专利名称：创伤治疗的乳铁蛋白序列、组合物及方法
技术领域：
本发明涉及包含乳铁蛋白或其片段的药用组合物，以及它们在创伤，特别是角膜创伤的治疗中的用途。
背景技术：
角膜是眼睛的透明前部，覆盖瞳孔、虹膜以及前房。角膜的重要功能之一是通过将光线折射到晶状体以及视网膜上来维持正常视力。人类的角膜由五层组成，其中角膜上皮是最前面一层并且形成了角膜的表面。上皮层主要是细胞的，由称作角质化细胞的细胞组成。该层充当防止，例如，微生物侵入更深的、更易受伤害的结构的物理屏障。基质在上皮下面并且主要由胶原组成。它还包含称作角膜细胞的其他细胞，这些细胞会在基质创伤愈合中有作用。角膜通过将光线折射到晶状体以及视网膜上来维持正常视力的能力部分取决于角膜上皮经受连续更新的能力。上皮更新是必需的，因为它使得这该组织能够充当保护角膜内部不被有害环境因素感染的屏障。更新过程也维持了角膜的光滑光学表面。更新率通过角膜上皮的增殖、分化以及细胞死亡过程之间的综合平衡严密维持。角膜上皮的损害可能由佩戴接触镜期间的异物(例如，沙子和砂砾)、微生物刺激或化学刺激或由外科手术引起。大多数角膜上皮创伤迅速愈合。然而，在一些病例中，例如化学伤害，角膜上皮的愈合被延迟，使得下面的基质易受感染和溃疡伤害。此外，眼睛不能维持正常的水合作用，导致降低视力的浑浊。碱损伤特别受关注，并导致特征为嗜中性细胞快速渗入角膜内的急性炎症，随后是慢性炎症，慢性炎症涉及炎症细胞经延长期的迁移与聚集，并进一步损伤角膜表面。在严重的病例中，这导致 角膜溃疡、穿孔、瘢痕形成以及永久性失明。迅速的角膜愈合对维持角膜上皮完整性以及保护视力很重要。天然的上皮的创伤愈合似乎取决于不同细胞组分的一种复杂的相互作用，这些细胞组分通过相互作用的信号分子网协作。这些分子中的许多，被称作生长因子，在角膜创伤愈合中起重要作用。表皮生长因子(EGF)，角质化细胞生长因子以及血小板源生长因子(PDGF)是已知的刺激角膜创伤愈合的一些生长因子。还已经发现在角膜碱烧伤之后的早期，上皮再生强烈地诱导白细胞介素(IL)-1a以及IL-6，表明它们可能在角膜上皮的再生中起作用。乳铁蛋白是一种80-kDa的糖蛋白，其立体结构已经通过X射线结晶学分析确定。该蛋白由一条单个多肽链组成，该多肽链折叠为两个球状域。这些域被定义为N-小叶(N-1obe)和C-小叶(C-1obe),对应于该蛋白的氨基(N-1obe)端半段和羧基(C-1obe)端半段。每个小叶包含一个铁-结合位点。乳铁蛋白具有多个功能，包括炎症减少、免疫应答调制以及抗细菌活性。它是在许多物种中发现的一种蛋白，并且因此反映了一些种间序列变
巳高山(Takayama)等人(负责促进人成纤维细胞的胶原凝胶收缩活性的牛乳铁蛋白区域，《生物化学和生物物理研究通讯》(The bovine lactoferrin regionresponsible for promoting the collagen gel contractile activity of humanfibroblasts, Biochem Biophys Res Commun2002; 299:813-817))通过人成纤维细胞检验了牛乳铁蛋白的N-小叶和C-小叶促进胶原凝胶收缩的能力。美国专利号7，524，814涉及一种包括整个乳铁蛋白或N-端乳铁蛋白变体的组合物，其中至少该N-端甘胺酸残基被截短或被取代，用作一种用于创伤愈合的治疗。仍存在对可以借助实用剂量(S卩，每单位质量足够有效的一个剂量)来刺激角膜上皮创伤修复的无刺激组合物的需要。本说明书中对任何现有技术的提及不是并且不应当视为承认或以任何形式暗示这种现有技术形成在澳大利亚或任何其他管辖权的公知常识的部分或者可以合理地预期这项现有技术由本领域技术人员确认、理解和视为相关的。发明概述本发明涉及一种治疗角膜创伤的方法，它包括将包括有效量的多肽或肽模拟物(包括乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体)的药用组合物给予对其有需要的受试者。本发明还涉及一种药用组合物，包括一个有效量的主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的 多肽或肽模拟物。在一个实施方案中，该乳铁蛋白是牛乳铁蛋白。在一个实施方案中，该肽或肽模拟物由或主要由乳铁蛋白的C-小叶组成。在本说明书中，“主要由…组成”意思是，对肽或肽模拟物而言，如通过下文描述的方法测定，基本上具有与牛乳铁蛋白的C-小叶相同活性的任何长度的氨基酸序列，并且其与C-小叶序列具有至少60%的同一性。