗之后监测COPD症状。在某些实施方案中，监测是连续的。在某些实施方案中，监测以固定的间隔在治疗过程中发生，如每小时、每天或每周。在某些实施方案中，监测以固定的间隔在治疗后发生，如每天、每周或每月。监测的间隔可由本领域技术人员基于状况的严重度容易地确定。在某些实施方案中，COPD症状通过肺功能测试如呼吸量测定法监测。在某些实施方案中，COPD症状通过胸部X-线和/或计算机断层(CT)扫描监测。胸部X-线或CT扫描可显示肺气肿，其是COPD的主要原因之一。在某些实施方案中，COPD症状通过动脉血气分析监测。在某些实施方案中，COPD症状通过痰检查监测。在某些实施方案中，使用前述测试中的任何一个或多个评价治疗效力。在某些实施方案中，治疗降低恶化的严重度、持续时间或频率。在某些实施方案中，患者的状况(如，基线肺功能等)在治疗后回到恶化前基线水平。在某些实施方案中，在本领域普通技术人员已知的吸烟暴露的动物模型、动物鼻病毒模型或慢性肺病模型中分析本公开的组合物或方法。(如，Contoli等人，ContribMicrobiol. 2007; 14:101-12) ο在某些实施方案中，动物模型是小鼠模型(如，Bartlett等人，Nat Med. 2008Feb; 14(2): 199-204)。在某些实施方案中，小鼠模型选自弹性蛋白酶和 LPS 暴露的小鼠模型(参见，Sajjan 等人，Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol. 2009Nov;297(5) :L931-44)。在某些实施方案中，可使用实施例中所列的任何细胞或动物模型。在某些实施方案中，如果症状严重，可能要求住院。在某些实施方案中，如果症状较轻，患者可作为门诊患者进行治疗。在某些实施方案中，吸烟、住院、缺乏肺康复计划、吸入器使用不当和药物治疗计划遵从性差都与COPD恶化发作的更频繁和/或更长的持续时间相关。在某些实施方案中，本公开的方法可用于治疗展现以下的一个或多个的患者吸烟、住院、缺乏肺康复计划、吸入器使用不当和药物治疗计划遵从性差。在某些实施方案中，本公开的方法可用于治疗具有COPD恶化发作的更频繁和/或更长的持续时间的患者。在某些实施方案中，本公开的方法可用于治疗处于COPD恶化的特定风险的患者。
本公开还提供拮抗IL-IRl或IL-I α的至少一种作用的方法，该方法包括接触或施用有效量的一种或多种本公开的拮抗剂，使得IL-IRl或IL-I α的所述至少一种作用被拮抗。可被本公开的方法拮抗的IL-IRl的作用包括IL-I α和/或IL-I β介导的生物应答，和作为这些结合反应的后果产生的任何下游作用。当使用多种本公开的拮抗剂时，它们可在相同时间或不同时间施用。在某些实施方案中，使用多种本公开的拮抗剂，且所述方法包括施用IL-IRl拮抗剂，如抗体，和IL-I α拮抗剂，如抗体。多种拮抗剂可经由相同的施用途径或经由不同的施用途径施用。对于前述的任一种，所述方法一般包括施用包适当剂量的抗-IL-IRl或IL-I α试剂的组合物。术语“治疗(treatment) ”、“治疗(treating) ”和类似术语在本文一般用于指通过向有此需要的受试者提供药物以改善受试者的状况来获得期望的药理和/或生理作用。在某些实施方案中，治疗可包括降低恶化的频率和/或严重度。在某些实施方案中，治疗可包 括治疗气道炎症。在某些实施方案中，治疗可包括阻止或减少炎性细胞如嗜中性粒细胞向肺的流入。如本文所用的“治疗”包括(a)抑制恶化(如，阻止其发展以使得症状不恶化)；或(b)缓解疾病或状况(如，如引起疾病或状况的消退、提供一个或多个症状的改善、减少恶化的持续时间、降低恶化的频率)。任何状况的改善可根据本领域已知的标准方法和技术容易地评估。在某些实施方案中，在有效治疗后，患者的状况回到恶化前的基线状况。在某些实施方案中，在恶化之前，患者具有中度或重度COPD (如，分类为GOLD III期或GOLD IV期的coro)。术语“治疗有效剂量”或“有效量”意指产生其施用的期望效应的剂量。精确的剂量将依赖于治疗目的，并且将是本领域技术人员使用已知的技术可确定的(参见，如，Lloyd (1999)The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。本公开涵盖其中组合本公开的前述或以下的方面和/或实施方案中的任何一个或多个的方法。例如，任何抗体或拮抗剂(拮抗IL-IRl或IL-Ia的任何组合物)可用于本文描述的任何方法。而且，本文描述的任何抗体或拮抗剂可单独或组合使用，如与本公开的另一抗体或拮抗剂组合使用。(V)药物组合物因此，本公开的进一步方面提供了抗体或拮抗剂治疗COPD恶化的用途，如本文所述。抗体和拮抗剂可作为组合物，例如包含抗体或拮抗剂的药物组合物施用。在某些实施方案中，所述抗体或拮抗剂是重组产生的，如通过在宿主细胞中表达编码抗体或拮抗剂的核酸。组合物可配制在药学上可接受的赋形剂中。在某些实施方案中，组合物是无热原的或大致无热原的。药学上可接受的赋形剂可以是进入药物组合物的以下化合物或化合物的组合不引起次级反应并且允许，例如，促进活性化合物的施用，其在体内的寿命和/或效力的增力口，在溶液中的溶解度的增加或其保存的改善。这些药学上可接受的赋形剂是众所周知的，且将由本领域技术人员根据所选的活性化合物的性质和施用方式的影响而修改。本公开的抗体和拮抗剂将通常以药物组合物的形式施用，其可包含除了拮抗剂之外的至少一种组分。因此，根据本公开和根据本公开使用的药物组合物可包含除了活性成分之外的药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应该是非毒性的，并且不应干扰活性成分的效力。载体或其他材料的精确性质将取决于施用的途径。在某些实施方案中，组合物是全身施用，如通过静脉内、腹膜内、肌肉内或皮下注射。在某些实施方案中，组合物是口服施用。在某些实施方案中，所述方法明确不包括所述组合物直接向肺的施用，例如通过吸入、肺灌洗或鼻内递送。在其他实施方案中，相同或不同的抗体/拮抗剂经由相同或不同的施用途径施用。例如，抗体可全身施用，而相同或不同的拮抗剂可全身或局部施用。液体药物组合物一般包含液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇类，如可使用或包括乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。对于静脉内注射，活性成分将为胃肠外可接受水溶液的形式，该水溶液是无热原的且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员能够容易地制备合适的溶液，使用例如，等渗的媒介物，如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸格氏注射液。防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂可根据需要使用，包括缓冲液，如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基 苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3’ -戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA ;糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的反荷离子，如钠；金属复合物(如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN 、PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。本公开的拮抗剂和抗体可根据分子的物理化学性质和递送途径而配制成液体、半固体或固体形式。制剂可包括赋形剂或赋形剂的组合，例如糖类、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可包括广泛范围的抗体浓度和pH。固体制剂可通过例如冻干、喷雾干燥或通过超临界流体技术干燥来产生。在某些实施方案中，本公开的组合物，包括药物组合物，是非热原性的。换言之，在某些实施方案中，所述组合物是大致无热原的。在一个实施方案中，所述制剂是大致不含内毒素和/或相关的热原性物质的无热原制剂。内毒素包括限制在微生物体内并在微生物降解或死亡时释放的毒素。热原性物质也包括来自细菌和其他微生物的外膜的引起发热的、热稳定的物质(糖蛋白)。如果施用于人，这两种物质均可引起发热、低血压和休克。由于潜在的有害效应，即使少量的内毒素也必须从静脉内施用的药物溶液中除去。食品和药品管理局(The Food & Drug Administration) (“FDA”)设定对于静脉内药物施用，一个小时时段中每千克体重每剂量5个内毒素单位(EU)的上限(The United States PharmacopeialConvention, Pharmacopeial Forum 26 (I) : 223 (2000))。当治疗用蛋白以每千克体重数百或数千毫克的量施用时，如对于抗体可能的情形，即使是痕量的有害和危险的内毒素也必须除去。在某些特定的实施方案中，组合物中的内毒素和热原水平低于10EU/mg、或低于5EU/mg、或低于 lEU/mg、或低于 O. lEU/mg、或低于 O. 01EU/mg、或低于 O. 001EU/mg。在某些实施方案中，组合物通过静脉内输注施用。在某些实施方案中，输注是在至少10、至少15、至少20或至少30分钟的时段。在其他实施方案中，输注是在至少60、90或120分钟的时段。无论输注时段如何，本公开预期每种输注是根据固定的时间表(如，每天、每周、每月一次等)施用抗体或拮抗剂的整体治疗计划的一部分。相似地，无论施用途径如何，本公开预期每个剂量是根据固定的时间表(如，每天、每周、每月一次等)施用抗体或拮抗剂的整体治疗计划的一部分。在某些实施方案中，本公开的组合物(如，抗-IL-IRl抗体、抗_IL_la抗体、抗-IL-IRl拮抗剂)可用作治疗COPD恶化的组合治疗或治疗方案的一部分。组合治疗可用于提供加成性的或协同性的效应，特别是抗-IL-IRl或IL-Ia拮抗剂与一种或多种其他药物的组合。当治疗方案涉及施用多种化合物(如，药物、生物试剂)时，此类化合物可例如同时施用或顺序施用或作为组合制品施用。在某些实施方案中，治疗方案包括类固醇治疗。在某些实施方案中，本公开的组合物可用作具有一种或多种可用的COPD治疗的治疗方案的一部分。 