如在下文说明的，N-小叶以及整个乳铁蛋白具有与C-小叶不同的活性并且因此“主要由”乳铁蛋白的C-小叶“组成”的肽或肽模拟物不包括整个乳铁蛋白。合宜地，可以通过下文描述的细胞增殖和/或迁移测定来常规地测定，确定一条氨基酸序列是否基本上具有与牛乳铁蛋白的C-小叶相同的活性。在一个实施方案中，通过整个乳铁蛋白的蛋白水解作用获得C-小叶。优选地，该蛋白酶是胰蛋白酶。在一个实施方案中，该乳铁蛋白是牛乳铁蛋白。任选地，其获得自牛奶。在另一个实施方案中，该受试者是人类患者。在一个实施方案中，该受试者具有，或者疑似具有角膜上皮创伤或损伤。这可以从另一种损伤或多种损伤中分离出或除另一种损伤或多种损伤外。在一个另外的实施方案中，该角膜创伤是一种上皮的角膜创伤。在仍一个另外的实施方案中，该上皮的角膜创伤是一种碱诱导的创伤。本发明还涉及包含乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体的药用组合物。在一个实施方案中，该药用组合物处于一种适合向眼睛给药的形式。优选地，该药用组合物是水溶液。将该药用组合物局部给药。本发明还涉及一种治疗角膜创伤的方法，包括给药一个治疗有效量的包括乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体的多肽或肽模拟物。本发明还涉及一个治疗有效量的包括乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体的多肽或肽模拟物用于治疗角膜创伤的用途。本发明还涉及一个治疗有效量的包含乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体的多肽或肽模拟物用于制造用于治疗角膜创伤的药剂的用途。
在一个实施方案中，当在治疗角膜创伤的方法中使用时，本发明提供了一种包括乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体的肽或肽模拟物。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗角膜创伤的药用组合物，包括作为一种活性成分的、主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟物。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗角膜创伤的药用组合物，包括一种主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟物作为主要成分。本发明还涉及一种治疗角膜创伤的方法，包括给药一个治疗有效量的主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟物。本发明还涉及一个治疗有效量的主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟物用于治疗角膜创伤的用途。本发明还包括这种多肽或肽模拟物用于制造用于治疗角膜创伤的药剂的用途。本发明还涉及一种治疗角膜创伤的方法，包括以下步骤鉴别具有角膜创伤的受试者；并且给药包括一个有效量的主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟物的一种药用组合物，或者
给药一个治疗有效量的、主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟物。本发明还涉及一种加速角膜创伤闭合的方法，包括向需要其的受试者给药包括一个有效量的主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟物的一种药用组合物，或者一个治疗有效量的、主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟物。在其他实施方案中，提供了用于上述的本发明的方法中的试剂盒，该试剂盒包括容纳本发明的肽、肽模拟物或药用组合物的容器；以及—个带有书面使用说明的标签或包装插入物。优选地，该书面说明描述了该试剂盒在本发明的方法或用途中的使用。在其他实施方案中，当在上述的本发明的方法中使用时，提供了一个试剂盒，该试剂盒包括容纳本发明的肽、肽模拟物或药用组合物的容器；以及一个带有书面使用说明的标签或包装插入物。优选地，该书面说明描述了该试剂盒在本发明的方法或用途中的使用。在某些实施方案中，该试剂盒可以包含用于治疗角膜创伤的一种或多种另外的活性要素或成分。附图简要说明
图1. SEQ ID号I (在登录号P24627-1，序列版本2下，从Swiss-Prot数据库可公开获得)。图2.基本角膜解剖(用苏木精和伊红染色)，示出上皮，上皮是最前面的一层，形成了角膜的外表面。图3.与BSA对照相比，用12. 8 ii M牛乳铁蛋白天然的(BLF);不含铁(a-BLF);铁饱和的(h-BLF);用TFMS去糖基化的(BLF TFMS);暴露于兼性离子去污剂2%CHAPS (BLFCHAPS);暴露于离液剂6M Gdn-HCl (BLF Gdn-HCl);还原的并烷基化的；以及LFcin B肽孵化24小时后碱诱导的HCLE创伤的相对闭合。数据代表平均值+SD(n=8)。*与天然的BLF相比，无统计学上的显著差异(P>0.1)。#与天然的BLF相比，统计学上显著减少(p〈0. 001)。图4. BLF的化学去糖基化是通过7. 5%SDS_PAGE在非还原条件下确认的，并且对其用考马斯R-250染色。(A)天然的BLF ； (B)用TMSF孵化30分钟的BLF。图5.来自丝氨酸蛋白酶亲和层析柱的部分(A) BLF注入到柱中；(B)蛋白标准；(C)未结合部分；以及(D)洗脱部分。在还原条件下在12%的SDS-PAGE上可见，并且用考马斯R-250染色。图6.通过 0.1 ii M 的、用 I ii M PMSF 处理过的 p_BLF、BLF、N_ 小叶、C-小叶、np-BLF以及BLF的丝氨酸蛋白酶底物30 ii M Z-Phe-Arg-AMC水解的速率。数据代表平均值+SD.(对p-BLF而言，n=3 ;对BLF、N-小叶、C-小叶、np-BLF以及BLF而言，n=6)。*与p_BLF相t匕，统计学上显著差异(P〈0. 005)。#与天然的BLF相比，统计学上显著差异(p〈0. 05)。图7.通过ImM PMSF，在具有或不具有丝氨酸蛋白酶抑制作用下，在12. 6 ii M以及252 ii M天然的BLF (分为非蛋 白水解的(np-BLF)以及蛋白水解的(p_BLF)部分)存在下，碱诱导的HCLE创伤的闭合。数据代表平均值+SD (n=8)。*与PMSF处理的相比，统计学上显著差异(P〈0. 001)。#与PMSF处理的相比，统计学上显著差异(p〈0. 005)。与l/20a浓度相比，统计学上显著差异(P〈0. 001 )。图8.来自胰蛋白酶消化以及BLF N-小叶和C-小叶纯化的部分(A)蛋白标准；(B)胰蛋白酶消化4小时的BLF; (C)从“B，，中通过阳离子交换以及尺寸排阻色谱法纯化的C-小叶；(D)BLF; (E)胰蛋白酶消化0.5小时的BLF; (F、G、H)分别为从“E”的尺寸排阻色谱法的多个峰中分离出的BLF、部分消化的C-小叶、以及N-小叶。在还原条件下在12%的SDS-PAGE上可见，并且用考马斯R-250染色。图9.在 1.28、6.4、12.8、64 以及 128iiM 浓度处，用天然的 BLF、BLF N-小叶、BLFC-小叶以及BSA处理的碱诱导的HCLE创伤的闭合。数据代表平均值+SD(n=8)。*与等摩尔的天然BLF (p〈0. 05)以及BLF N-小叶(p〈0. 001)相比，统计学上显著增加。#与等摩尔的天然BLF相比，统计学上显著减少(p〈0. 005 )。与等摩尔的BSA相比，统计学上显著减少(p〈0. 05)。图10.在豚鼠眼睛内，用64 U M BLF, N-小叶、C-小叶或PBS (载体)处理的、表示为创伤平均直径土标准差的清创术创伤的闭合。用25 UL剂量给药，对于头24小时，每3个小时一次，并且然后一天3次，直至创伤闭合。~C-小叶创伤小于N-小叶处理的创伤(p〈0. 04)。#C-小叶创伤小于PBS处理的创伤(p〈0. 005)。*C-小叶创伤小于BLF处理的创伤(p=0. 02)。图11.在豚鼠眼睛内，用64iiM BLF、N-小叶、C-小叶或PBS (载体)处理的、表示为创伤平均直径土标准差的碱创伤的闭合。用25 y L剂量给药，对于头8小时，每I小时一次，并且然后一天3次，直至创伤闭合。#C-小叶创伤显著小于载体处理的创伤(p=0. 013)。图12.人类角膜缘上皮细胞在添加有1.28、6.4、12.8、64以及12811|1浓度的牛血清白蛋白(BSA)、牛乳铁蛋白(BLF)、N-小叶亦或C-小叶的介质(M)中的增殖。