根据本公开的组合物可作为单独治疗提供，或与一种或多种其他的本公开的试剂和/或与一种或多种以下的试剂组合提供或另外提供-糖皮质激素，如氟尼缩松、曲安奈德、二丙酸倍氯米松、布地奈德、丙酸氟替卡松、环索奈德和/或糠酸莫米松；-抗细菌剂，如青霉素衍生物、四环素、大环内酯、内酰胺、氟喹诺酮、甲硝唑和/或吸入型氣基匍糖昔；和/或抗病毒剂，如阿昔洛维、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、西多福韦；金刚烷胺、金刚乙胺；利巴韦林；扎那米韦和/或奥司他韦；蛋白酶抑制剂，如茚地那韦、那非那韦、利托那韦和/或沙奎那韦；核苷逆转录酶抑制剂，如去羟肌苷、拉米夫定、司他夫定、扎西他滨、齐多夫定；非核苷逆转录酶抑制剂，如奈韦拉平、依法韦仑。组合治疗可包括抗生素。大约50%的急性恶化主要是由于细菌肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(引起肺炎)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(弓丨起流感)、和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)(引起肺炎)引起。许多抗生素可有效治疗这些感染。组合治疗可包括呼吸刺激剂。皮质类固醇在COPD的急性恶化中可能是有益的。类固醇可静脉内给予。在急性恶化期间可增加支气管扩张药剂量以减轻急性支气管痉挛。在COPD的急性恶化期间可使用茶碱。在某些实施方案中，氧气需求可能增加，可提供补充供氧。患有COPD的急性恶化的患者可处于发展呼吸衰竭的风险。当呼吸需求超出呼吸系统应答的能力时，发生呼吸衰竭。在某些实施方案中，组合可包括机械通气。机械通气是通过呼吸机将空气推入患者的肺中来代替患者使用其呼吸肌吸入空气的手段。因此，机械通气减轻或消除了患者的呼吸工作，患者继续接受空气到其肺中，并被动呼气而无需任何努力。COPD中有两种常用的机械通气方法无创的和有创的。在有创通气过程中，将气管内导管，一种小直径塑料管，置于气管中，然后连接到呼吸机，呼吸机推动空气进入肺中。有创通气可施用于无意识的或重度镇静的患者，其比无创通气更加有效。无创通气可用于有意识的、合作的患者。在这一方法中，氧气通过在鼻或口和鼻周围形成密封的面罩递送。
在某些实施方案中，组合治疗可包括肺炎和/或季节流感疫苗。根据本公开，提供的组合物可施用于哺乳动物，如人患者。施用通常是以“有效量”，这足以对患者显示益处。此类益处可以是至少一种症状的至少缓解。示例性症状包括气道炎症、嗜中性粒细胞向肺的流入、降低的肺容量。施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于所治疗的疾病的性质和严重度、治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、疾患的原因、组合物的递送位点、拮抗剂的类型、施用的方法、施用的时间安排和医学执业者已知的其他因素。治疗处方，如剂量的确定等，由普通执业者和其他医生负责，并可取决于症状的严重度和/或所治疗的疾病的进展。抗体的适当剂量是本领域熟知的[33、34]。可使用在本文或Physician' s DeskReference (2003)中指出的对于所施用的药物的类型适当的具体剂量。治疗有效量或合适的剂量可通过比较其体外活性和在动物模型中的体内活性来确定。从小鼠和其他试验动物的有效剂量外推人的有效剂量的方法是已知的。精确剂量将取决于抗体的精确性质(如完整抗体、片段或双链抗体)、患者状况、给药方案。典型的抗体剂量对于全身应用将在 IOOyg至Ig范围内。在某些实施方案中，可施用初始的较高加载剂量，然后施用一个或多个更低剂量。典型的，抗体将是完整抗体，如IgGl同种型、IgG2同种型、IgG3同种型或IgG4同种型。这是成年患者一次治疗的剂量，可将该剂量按比例调整用于儿童和婴儿，和根据分子量成比例地调整用于其他抗体形式。治疗可根据医师的判断以每天、每两周、每周或每月的间隔重复。在某些实施方案中，治疗可以是对皮下施用每两周至四周和对于静脉内施用每四周至八周。在某些实施方案中，本公开的组合物需要在受试者以后的生命中定期给药。在某些实施方案中，本公开的组合物是全身施用。在某些实施方案中，本公开的组合物通过静脉内施用。在某些实施方案中，本公开的组合物不能通过吸入有效递送。在某些实施方案中，本公开的组合物不能通过非全身递送有效递送。在某些实施方案中，本公开的组合物需要连续给药。在某些实施方案中，本公开的组合物要求在1、2、3、4、5、6或7天时段的连续给药。在某些实施方案中，本公开的组合物要求持续1、2、3、4、5或6周时段的连续给药。在某些实施方案中，本公开的组合物要求持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月时段的连续给药。在某些实施方案中，本公开的组合物要求在受试者以后的生命中连续给药。(vi)抗体和拮抗剂的制备在某些方面，本公开提供其中有效试剂是特异性结合IL-IRl的抗体的方法。在某些方面，本公开提供其中有效试剂是特异性结合IL-Ια的抗体的方法。示例性抗体包括鼠、嵌合、人源化和人抗体，以及抗原结合片段。合适的抗体可使用本领域熟知的方法制备。例如，抗体可重组产生、使用噬菌体展示制备、使用杂交瘤技术产生等。技术的非限制性实例在下面简述。—般而言，对于单克隆抗体或其功能片段的制备，特别是鼠来源的单克隆抗体或其功能片段的制备，可以参考手册“AntibodieS”[35]中具体描述的技术或参考Kdhler和Milstein[36]描述的从杂交瘤制备的技术。单克隆抗体可以获自例如从针对IL-IRl或IL-I α、或含有所述单克隆抗体识别的表位的其片段之一免疫的动物获得的细胞。包含它们的合适的片段和肽或多肽可用于免疫动物以产生针对IL-IRl或IL-I α的抗体。所述IL-1R1或IL-I α、或其片段之一可根据通常的工作方法产生，从编码IL-IRl或IL-I α或其片段的cDNA序列中含有的核酸序列开始通过基因重组产生，从IL-IRl或IL-I α和/或其片段的肽序列中包含的氨基酸序列开始通过肽合成产生。
单克隆抗体可以例如在亲和柱上纯化，该亲和柱上已预先固定了 IL-IRl或IL-Ia或含有所述单克隆抗体识别的表位的其片段之一。更具体地，单克隆抗体可通过以下纯化在蛋白A和/或G层析，然后进行或不进行旨在消除残留蛋白污染物以及DNA和脂多糖(LPS)的离子交换层析，本身然后进行或不进行在Sepharose 凝胶上的排阻层析以消除由于二聚体或其他多聚体的存在导致的可能聚集物。在一个实施方案中，所有这些技术可以同时或相继使用。可以采用单克隆和其他抗体并使用重组DNA方法的技术产生结合靶抗原的其他抗体或嵌合分子。此类技术可涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入到不同的免疫球蛋白的恒定区、或恒定区加构架区。参见，例如EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400和大量随后的文献。杂交瘤或产生抗体的其他细胞可经受基因突变或其他变化，这可改变或不可改变产生的抗体的结合特异性。抗体工程领域可用的另外技术使得能够分离人和人源化抗体。例如，可根据Kontermann & Dubel [37]的描述制备人杂交瘤。卩遼菌体展示，用于产生拮抗剂的另一公认技术，已详细描述于许多出版物中，如Kontermann & Dubel [37]和W092/01047 (下文进一步讨论)，及美国专利 US 5，969，108、US, 5，565，332、US 5，733，743、US 5，858，657、US5，871，907、US 5，872，215、US 5，885，793、US 5，962，255、US6, 140，471、US 6,172，197、US6，225，447、US 6，291，650、US 6，492，160 和 US6, 521，404。可以使用其中小鼠抗体基因已被灭活且被人抗体基因功能性取代同时保留小鼠免疫系统的其他组分完整性的转基因小鼠来分离人抗体[38]。人源化抗体可使用本领域已知的技术产生，如使用例如 W091/09967、US 5，585，089、EP592106、US 5，565，332 和W093/17105中公开的技术。此外，W02004/006955描述了用于人源化抗体的方法，该方法基于从人抗体基因选择可变区构架序列，通过比较非人抗体可变区的CDR序列的标准CDR结构类型和人抗体序列如种系抗体基因区段文库的相应CDR的标准CDR结构类型。具有与非人CDR相似的标准CDR结构类型的人抗体可变区形成从中选择人构架序列的成员人抗体序列子集。子集成员可根据人和非人CDR序列之间的氨基酸相似性进一步排序。在W02004/006955的方法中，选择排序最靠前的人序列来提供用于构建人CDR序列被使用选择的子集成员人构架的非人CDR对应物功能性替代的嵌合抗体的构架序列，从而提供高亲和力和低免疫原性的人源化抗体而无需比较非人和人抗体之间的构架序列。还公开了根据所述方法制备的嵌合抗体。合成抗体分子可提供从借助合成的寡核苷酸产生的基因表达并在合适的表达载体中组装而产生，例如如Knappik等人[39]或Krebs等人[40]所述。注意，无论目标抗体初始是如何鉴定或制备的，任何此类抗体均可使用重组技术相继产生。例如，可在宿主细胞中表达编码抗体的核酸序列。此类方法包括从单独的载体表达编码重链和轻链的核酸序列，以及从同一载体表达所述核酸序列。使用多种细胞类型的这些和其他技术是本领域熟知的。可在一种或多种测定中测试合适的抗体。例如，可在实施例中提供的任何测定中测试抗体以证实它们与这些代表性抗体拥有相似的功能性质。另外或可选地，可测试抗体以评估它们是否与任何所述抗体结合相同或大致相同的表位。还可进行证实抗体特异性结合来自一个或多个期望物种的靶抗原的结合测定。此外，可测试中和能力(如，抗-IL-IRl抗体阻止IL-IRl与IL-I α和/或β结合的能力。在非抗体拮抗剂的情形中，此类拮抗剂可使用本领域中已知的方法制备。例如，蛋白拮抗剂可使用重组技术或合成地制备。示例性蛋白拮抗剂是KINERET，一种IL-IRa的可商购形式。示例现在总体描述了本公开，其通过参考以下实施例将更容易理解，包括所述实施例仅是为了说明本公开的某些方面和实施方案，并非旨在限制本公开。例如，本文公开的具体构建体和实验设计代表用于验证正确功能的示例性工具和方法。实施例1-IL-1R1阻断在体外和在体内抑制IL-Ιβ的效应。·本实施例和另外的实施例中使用的一些工具是抗体6 (特异性结合IL-IRl的人抗体；本文提供了序列)和阿那白滞素(也称为KINERET)。抗体6完全抑制原代人COPD成纤维细胞中IL-I β诱导的IL-6(图1A)，当气管内灌输到小鼠中时，阿那白滞素抑制IL-I β增加4小时后BAL中回收的嗜中性粒细胞的能力达71%(图IB)。这与关于阿那白滞素和其他抗-IL-IRl抗体如抗小鼠IL-IRl抗体35F5的文献一致，已显示它们抑制IL-I β介导的对IL-IRl的效应。如实施例中进一步详述的，本公开揭示了对IL-Ια介导的活性的另外的且令人吃惊的效应，因此首次暗示IL-I α参与C0PD。为了检查COPD组织中IL-IRl对IL-1 β的效应，检查了用IL-1R1拮抗剂处理的原代COPD肺成纤维细胞中的IL-6水平。IL-IRl拮抗性抗体6 (特异性结合人IL-IRl的人抗体；本实验中使用种系化形式)抑制COPD肺成纤维细胞中IL-I β诱导的IL-6释放(图1Α)。IL-I β 处理浓度为 O. 5ng/ml (大约 EC80)。如上所述，还检查了 IL-IRl拮抗剂处理对小鼠肺中IL-I β诱导的嗜中性粒细胞介导的炎症的效应(图IB)。5ng/50 μ I的IL-I β处理前一小时，皮下给药阿那白滞素(KINERET )。一小时后，通过BAL获得细胞计数。与对照IL-I处理的动物相比，阿那白滞素减少细胞计数达71%。体外方法COPD成纤维细胞作为从接受肺移植的严重CCffD患者的CCffD肺组织产生内皮细胞的副产物产生。在摘除组织时，患者的疾病是稳定的且没有恶化。组织培养瓶用无菌过滤后的明胶(O. 2%，于蒸馏水中)包被，并在使用前用细胞培
养基漂洗。从胸膜解剖组织，并使用美扎鲁那刀(mezzaluna)在RPMI+ (RPMI+为RPMI培养基+10%FCS、1%青霉素/链霉素/两性霉素B溶液)培养基中剁碎。将剁碎的组织(当足够细能够被标准巴斯德吸管容易地吸取时)在40微米过滤器上洗涤以除去残屑和红细胞。使用无菌仪器将细胞从过滤器上取下，并在RPMI、0. P/oBSA和O. 2%II型胶原酶中悬浮以进行消化。将组织在滚筒上在室温下孵育2小时。不时温和摇动试管以防止组织凝块和沉降。2小时后，温和搅拌悬浮液，然后经由大筛目粗滤器过滤，然后通过100微米过滤器。然后将滤液在1200rpm在室温下离心5分钟。然后在RPMI+中洗涤细胞沉淀并重复离心和洗涤。然后将细胞重悬在内皮培养基(EGM-2-MVBulletKit，CLonetics #CC3202)和涂布到明胶包被的烧瓶中。细胞以约2e7细胞/T225烧瓶涂布。第二天，用培养基冲洗细胞，当细胞达到汇合时，使用细胞解离液传代细胞。此时，使用CD31Dynabeads富集内皮细胞，对于与珠的缔合为阴性的细胞大部分是成纤维细胞并可进行计数和用于COPD成纤维细胞测定。从此时起，细胞培养在补充有10%胎牛血清(FCS)的DMEM中。将成纤维细胞以le5细胞/孔涂布在96孔平底聚苯乙烯板中，并在37°C孵育过夜以允许粘附。在加入IL-I β浓度为O. 5ng/ml最终测定浓度的IL-Ιβ (R&D Systems 201-LB/CF)之前，将抗体或培养基单独与细胞在两个孔中预孵育30分钟。每个孔的终体积为200ul。将板在37°C 5%C02下孵育24小时。将板短暂离心，然后取出上清液用于使用R&DSystems ELISA(DY206)分析IL-6水平。体内方法
小鼠为成年Balb/c雌性。在使用5ng于50ul中的剂量气管内施用IL-I β到小鼠肺之前，皮下给药阿那白滞素。4小时后，灌洗小鼠的肺，基本与急性吸烟模型(实施例2) 一样,并进行总细胞和不同细胞的计数。实施例2-IL-1R1拮抗剂抑制肺炎的急性吸烟模型中细胞的流入。抗体35F5是结合小鼠IL-1R1并阻止IL-1 β和IL-1 α 二者与受体IL-1R1结合的单克隆抗体。阿那白滞素拮抗IL-I β和IL-Ia 二者的效应。白细胞介素I显示与人中炎性过程的稳定疾病和吸烟诱导的改变的强烈疾病关联。此实施例中显示的数据证实35F5对IL-IRl的抑制减轻了由与COPD相关的刺激如吸烟诱导的鼠肺炎的急性模型中的炎症。这与公共领域之前的观察和与使用IL-IRa(阿那白滞素；IL-1受体拮抗剂)的其他研究一致。在此小鼠模型中，吸烟引起吸烟后4天嗜中性粒细胞BAL细胞数目的显著增加。为了研究IL-IRl途径抑制对针对吸烟的急性炎症应答的效应，将Balb/c小鼠每天两次暴露于吸烟(持续50分钟)5天，并每天一次腹膜内给药35F5、同种型对照大鼠IgGl (MAB005)或盐水，开始于第一次吸烟暴露前48小时并持续4天。在第5天，处死动物并进行BAL。包括另外的处理臂，其中动物如上暴露于吸烟但在第一次吸烟暴露前48小时开始用阿那白滞素使用输注泵(ALZET)皮下(SC)连续给药。35F5和通过ALZET的阿那白滞素施用二者均显著抑制小鼠BAL中吸烟诱导的急性炎性细胞浸润，而同种型对照抗体(MAB005)没有作用。35F5显著降低吸烟诱导的总细胞(p〈0. 001)、嗜中性粒细胞(p〈0.01)和淋巴细胞(p<0. 001)的增加。在此研究中，BAL中的巨噬细胞未响应吸烟暴露而显著增加。吸烟暴露和IL-IRl拮抗剂抑制对肺炎性细胞的效应的总结提供于图3。研究的方案显示于图2并在方法中描述。在驯化和处理之间进行用于ALZET处理的渗透泵的植入，以允许处理前的恢复。35F5是由BD Biosciences/BD Pharmingen销售的可商购的啮齿动物抗体。MAB005同种型对照是从R&D Systems可获得的。方法两种研究均使用成年Balb/c雌性小鼠。抗体35F5来源于BDBioscience (SanDiego)(纯化的ΝΑ/LE大鼠抗-小鼠CD121a，目录号624094)，为IL-IRl特异性的大鼠IgGl单克隆抗体。其含有非常低水平的内毒素(〈O. 01ng/ug内毒素)且不含防腐剂。大鼠同种型对照来源于R&D Systems (目录号MAB005，批次CAN070905A)且含有低内毒素水平 O. lEU/ug)。阿那白滞素获自药店-Kineret DB00026 (BTD00060 ；BI0D00060)批号1004729 (004699) exp072009 (Amgen)。使用去除过滤嘴的Kentucky研究等级香烟IR3F(Tobacco and Health Research Institute,University of Kentucky)。用于在一些小鼠中连续施用阿那白滞素的渗透泵是ALZET 2001型，标称性能(在37°C下)0. 93ul/hr，7天持续时间，O. 23ml贮库体积。向泵充入已达到室温的阿那白滞素(避光)。将150mg/ml贮液在等渗盐水中稀释以提供48mg/kg/天的剂量，泵的充入按照生产商的说明在无菌条件下进行。动物在实验开始至少7天前收到，使其适应暴露箱增加的与吸烟机连接的时间段而不接受吸烟，并保持在具有12hr光/暗周期、21±2°C和55±15%湿度的设施中。它们可以随意食用标准饲料和饮用自来水。在研究开始前，将动物随机分组。将具有渗透泵植入的那些动物称重并用异氟烷混合物(N20、O2L 4:1. 2和3%异氟烷)麻醉，在麻醉状况下，刮净左肩胛骨区域并清洁，然后在马库斯下肩胛骨(margus caudal is scapulae)后5mm处进行小的背-腹皮肤切口。将切口区域浸泡在卫生处理液(sanitising fluid)(麻卡因50mg/ml)中，然后用剪刀在皮下组织中开出口袋。将充满的泵插入口袋中，首先是递送端，以使与开口的相互作用最小。在无菌条件下用缝线闭合开口，观察小鼠直到恢复。吸烟(CS)期间 开始于此程序后不低于48小时。抗体(或阿那白滞素，在腹膜内阿那白滞素组中)以<200ul体积腹膜内(i.p.)施用(每个个体研究方案4次注射)以不超过10ml/kg体重。抗体(或阿那白滞素，在腹膜内阿那白滞素组中)以15mg/kg标称浓度给药。渗透泵植入后48小时或腹膜内抗体施用后I小时，小鼠接受它们的第一次吸烟期间。在每个吸烟暴露期间中，小鼠被随机放在全身暴露箱中并在第1-4天每天两次暴露于吸烟50分钟。吸烟50分钟等于10支香烟；吸烟机交替空气和吸烟喷雾。对照组接受相同的程序但是用空气代替吸烟。在第5天通过施用戊巴比妥处死小鼠(最后一次吸烟暴露后16小时)。暴露气管后，用室温PBS (不含Mg和Ca)在23cm流体静力压下灌洗肺(2min进和Imin出，并重复)。离心细胞-上清液可用于分析介导物,而细胞用于使用自动计数仪如Sysmex ΧΤ-1800 Vet分析总细胞和不同细胞计数。使用学生t_检验计算组之间的差异显著性，以单尾分布和双样本不等方差作为最小显著性(单侧学生t-检验，不等方差)。P-值的限值为P彡O. 05。实施例3-在急性小鼠模型中，IL-I α在吸烟驱动的炎症中起关键作用。没有研究描述吸烟诱导的炎症模型中IL-I α的抑制。在体外的简单活性测定中，IL-I α和IL-I β 二者在相似的浓度诱导同等的IL-IRl激活，因此我们推测如果在疾病中存在，IL-Ια和IL-Ιβ 二者均可激活IL-1R1。然而，文献尚未描述IL_1 α在疾病中的任何参与。这里我们展示IL-I α在急性吸烟诱导的炎症中起关键作用。首先我们证明IL-I α和IL_1 β 二者均存在于吸烟暴露的小鼠的肺中。室内空气对照小鼠中IL-Ia的表达主要局限于肺泡空间内的巨噬细胞以及有时局限于支气管粘膜内的上皮内细胞，支气管上皮细胞和上皮分泌细胞偶见低等级染色(图4Α)。在吸烟暴露的小鼠中，扩大的肺泡巨噬细胞群体上显著的IL-Ia表达是关键的组织学表型；虽然在增生性支气管上皮细胞上也偶见IL-I α染色。值得注意的是，支气管和血管外膜区室内的浸润细胞是阴性的。与IL-I α表达模式形成对比，在室内空气和吸烟暴露的小鼠中观察到IL_1 β的广泛组织表达(图4A)。在室内空气对照中，注意到肺泡巨噬细胞群体上的可变表达。此夕卜，肺泡I型(ATI)和ATII细胞上，尤其是在ATII细胞的终末肺泡芽上，和偶发的肥大性ATII细胞上存在表达。在吸烟暴露的动物中，观察到扩大的肺泡巨噬细胞群体中的显著染色。此外，在ATI和ATII细胞，特别是肥大形式的细胞中均观察到了增加的表达。还在支气管上皮上观察到IL-I β的广泛和显著表达。这在肥大性细胞和上皮分泌细胞上尤其明显。如通过与实施例12以及图13Α和B比较可见的，吸烟暴露的小鼠中IL-Ia和β的组织表达涉及与COPD患者中所见的相似的炎性浸润和驻留细胞群体。鉴于COPD患者样品中IL-I α和β表达谱和以上小鼠模型中之间的相似性，我们使用此实验模型作为检查IL-I α和IL-I β对吸烟诱导的炎症和病毒恶化的功能重要·性的平台。前述预期模拟COPD和COPD恶化。我们观察到吸烟暴露的动物的肺中总IL-I α和IL-I β与对照相比的增加的水平(分别为图4Β和4C)。为了评估嗜中性粒细胞炎症在我们的模型中的作用，将IL-IRl缺陷和野生型小鼠暴露于吸烟。嗜中性粒细胞增多症在IL-IRl缺陷动物的支气管肺泡灌洗液(BAL)中与野生型对照相比被完全减弱(图4F)。IL-IRl缺陷没有影响吸烟暴露的小鼠的BAL中的总细胞或单核细胞数目(分别为图4D和4Ε)。虽然表达募集嗜中性粒细胞的趋化因子，CXCL-I、-2和-5在野生型小鼠吸烟暴露后是增加的。IL-IRl缺陷显著降低此诱导。鉴于半胱天冬酶-I将前-IL-I β裂解成其生物活性形式和已显示该过程促进吸烟诱导的嗜中性粒细胞炎症，我们将半胱天冬酶-I缺陷小鼠暴露于吸烟。半胱天冬酶-I缺陷没有显著改变BAL中吸烟诱导的嗜中性粒细胞增多症(图41)。相似地，BAL的总细胞和单核细胞数在吸烟暴露的半胱天冬酶-I缺陷小鼠中与野生型对照相比没有降低(分别为图4G和H)。有意思的是，我们观察到野生型和半胱天冬酶-I缺陷小鼠中相似的总IL-Ia和IL-I β蛋白水平(分别为图4J和K)，暗示IL-I β的加工和激活也可能独立地或在不存在半胱天冬酶-I下实现，或IL-I β的检测不能区分无活性的前-IL-I β和活性的成熟IL-I β ο为了确认IL-I α和IL_1 β对嗜中性粒细胞炎症的相对作用，我们向吸烟暴露的小鼠施用抗-IL-I α或抗-IL-I β阻断抗体或同种型对照抗体。虽然抗-IL-I α干预消除了吸烟诱导的嗜中性粒细胞增多症(图5A)，但是抗-IL-I β阻断以及同种型对照的施用均没有影响吸烟诱导的炎症。这些数据暗示IL-I α在介导吸烟诱导的炎症中的关键作用。因为IL-I a显著减弱嗜中性粒细胞向吸烟暴露的小鼠的肺的募集，我们评估了募集嗜中性粒细胞的趋化因子是否被IL-I a的阻断优先降低。我们观察到CXCL-1RNA和蛋白在吸烟暴露后显著增加的表达(分别为图5B和C)。抗-IL-I a而不是抗_IL_1 β降低吸烟暴露的小鼠中CXCL-1RNA和蛋白表达。同种型抗体递送没有改变转录物或蛋白表达水平。此外，在吸烟暴露后增加的CXCL-2、CXCL-10和CXCL-5基因表达在用抗_IL_1 α而不是IL-I β处理后降低(图5F)。总之，这些数据与以下结论一致吸烟暴露的动物中观察到的嗜中性粒细胞炎症需要CXCL-1、-2和-5的表达，而这些因子的表达被IL-I α而不是IL-I β的阻断裳减。因为IL-I α和IL-1 β 二者均通过IL-1R1传递信号，我们接下来检查了 IL_1 a抑制是否降低IL-Ιβ的表达。图5显示接受抗-IL-I a抗体的吸烟暴露的小鼠中显著降低的IL-I β转录物和蛋白水平(分别为图D和Ε)。相似地，我们观察到GM-CSF的降低表达，GM-CSF是最近被暗示参与吸烟诱导的炎症的细胞因子。我们还发现抗-IL-Ια而不是IL-I β抑制显著降低巨噬细胞弹性蛋白酶ΜΜΡ-12的表达水平。这些数据证明IL-I α而不是IL-I β对于介导导致嗜中性粒细胞在吸烟暴露的小鼠的肺中积累的信号是关键的。动物。BALB/c小鼠(6-8 周龄)购自 Charles River 实验室(Montreal,Canada)。C57BL/6、IL-IRl-缺陷和半胱天冬酶-I-缺陷小鼠获自Jackson实验室(Bar Harbor, ME,USA)。小鼠维持在无特定病原体条件的访问受限区域，12小时光-暗周期，随意提供食物和水。吸烟暴露。小鼠使用SIU-48全身吸烟暴露系统(Promech Lab AB, Vintrie,Sweden)如前所述地暴露于吸烟。简要而言,将小鼠暴露于除去过滤嘴的12 2R4F参考香烟(Tobacco and Health Research Institute,University of Kentucky,Lexington,KY,USA)持续大约50分钟时段。这一吸烟暴露方案已经过验证并且显示与经常吸烟的人中发现的水平相当的血液碳氧血红蛋白和可替宁水平。对照动物仅暴露于室内空气。 抗体的施用。在第一次吸烟暴露之前12小时，向小鼠腹膜内注射400μ g的抗-IL-Ια (克隆 ALF161 ；R&D Systems，Burlington，Canada)、抗-IL-1 β (克隆 Β122 ；R&DSystems)或美国仓鼠同种型对照抗体(Jackson Immunoresearch,Burlington,Canada),然后在第二次吸烟暴露后I小时每天注射。在体外(除了供应者质量控制步骤之外)通过证明对IL-I诱导的IL-6从bEnd-3的(小鼠内皮细胞系)细胞的释放的抑制证实IL-I α和IL-I β抗体的生物活性。样本采集和测量。在用O. 25ml冰冷的Ix PBS然后O. 2ml的IxPBS灌充肺后采集支气管肺泡灌洗液(BAL)。总细胞数使用血细胞计数器获得。制备细胞离心涂片器用于不同细胞计数和用 Hema3 (Biochemical Sciences Inc. , Swedesboro, NJ, USA)染色。每个细胞离心涂片器计数300个细胞，并使用标准血细胞学标准分类单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。组织学分析和免疫组织化学。在小鼠肺的BAL后，在30cm H2O压力下用10%福尔马林固定左肺叶。在石蜡块中包埋肺，产生4 μ m厚的横切片。对于IL-Ια和IL-I β染色，在一抗孵育之前，向每个玻片添加 Rodent M Block (Biocare Medical、Concord、CA, USA)持续30分钟，然后用具有0. 05%Tween-20的Tris-缓冲的盐水(TBS-T)洗掉。在UltraAntibody Diluent (Thermo Scientific, Rockford, IL、USA)中制备 10 μ g/ml 山羊抗-小鼠 IL-Ια 和 IL-I β (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)并与玻片孵育 I 小时。根据生产商的说明使用二级山羊聚合物辣根过氧化物酶(BioCare Medical ;Concord, CA, USA)。用于富鲁达分析的RNA提取。使用Qiagen RNeasy Fibrous Tissue试剂盒根据生产商的方案(Qiagen, Hilden, Germany)从单一小鼠肺叶中提取RNA。定量RNA并进行标准化，使用 Agilent RNA 6000Nano 试剂盒(Agilent, Santa Clara, CA, USA)通过 AgilentBioanalyzer 评估 RNA 完整性。cDNA 产生用 Life Technologies 的 Super Script III 试剂盒利用生产商的方案进行(Life Technologies, Carlsbard, CA, USA)。相对转录物表达使用加载了如前所述的目标转录物的探针的Fluidigm Biomark Dynamic阵列评估。ELISA和中尺度发现分析。IL-I α和IL-I β的酶联免疫吸附测定试剂盒购自R&DSyStemS(Minneap0liS，MN，USA)，测定根据建议的方案进行。角蛋白衍生的细胞因子(KC)和IL-1 β的多阵列平台细胞因子检测使用Meso Scale Discovery (MSD ；Gaithersburg,MD，USA)开发的多阵列鼠促炎性和Thl/Th2细胞因子系列检测系统进行。数据和统计分析。数据使用Graphpad Prism Software 版本 5 (La Jolla, CA, USA)分析，并表示为平均值土SEM。统计分析用SPSS统计软件，版本17. O (Chicago，IL, USA)进行。我们使用SPSS单因变量一般线性模型(SPSS Univariate General Linear ModelUnivariate General Linear Model)评估显著性(p〈0. 05),随后对于两组比较进行t_检验或对于多重组比较进行具有邓奈特事后检验的单向AN0VA。实施例4-抗辐射的基质细胞上的IL-I受体表达对于吸烟诱导的炎症是必要的。如通过比较图6A和B可见的，吸烟暴露的小鼠中IL-IRl的组织表达涉及与COPD患者中见到的相似的驻留细胞群体。为了测试COPD的吸烟诱导的炎症模型中造血细胞和非造血细胞之间交谈的重要性，我们产生了 IL-IRl-缺陷的骨髓嵌合小鼠。将来自野生型或IL-IRl-缺陷小鼠的骨髓细胞静脉内转移至照射的野生型或IL-IRl-缺陷的接受者小鼠(图6C)。重构8周后，将 小鼠暴露于吸烟并评估各种炎性参数。接受野生型骨髓细胞的野生型动物(WT到WT)响应于吸烟暴露发展强壮的嗜中性粒细胞增多症(图6D);而用IL-IRl-缺陷的骨髓细胞重构的IL-IRl-缺陷动物(K0到K0)中未观察到嗜中性粒细胞增多症。将野生型造血细胞转移到照射的IL-IRl-缺陷小鼠得到的嵌合小鼠(WT到K0)未能展示对吸烟的嗜中性粒细胞应答，暗示非造血抗辐射细胞上的IL-IRl表达对于吸烟诱导的炎症是必要的。最后，将IL-IRl-缺陷造血细胞转移到照射的野生型接受者小鼠(K0到WT)显示吸烟诱导的嗜中性粒细胞增多症的显著但部分的降低。我们还研究了多种基因的表达，包括CXCL-1、GM_CSF和MMP-12 (分别为图6E-G)，所有这些基因均在用IL-IRl缺陷的骨髓细胞重构的IL-IRl缺陷动物(K0到K0)中降低。有意思的是，当与WT到WT对照动物相比时，虽然吸烟暴露的WT到KO嵌合动物显著降低了基因表达，但是KO到WT动物则没有。这些结果支持IL-IRl介导的非造血细胞激活是吸烟诱导的炎症的必要条件，而造血细胞上的IL-IRl表达是最大嗜中性粒细胞浸润所需要的。这是重要的，因为肺中上调的IL-Ici和β将理论上快速和局部地作用于表达IL-IRl的肺驻留细胞来诱导炎症。不受理论束缚，这些结果可表明IL-IRl阻断策略可能比阻断可溶性IL-I更加有效，且在肺和全身二者阻断IL-IRl将具有另外的益处。方法关于人切片中IL-IRl染色的免疫组织化学，参见实施例12。小鼠免疫化学基本与实施例3相同，但替代抗-IL-I α或β抗体使用5 μ g/ml山羊抗-小鼠IL-IRl抗体(R&DSystems, Minneapolis, MN, USA)在玻片上孵育 I 小时。IL-IRl-缺陷的骨髓嵌合小鼠的产生。将500万个C57BL/6野生型或IL-IRl-缺陷的骨髓细胞静脉内注射到照射的(550拉德，2个剂量(共11戈瑞))接受者C57BL/6野生型(WT)或IL-IRl-缺陷的(敲除(KO))小鼠。在照射前一周和照射后两周，接受者小鼠饮用甲氧苄啶和磺胺甲噁唑抗生素处理的水。允许小鼠重构造血骨髓细胞8周。吸烟施用基本与实施例3相同。下一实施例涉及与COPD的急性恶化(AECOPD)相关的模型。实施例5-IL-1R1拮抗剂抑制LPS介导的炎性细胞向肺的流入。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌的细胞壁组分。已显示这些细菌是COPD的急性恶化的一种触发因素，吸入的LPS诱导的炎症是模拟此类事件的一种途径。在LPS介导的炎性细胞向肺的流入的小鼠模型中检查了 IL-IRl拮抗剂阿那白滞素的效应。与对照LPS处理的小鼠相比，阿那白滞素抑制LPS介导的炎性细胞向肺的流入达47%，如通过BAL总细胞所测量的(Ρ〈0· 001)(图7)。方法阿那白滞素使用ALZET渗透泵递送，如对于急性吸烟模型所述，并在LPS施用前48小时施用于小鼠。小鼠为成年雌性Balb/c小鼠。将小鼠置于半开放的暴露吸入箱(最多10只小鼠)，并暴露于气雾化的LPS —次-总吸入期间时间12分钟。铜绿假单胞菌(P. aeriginosa)LPS以5mg/ml的浓度使用，并使用雾化器气雾化(如PariStar Jet Star雾化器)，充入5ml体积，自雾化器的流速为51/min (压力=2巴)。对照组接受相同的程序但是使用PBS。LPS攻击后48小时使用腹膜内注射戊巴比妥处死小鼠，暴露气管，并使用室温PBS (不含Ca或Mg)以23cm流体压采用 2分钟进和I分钟出灌洗肺，然后重复该程序。然后离心BAL-使用标准的自动化细胞计数和不同细胞计数分析细胞沉淀。还摘除肺进行匀浆化以用于mRNA分析或细胞因子/介导物分析。组之间的差异显著性使用学生T检验以单尾分布和双样本不等方差进行计算。使用不等方差T-检验的ρ-值限值p〈0. 05。实施例6-IL-1R1调控肺上皮细胞系和原代正常人支气管上皮细胞对鼻病毒感染的应答。人鼻病毒是已被暗示参与COPD的急性恶化(AECOPD)的常见病毒。已显示COPD患者具有对鼻病毒加剧的应答。为了研究IL-I在人鼻病毒(HRV)-介导的炎症应答中的作用，使用PEG纯化的HRV14感染BEAS-2b/H292细胞(可从ATCC获得的人细胞)，同时将这些细胞暴露于IL-IR拮抗剂(图8A)。方法参见实施例8。在处理和HRV14感染细胞后检查原型炎症介导物IL-8 (CXCL-I)(图8)。IL-8水平被种系化的抗体6和阿那白滞素二者降低(图8B)，但不被同种型对照抗体降低。对细胞使用的阿那白滞素的浓度是25nM。另外使用了替代的方案，如图8C所示，结果在图8D中显示。测试了阿那白滞素的3个浓度，所有浓度均降低响应于HRV14的BEAS-2B细胞中的IL-8释放。BEAS-2B和H292细胞是上皮细胞系，所以另外在生理上更相关的来源于Lonza的原代正常人支气管上皮细胞中分析了此应答(图8E)。正常人支气管上皮(NHBE)细胞的人鼻病毒感染(HRVlb)造成培养基中增加的IL-8释放，感染后48小时测量。当与鼻病毒+同种型对照相比时，种系化的抗体6 (Ab6GL ；10nM)显著抑制对鼻病毒的应答。Ab6GL抑制应答的程度与阿那白滞素(Kineretf)相似，阿那白滞素用作阳性对照。当与单独的鼻病毒组相比时，阿那白滞素(IOnM)对响应于鼻病毒感染的上皮细胞的IL-8产生具有显著效应(图SE)。在这些实验中使用人鼻病毒-Ib (少数组病毒)，以便可以比较IL-IRl阻断在体外和在体内(参见实施例7)的效应人鼻病毒-Ib能够感染小鼠，而多数组HRV(如HRV14)不能感染小鼠。IL-I阻断对少数和多数组鼻病毒(HRV14)诱导的IL-8产生的体外效应显示相似的趋势。这说明IL-IRl阻断在体外降低对人鼻病毒的促炎性应答。这一特质在标准化针对鼻病毒感染的COPD加剧的应答中是有用的。实施例7-IL-1R1阻断减轻急性小鼠模型中针对HRV的病毒诱导的炎症。为了研究抗-IL-IRl是否可以消除针对病毒的促炎性嗜中性粒细胞应答，在鼠HRV攻击模型中使用可商购的抗-小鼠IL-IRl抗体35F5(上文已描述)。已显示少数组血清型HRVlb感染小鼠上皮细胞并在小鼠肺中诱导急性炎症，在此研究中使用。为了测试抗-IL-IRl抑制是否在体内在病毒攻击模型中具有相似的抗炎效应，测定了全身和鼻内施用的35F5降低HRV诱导的肺中的细胞炎症的能力。人鼻病毒-Ib鼻内施用(纯化病毒，107噬斑形成单位[pfu]/mL)显著增加病毒施用后24小时BAL中的总细胞和嗜中性粒细胞计数。由于模型的急性性质，未测量病毒载量。紫外照射的鼻病毒产生降低的炎症应答，如通过BAL中的细胞浸润所测量的，显示显著部分的应答依赖于完整病毒。在用纯化的HRVlb鼻内攻击前24小时，将抗-小鼠IL-IRl抗体35F5或同种型对照(大鼠IgGl ；MAB005)以15mg/kg的单次剂量腹膜内给予或100 μ g的剂量鼻内给予小鼠。病毒灌输后24小时测量动物BAL中的细胞浸润。35F5显著降低响应于HRVlb攻击的小鼠BAL中的总细胞浸润(图9)和嗜中性粒细胞的流入。响应于病毒的嗜中性粒细胞炎症的降低可能是在COPD中有益的，COPD中潜在的慢性炎症被病毒感染加剧。实施例8-IL-1R1阻断减轻上皮细胞中响应于吸烟和吸烟+病毒的炎症。在体外测量了响应于烟雾调节的培养基，或烟雾调节的培养基和病毒中上皮细胞 的炎症应答。烟雾调节的培养基通过使香烟烟雾通过组织培养基(TC)产生，并在本实施例的下文称为‘吸烟’或细胞的‘吸烟处理’。一根除去过滤嘴的香烟通过25mL培养基等于100%吸烟的培养基。滴定吸烟处理的培养基的IL-8释放和BEAS-2b细胞上的细胞汇合。对所有实验使用20%吸烟的培养基，因为其诱导促炎性细胞因子释放而没有显著的细胞死亡。为了检查IL-IR在吸烟和病毒诱导的炎症中的作用，细胞首先进行吸烟处理，伴有IL-IR拮抗剂预处理，然后根据需要，用HRV病毒感染，伴有IL-IR拮抗剂阿那白滞素的另一预处理(图IOA和10C)。实验进行四次，使用不同浓度的阿那白滞素(如图中所示)。阿那白滞素处理造成吸烟诱导的IL-8应答的部分抑制(图10B)。吸烟和病毒刺激物就IL-8应答而言是加成性的。吸烟和病毒暴露后的阿那白滞素处理抑制组合的吸烟和病毒IL-8应答(图10D)。实现了浓度依赖的和完全的抑制。这些结果表明，用IL-IR拮抗剂处理可抑制对病毒感染的炎症应答，以及对吸烟和病毒感染的组合的炎症应答，如通过IL-8应答的抑制所评估的。方法(与实施例6和实施例8 二者相关)用于上皮吸烟和病毒工作的细胞是获自ATCC的BEAS-2B细胞(目录号CRL-9609)并按供应商的说明培养，或来自ECACC的H292(目录号91091815NCI-H292)，也按供应商的
说明培养。将点着的香烟(没有过滤嘴)通过管线连接到支持在玻璃烧瓶中的含有组织培养基的falcon管(50ml容量)。蠕动泵抽吸烟雾通过管线并进入组织培养基。将废烟抽吸到具有去污剂的烧杯中。整个程序在通风橱中进行以保护操作者和实验室的其他使用者。因此，该程序不是无菌的。为了尽可能地保持无菌性，使用已用70%乙醇擦拭的镊子将含有培养基的falcon管置于锥形瓶中。插过塞子递送烟雾到组织培养基的吸管每次更换并在临近程序之前用70%乙醇擦拭。用镊子回收falcon管并尽可能快地更换盖子。然后将吸烟的培养基稀释并尽可能快地置于细胞上，优选在完成吸烟程序的一小时内[n.b.培养基不含用于烟雾抽取程序的血清]。另外，在这些细胞的标准培养/测定培养基中，包括了抗生素(庆大霉素(gentomycin))。该细胞系的基础培养基(BEBM)以及所有添加剂作为试剂盒获自 Lonza/Clonetics Corporation :BEGM,试剂盒目录号 CC-3170。根据所示的方案将细胞暴露于鼻病毒(多数组HRV14，使用Hela-Ohio细胞通过标准做法制备和滴定，使用粗制的或PEG沉淀的病毒)。将细胞接种于胶原蛋白包被的透明的平底板并在37°C 5%C02下孵育，让其过夜粘附。除去孔中的培养基，并用150ul的培养基+/_阿那白滞素(阿那白滞素为2x终浓度)替代。细胞在37°C 5%C02下孵育30分钟。吸烟培养基根据描述制备(烟雾提取物可使用Kentucky研究等级香烟制备)。将烟雾提取物用培养基稀释至40%，然后以150ul添加到细胞而不去除培养基+/_阿那白滞素。一些细胞用单独的培养基作为对照。将这些细胞孵育24小时。取出200ul的上清液并冷冻用于稍后的细胞因子分析。取出剩余的培养基并丢弃。将阿那白滞素或培养基以IOOul替换到细胞上，并在30分钟后以通过在HeLa OHIO细胞上的病毒储液的滴度确定的稀释度添加病毒，以确定以另外的IOOul制备的每个批次的等同活性。细胞在37°C 5%C02下孵育3小时。然后除去细胞的所有培养基，向细胞添加 阿那白滞素或新鲜培养基并在37°C 5%C02下孵育另外48小时。使用ELISA试剂盒(R&D Systems Duoset DY208)根据生产商的说明和使用R&D重组蛋白作为测定的标准品测量上清液中的IL-8。实施例9 -吸烟暴露的精密肺切片(PCLS)中IL-IRl缺陷减弱对病毒刺激物的肺
驻留应答。在本实施例中，我们评估了吸烟暴露的肺对病毒攻击的不同应答是否存在相似的机制。我们从室内空气-和吸烟-暴露的野生型和IL-IRl-缺陷的小鼠的肺产生了精密肺切片(PCLS)。用dsRNA配体聚肌苷酸聚胞苷酸(聚I:C)离体刺激PCLS，并评估关键介导物的表达。与室内空气暴露的对照相比，我们在从吸烟暴露的野生型产生的PCLS中观察到响应于聚I :C刺激的募集嗜中性粒细胞的趋化因子CXCL-I和CXCL-5的显著更大的诱导和CXCL-2的中度增加(图10E)。测量的所有转录物在病毒模拟刺激的吸烟暴露的IL-IRl-缺陷PCLS中显著减弱。联合地，这些数据证明肺驻留细胞在促进吸烟诱导的炎症中的作用，并支持IL-IRl在吸烟暴露的肺对病毒感染的不同应答中的作用。方法精密肺切片和培养。使用根据之前已在Bergner等人,2002, Journal of GeneralPhysiology 119:187-198中描述的标准方案修改的方案对肺进行切片。这种修改在Khan等人,2007, European Respir Journal 30 :691-700中进一步描述。简要而言，用大约1.4ml的以下琼脂糖(VII-A型低胶凝温度；Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)充填肺升温至37°C并在汉克斯缓冲盐水溶液(HBSS)中制备为2%浓度，补充有N-2-羟乙基哌嗪-N' -2-乙磺酸(HEPES) (O. 2M，pH 7. 4)。随后，将O. 2ml空气注射到肺中以将琼脂糖-HBSS溶液冲出导气道。通过将肺冷却至4°C持续15分钟胶凝琼脂糖。解剖肺叶，与支气管平行且近尾部地在肺叶上切出平整表面。在切片之前和过程中，将肺叶保持在冰冷的IxHBSS溶液中。在4°C使用振动切片机产生120 μ m厚切片(Leica ;型号VT 1000S，RichmondHill, Canada)。从每个小鼠肺分离大约40个切片。随后将肺切片转移至补充以下的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’ sModified Eagles Medium) (DMEM)/Fl 2 (Gibco, Burlington, Canada)并培养35μ g/mlL-抗坏血酸(Sigma-Aldrich, Oakville, Canada)、5 μ g/ml 转铁蛋白(Gibco, Burlington,Canada) >2. 85 μ g/ml 膜岛素(Sigma-Aldrich, Oakville, Canada)和 3. 25ng/ml 砸(原子吸收标准溶液；Sigma-Aldrich, Oakvilie, Canada)。将溶液使用O. 22 μ m孔过滤器过滤灭菌。在 DMEM/F12 溶液中进一步补充 250ng/ml 两性霉素 B (Sigma-Aldrich, Oakville, Canada)和1%青霉素/链霉素。培养的前3小时，每I小时更换培养基以去除任何残留的琼脂糖和肺切片培养物的细胞碎屑。第二天用100ug/ml已在磷酸盐缓冲盐水中重构的dsRNA模拟物聚肌苷酸聚胞苷酸(GE Healthcare,Mississauga, Canada)刺激肺切片6小时,或保持未处理。在RNA later (Ambion, Austin, TX, USA)中收集样品并在_80°C保存直至提取RNA。精密肺切片的RNA提取和实时定量RT PCR。采集肺切片并置于200 μ I的RNAlater (Qiagen,Mississauga, ON, Canada),在-80。C储存至需要时。根据来自 RNEasy 试剂盒(Qiagen,Mississauga, ON, Canada)的动物组织方案从肺切片中提取RNA。任选地进行柱上DNA酶消化。使用 Agilent 2100 Bio-analyzer (Agilent Technologies,Mississauga,ON, Canada)定量 RNA。分离的 RNA 的量和完整性使用 Agilent 2100Bioanalyzer (Agilent,Palo Alto, CA, USA)确定。随后，使用 100U Superscript II (Invitrogen, Burlington,·Canada)以20 μ L总体积对IOOng总RNA进行反转录。使用随机六聚体引物在42°C合成cDNA 50分钟，然后在70°C孵育15分钟。实时定量RT-PCR按一式三份进行，总体积25 μ 1，使用 Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)。CXCL-1、CXCL-2、CXCL-5、GAPDH 的引物以及 FAM-标记的探针购自 Applied Biosystems。PCR 使用ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System 使用 Sequence Detector Software 版本2. 2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)进行。使用 δ, δ Ct 法分析数据。简要而言，将基因表达针对看家基因(GAPDH)进行标准化并表示为相比于对照组(室内空气对照，模拟)的倍数变化。实施例10 - IL-IRl缺陷和IL-I α抗体阻断减弱吸烟暴露的小鼠的HlNl流感病毒感染模型中加剧的炎症。确立了 IL-I α在经由IL-1R1介导信号用于诱导吸烟诱导的炎症中的重要性，和鉴于显示了吸烟暴露的肺的驻留细胞在响应于病毒损伤中所起的作用(参见实施例9)，接下来我们试图评估这些机制是否存在于在体内病毒感染后观察到的加剧的炎症应答中。将野生型和IL-IRl-缺陷小鼠暴露于吸烟，随后用HlNl流感病毒感染。与病毒感染的室内空气对照小鼠相比，在病毒感染后在吸烟暴露的野生型小鼠的BAL中观察到加剧的炎症应答(图11Α)。虽然IL-IRl缺陷适度地减弱了(ρ=0. 089)吸烟暴露的流感感染小鼠中的总BAL炎症，但是这些动物中的嗜中性粒细胞增多症与野生型对照相比被显著减轻(图11C)。这些数据暗示IL-IRl依赖的机制促进了病毒感染后吸烟暴露的小鼠中炎症应答的加剧。虽然IL-IRl缺陷可减轻吸烟暴露的流感感染的动物中加剧的炎症应答，我们假设IL-Ια将在促进这一应答中起支配作用。为了测试这一假设，我们在吸烟暴露和病毒感染过程中每天用抗-IL-Ια或同种型抗体注射动物。感染后5天，观察到吸烟暴露的小鼠中对甲型流感病毒的加剧的应答(图11D)。抗-IL-I α中和显著减弱了 BAL总炎症，该效应显著影响单核细胞，但不影响嗜中性粒细胞(分别为图IIE和F)。综合起来，这些数据支持以下结论旨在阻断IL-I a /IL-IRl的治疗在疾病不稳定时期，特别是CCffD恶化过程中可能是有益的。
方法基本与实施例3中对吸烟模型的描述相同。在感染过程中，流感感染的动物还每天接受腹膜内注射。流感感染。麻醉的小鼠用在35 μ I Ix磷酸盐缓冲盐水(PBS)媒介物中的50PFU小鼠-适应的HlNl甲型流感(A/FM/1/47-MA)病毒鼻内感染。对照动物接受35 μ I PBS媒介物。A/FM/1/47-MA是完全测序的、噬斑纯化的制品，生物特征在于小鼠肺感染。在病毒递送当日或病毒感染的整个过程中，动物不暴露于吸烟。对于病毒研究，在BAL之前，从右肺摘除一个肺叶以测定病毒滴度。将右肺的剩余部分保存在RNA later (Ambion, Austin, TX, USA)中，和用福尔马林灌充左肺用于组织学评估。下一实施例与人CCffD尤其相关。
实施例11-C0PD患者恶化与增加的IL_1 α和IL-1 β水平相关。在长时段内分析COPD人患者的痰测量的IL-I α和IL-I β水平以与恶化时程比较。使用PBS处理而不是DTT处理来处理痰以使对痰细胞因子含量的干扰最小。在该患者中，IL-I α和IL-I β 二者均在COPD的恶化后上调(图12Α)。恶化的时期与增加的IL-I α和IL-I β水平强烈相关。在不同的患者子集中，还分析了细菌状态和ILl-β的关联。对于痰中的细菌测试为阳性的患者，其中的IL-I β显著较高(图12Β)。实施例12-IL-1 α和IL-1 β在COPD患者的肺中是增加的。在本实施例中，我们检查了 GOLD I & II CCffD患者的肺中IL-1 α和IL-1 β的表达。肺切片活检染色对于IL-I α和β 二者均为阳性(分别为图13Α和B)。与非CCffD对照相比，从GOLD I&II COPD患者采集的活检样品中观察到的IL-I和β阳性细胞的数目显著更大(图13C)。鉴于肺结构细胞在起始炎症应答中的重要性(参见实施例4)，我们评估了与非COro对照相比CCffD患者的肺上皮中的IL-Ia和β染色。虽然与CCffD对照相比，CCffD患者的上皮中的IL-I α没有增加，但是IL-I β染色显著增加(ρ〈0. 0001)(分别为图13D和Ε)。从CCffD患者的痰中回收的IL-Ia和β的水平在稳定的疾病期间、恶化发作时(在另外的治疗之前)和恶化后7和35天(图13F-I)是显著相关的(ρ〈0. 0001)。IL-I α和β之间的相关性在恶化后7天最强。在患者的子集中，IL-Ia和β的水平在恶化时与稳定疾病就诊过程中测量的水平相比增加。综合起来，这些数据支持以下结论=IL-I信号转导不仅在稳定COPD中起作用，而且在急性恶化的发作过程中也起作用，阻断IL-IRl代表治疗治疗恶化的成功策略。方法人肺活检和痰样品。肺切片获自从GOLD I (n=3，I名男性和2名女性；目前吸烟者，n=3 ；FEV1/FVC%的平均值土SD=60±8)和GOLD II (n=6，4名男性和2名女性；目前吸烟者，n=2 ；FEV1/FVC%的平均值土SD=56± 10)COPD患者采集的活检样品。合并这两组的活检数据。将数据与获自解剖学上正常的肺叶区域的癌症肺叶切除术的非CCffD材料进行比较。痰样品获自登记处于稳定疾病、恶化发作及恶化发作后7天和35天的COPD患者。恶化定义为48小时时段内两个主要(呼吸困难、痰量或痰脓汁)症状或一个主要症状和一个次要(咳嗽、喘鸣、喉痛、鼻涕、发热)症状的增加。向患者给予就诊环境下的正常标准护理，痰样品的采集由研究人员决定。
对于IL-I a、IL_1 β、和IL-1R1的人表达，通过将切片在蒸馏水中的O. 2%胰蛋白酶/0. 2%CaCl2中在37°C下孵育10分钟进行抗原回收。内源过氧化物酶活性使用6%H202阻断10分钟。为了阻断与二级抗体的非特异性结合，将玻片在20%正常兔或山羊血清中孵育20分钟。除去过量的血清，将玻片与IL-Ia兔抗-人抗体(Abcam，9614，2.5 μ g/ml)、IL-I β 兔抗-人抗体(Abcam, 2105,10 μ g/ml)或 IL-1R1 山羊抗 _ 人抗体(R&D Systems，Ab-269-NA 10ug/ml)或者兔或山羊IgG阴性对照孵育I小时。将玻片与生物素化的兔抗-山羊二级a :200)或猪抗-兔(1:200)抗体孵育20分钟。在人组织集上釆用两种抗原检测方案=DStrep AB复合物/HRP(Dako)在室温20分钟，2x10分钟缓冲液洗涤和施加DAB I分钟。2)Sti*ep AB复合物/AP (Dako)在室温30分钟，2x10分钟缓冲液洗涤和FuchsinSubstrate-Chromagen System(Dako) 5分钟。玻片用苏木精复染(Sigma) 计数间隔大约IOum从每个患者釆集的两个单独活检样品的阳性细胞。250mm2标线与基膜对齐，并在固有层中在3个邻近区域计数细胞。序列
下面提供了某些抗体的序列信息。抗体6VH 氨基酸序列=Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly GlyGly Leu Val GlnPro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser GlyPhe Thr Phe Ser Ser Tyr AlaMet Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly LysGly Leu Glu Trp Val Ser Ala He Ser GlySer Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr AlaAsp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg AspAsn Ser Lys Asn ThrLeu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala ValTyr TyrCys Ala Lys Pro Leu Tyr Tyr Tyr Asp Glu Gln Tyr Gly Val Val Tyr AspAlaPhe Val Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser(SEQ ID NO:I)抗体6 重链 CDRl=Ser Tyr Ala Met Ser (SEQ ID NO 2)抗体6 重链 CDR2=Ala He Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr TyrAlaAsp SerVal Lys Gly (SEQ ID NO :3)抗体6重链CDR3=Pro Leu Tyr Tyr Tyr Asp Glu Gln Tyr Gly Val Val Tyr AspAla Phe Val (SEQ ID NO :4)抗体6VL 氨基酸序列=Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser ValSer Gly AlaPro Gly Gln Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser AsnIle Gly Ala Gly TyrAsp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr AlaPro Lys Leu Leu lie Tyr Gly AspThr His Arg Pro Ser Gly Val Pro AspArg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser AlaSer Leu Val He Ala Gly LeuGln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser TyrAsp Thr Val ArgLeu His His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu(SEQ IDNO 5)抗体6 轻链 CDRl=Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly TyrAsp ValHis (SEQ ID NO :6)抗体6 轻链 CDR2=Gly Asp Thr His Arg Pro Ser (SEQ ID NO :7)抗体6 轻链 CDR3=Gln Ser Tyr Asp Thr Val Arg Leu His His Val (SEQ ID NO:8)抗体6VH -种系化的=Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly GlyLeu Val GlnPro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly PheThr Phe Ser Ser Tyr AlaMet Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys GlyLeu Glu Trp Val Ser Ala He Ser GlySer Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala AspSer Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg AspAsn Ser Lys Asn Thr LeuTyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr CysAla Lys Pro Leu Tyr Tyr Tyr Asp Glu Gln Tyr Gly Val Val Tyr Asp AlaPheVal Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO :9)抗体6VL -种系化的=Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser ValSer Gly AlaPro Gly Gln Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser AsnIle Gly Ala Gly TyrAsp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr AlaPro Lys Leu Leu lie Tyr Gly AspThr His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser AlaSer Leu Ala lie Thr GlyLeu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser TyrAsp Thr ValArg Leu His His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu (SEQIDNO 10)
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer LeuArg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr GlyMet His Trp Val ArgGln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala GlyIle Trp Asn Asp Gly He Asn LysTyr His Ala His Ser Val Arg Gly ArgPhe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn ThrLeu Tyr Leu Gln Met AsnSer Pro Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala ArgAla Arg SerPhe Asp Trp Leu Leu Phe Glu Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val ThrValSer Ser (SEQ ID NO :31)CDR1、CDR2和CDR3标有下划线并加粗。CDR1=NYGMH(SEQ ID NO :32)CDR2=GIWNDGINKYHAHSVRG(SEQ ID NO :33)CDR3=ARSFDWLLFEF(SEQ ID NO :34)抗体26F5 - VL (轻链可变结构域)Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GluArgAla Thr Leu Ser Cys ArR Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu AlaTrp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr Asp AlaSer Asn ArR Ala Thr Gly HePro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyThr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser LeuGlu Pro Glu Asp Phe Ala ValTyr Tyr Cys Gln Gln ArR Ser Asn Trp Pro Pro Leu ThrPhe Gly GlyGly Thr Lys Val Glu He Lys (SEQ ID NO :35)CDR1、CDR2和CDR3标有下划线并加粗。CDR1=RASQSVSSYLA(SEQ ID NO :36)CDR2=DASNRAT(SEQ ID NO :37)CDR3=QQRSNWPPLT(SEQ ID NO :38)抗体27F2 - VH (重链可变结构域)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer LeuArg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr GlyMet His Trp Val ArgGln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala AlaIle Trp Asn Asp Gly Glu Asn LysHis His Ala Gly Ser Val Arg Gly ArgPhe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn ThrLeu Tyr Leu Gln Met AsnSer Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala ArgGly Arg TyrPhe Asp Trp Leu Leu Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val ThrValSer Ser (SEQ ID NO :39)CDR1、CDR2和CDR3标有下划线并加粗。CDR1=TFSNYGMH(SEQ ID NO :40)CDR2=AIWNDGENKHHAGSVRG(SEQ ID NO :41)CDR3=GRYFDWLLFEY(SEQ ID NO :42)
抗体27F2-VL (轻链可变结构域)Glu He Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly GluArgAla Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu AlaTrp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu He Tyr Asp AlaSer Asn Arg Ala Thr Gly HePro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyThr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser LeuGlu Pro Glu Asp Phe Ala ValTyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Leu ThrPhe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys (SEQ ID NO :35)CDR1、CDR2和CDR3标有下划线并加粗。CDR1=RASQSVSSYLA(SEQ ID NO :36)CDR2=DASNRAT(SEQ ID NO :37)CDR3=QQRSNWPPLT(SEQ ID NO :38)抗体15C4_VH(重链可变结构域)Glu Val Gln Leu Met Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu SerLeuLys He Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Phe His Trp IleAla Trp ValArg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly He IleHis Pro Gly Ala Ser AspThr ArR Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly GlnVal Thr He Ser Ala Asp Asn Ser Asn SerAla Thr Tyr Leu Gln Trp Ser SerLeu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys AlaArg Gln ArR Glu LeuAsp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val SerSer(SEQ ID NO :43)CDR1、CDR2和CDR3标有下划线并加粗。CDR1=FHWIA (SEQ ID NO :44)CDR2=IIHPGASDTRYSPSFQG(SEQ ID NO :45)CDR3=QRELDYFDY(SEQ ID NO :46)抗体15C4 - VL (轻链可变结构域)Glu He Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Vsl Thr Pro LysGlu LysVal Thr He Thr Cys ArR Ala Ser Gln Ser He Gly Ser Ser LeuHis Trp Tyr Gln GlnLys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu He Lys TyrAla Ser Gln Ser Phe Ser Gly ValPro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Asn Ser LeuGlu Ala Glu Asp Ala AlaAla Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu Thr PheGly Gly GlyThr Lys Val Glu He Lys (SEQ ID NO :47)CDR1、CDR2和CDR3标有下划线并加粗。
CDR1=RASQSIGSSLH(SEQ ID NO :48)CDR2=YASQSFS (SEQ ID NO :49)CDR3=HQSSSLPLT (SEQ ID NO :50)通过引用并入本文提及的所有出版物和专利通过引用整体并入本文，如同专门和单独地指明每个单独的出版物或专利通过弓丨用并入。虽然已讨论了本公开的具体实施方案，以上说明书仅是示例性的而非限制性的。本公开的许多变化将在本领域技术人员参阅本说明书和下面的权利要求书后变得明显。本公开的完整范围应参考权利要求书以及其等同物的完整范围、和说明书以及此类变化确 定。
权利要求
1.一种在有此需要的患者中减轻气道炎症的方法，其中所述患者是患有慢性阻塞性肺病(COPD)恶化的患者，包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合和抑制IL-IRl的抗体的组合物。
2.一种在有此需要的患者中降低IL-Ia信号转导的方法，其中所述患者是患有慢性阻塞性肺病(COPD)恶化的患者，包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合和抑制IL-IRl的抗体的组合物。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中所述抗体是抑制IL-IRl与IL-Iα结合的重组抗体。
4.如权利要求I或2所述的方法，其中所述抗体是抑制IL-IRl与IL-Iβ结合的重组抗体。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中减轻气道炎症是治疗COPD恶化的方法的一部分。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中减轻气道炎症包括降低嗜中性粒细胞向肺的流入。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述抗体具有大于或等于约25千道尔顿的分子量。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述抗体抑制IL-IRl与IL-Ia和IL-I β的结合。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述重组抗体是人抗体。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法是用于治疗COPD的治疗方案的一部分。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述用于治疗COPD的治疗方案包括类固醇的施用。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述COPD恶化由细菌感染引起。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述COPD恶化由病毒感染引起。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述COPD恶化由吸烟引起。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中当通过BiacoreTM测量时，所述抗体以50ρΜ或更低的Kd特异性结合IL-IRl。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述组合物的施用是全身施用。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法不包括所述组合物的鼻内施用。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在所述COPD恶化之前，所述患者患有分类为GOLD III期或GOLD IV期的COPD。
19.一种在有此需要的患者中减轻气道炎症的方法，其中所述患者是患有慢性阻塞性肺病(COPD)恶化的患者，包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-Ia和抑制IL-I α与IL-IRl结合的重组抗体的组合物。
20.一种特异性结合IL-IRl和抑制IL-IRl与IL-Ia结合的抗体，其用于治疗COPD恶化。
21.一种特异性结合IL-I α和抑制IL-I α与IL-1R1结合的抗体，其用于治疗CCffD恶化。
22.—种在有此需要的患者中治疗coro恶化的方法，其中所述患者是由于人鼻病毒诱导的气道炎症而患有coro恶化的患者，包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-IRl和抑制IL-IRl与IL-I α结合的抗体的组合物。
23.一种在有此需要的患者中治疗COPD恶化的方法，其中所述患者是由于病毒或细菌感染而患有COPD恶化的患者，包括向所述患者施用有效量的包含特异性结合IL-IRl和抑制IL-IRl与IL-I α结合的抗体的组合物。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中减轻气道炎症是治疗COPD恶化的方法的一部分。
25.如权利要求24所述的方法，其中减轻气道炎症包括降低嗜中性粒细胞向肺的流入。
26.如权利要求20-24中任一项所述的方法或抗体，其中治疗COPD恶化包括减轻气道炎症。
27.如权利要求20-25中任一项所述的方法或抗体，其中治疗COPD恶化包括降低嗜中性粒细胞向肺的流入。
28.如权利要求20-27中任一项所述的方法或抗体，其中所述抗体具有大于或等于约25千道尔顿的分子量。
29.如权利要求20-27中任一项所述的方法或抗体，其中所述抗体具有大约150千道尔顿的分子量。
30.如权利要求20或22-29中任一项所述的方法或抗体，其中所述抗体抑制IL-IRl与IL-Ia和IL-I β的结合。
31.如权利要求20-30中任一项所述的方法或抗体，其中所述抗体是人抗体。
32.如权利要求20或22-31中任一项所述的方法或抗体，其中所述抗体是可特异性结合人IL-IRl的重组抗体。
33.如权利要求20或22-32中任一项所述的方法或抗体，其中所述抗体是可特异性结合来自一种或多种非人灵长类物种的IL-IRl的重组抗体。
34.如权利要求20或22-33中任一项所述的方法或抗体，其中所述抗体不特异性结合鼠 IL-IRl。
35.如权利要求20-34中任一项所述的方法或抗体，其中所述方法或抗体是用于治疗COPD的治疗方案的一部分。
36.如权利要求35中任一项所述的方法或抗体，其中所述用于治疗COPD的治疗方案包括类固醇的施用。
37.如权利要求20-36中任一项所述的方法或抗体，其中COPD恶化由细菌感染、病毒感染或其组合引起。
38.如权利要求20-37中任一项所述的方法或抗体，其中在COPD恶化之前，所述患者患有分类为GOLD III期或GOLD IV期的C0PD。
39.如权利要求20或22-38中任一项所述的方法或抗体，其中当通过Biacore 测量时，所述抗体以50pM或更低的Kd特异性结合IL-IRl。
40.如权利要求20或22-39中任一项所述的方法或抗体，其中所述重组抗体是抗体6或具有抗体6的⑶R的抗体。
41.如权利要求20或22-39中任一项所述的方法或抗体，其中所述重组抗体与IL-IRa竞争结合IL-IRl。
42.如权利要求20-41中任一项所述的方法或抗体，其中施用是全身施用。
43.如权利要求20-42中任一项所述的方法或抗体，其中所述方法不包括所述组合物的鼻内施用。
44.如权利要求20-42中任一项所述的方法或抗体，其中所述方法不包括所述组合物的鼻内施用并且不包括所述组合物向肺的其他形式的局部施用。
45.一种特异性结合和抑制IL-IRl或IL-Ia的抗体，其用于治疗由于病毒或细菌感染造成的COPD恶化。
全文摘要
本公开涉及用白细胞介素1受体1(IL-1R1)或IL-1α的抗体和拮抗剂治疗慢性阻塞性肺病(COPD)恶化的方法。
文档编号A61K39/395GK102985100SQ201180019387
公开日2013年3月20日 申请日期2011年4月18日 优先权日2010年4月16日
发明者D·芬奇, A·科伊尔, M·施藤普夫利 申请人:米迪缪尼有限公司, 麦克马斯特大学