在0、8、16以及24小时孵化后,通过CyQuant进行测量。对所有的组，n=8。#与等摩尔的BSA相比，更小的增殖(P〈0. 001)。*与等摩尔的BSA相比，更大的增殖(p〈0. 05)。图13.当用ImM羟基脲抑制增殖时，在添加有1. 28,6. 4、12. 8、64以及128 y M浓度的牛血清白蛋白(BSA)、牛乳铁蛋白(BLF)、N-小叶亦或C-小叶的介质(M)中，人类角膜缘上皮细胞通过迁移的创伤闭合。对所有的组，ri=8。在去除迁移障碍0、8、16以及24小时之后，进行测量。*与等摩尔的BSA相比，更大的迁移(p〈0. 05)。#与等摩尔的BSA相比，更小的迁移(P〈0. 001)。实施方案的详细说明现在将详细地参照本发明的某些实施方案。尽管将结合实施方案描述本发明，但将应理解，不旨在将本发明不局限于那些实施方案。相反，本发明意在覆盖全部替代形式、修改、和等同物，它们可以被包括在如权利要求书所定义的本发明范围内。本领域技术人员将认识到，与在此所述的那些相似或等同的许多方法和材料，它们可以用于本发明的实践。本发明无论如何不局限于所述的方法和材料。 术语“乳铁蛋白的C-小叶”是指乳铁蛋白的C-端小叶。如以上讨论的，该蛋白由一条单个多肽链组成，该多肽链折叠为两个球状域。这些域被定义为N-小叶(N-1obe)和C-小叶(C-1obe)，对应于该蛋白的氨基(N-1obe)端半段和羧基(C-1obe)端半段。每个小叶包含一个铁-结合位点。已经示出，乳铁蛋白为约690个氨基酸长，其中C-小叶对应于约氨基酸364 (至少对于牛乳铁蛋白)至C-末端(例如，氨基酸690)的氨基酸序列。C-小叶的N-端可以位于氨基酸364，或者在该位置的两到三个氨基酸内(例如，氨基酸361至氨基酸366)。在一个实施方案中，C-小叶的氨基酸序列是在图1中给出的那个(定义为SEQID号I)。本发明延伸至乳铁蛋白的所有公开序列以及它们包含的C-小叶序列。在一个优选实施方案中，C-小叶衍生自牛乳铁蛋白并且具有根据SEQ ID号1的序列。如在此所述，本发明还包括变体，例如物种变体或多态变体，包括如在下文描述的一个氨基酸序列，其中在括号中的这些()氨基酸的任何一个或多个代替其前面的氨基酸。YTRVVWCAVGPEEQKKCQQWSQQSGQNVTCATASTTDDCIVLVLKGEADALNLDGGYI(V)YTAGKCGLVPVLAENRKS(T)SKH(Y)SSLDCVLRPTEGYLAVAVVK(R)KANEGLTffNSLKDKKSCHTAVDRTAGffNIPMGLIVNQTGSCAFDEFFSQSCAPGA(R)DPKSRLCALCA⑶DQGLDKCVPNSKEKYYGYTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGESTADWAKNLNREDFRLLCLDGTRKPVTEAQSCHLAVAPNHAVVSRSDRAAHVKQVLLH(R)QQALFGKNGKNCPDKFCLFKSETKNLLFNDNTECLAKLGGRPTYEEYLGTEYVTAIANLKKCSTSPLLEACAFLTR术语“多肽”或“多肽链”是指氨基酸的一个聚合物，通常通过酰胺键连接在一起。氨基酸功能上的活性聚合物通常被称作“蛋白”。存在着乳铁蛋白的多个同种型，并且因此组成乳铁蛋白的氨基酸的确切数量将变化。因此，C-小叶在该蛋白中的确切位置也将变化。本发明旨在覆盖展现出如通过下文描述的方法测定的相同活性的C-小叶的所有功能上的活性片段以及变体。这还包括C-小叶的apo-以及holo-形式、翻译后修饰的形式、连同糖基化的或去糖基化的衍生物。C-小叶可以任选地包括在整个乳铁蛋白的C-小叶与N-小叶之间存在的叶间区或其一部分。叶间区可以具有乳铁蛋白的任何同种型或物种变体的序列。与乳铁蛋白的C-小叶的多肽序列片段或变体相关的术语“功能上活性的”意思是，通过，例如，被施加到的要治疗的创伤上，如通过下文描述的方法测定，能够愈合角膜创伤的片段或变体(例如，类似物、衍生物或突变体)。此类变体包括天然发生的变体以及非天然发生的变体。考虑到了这些氨基酸的一个或多个的添加、缺失、取代以及衍生，只要这些修饰不导致该片段或变体的功能活性丧失。通过缩短氨基酸序列，例如，使用一种肽链外切酶或者通过合成更短长度的氨基酸序列，可以容易地确定功能上的活性片段，并且然后例如通过在以下实例中说明的方法，对任何创伤愈合活性进行测试。在无天然变体发生的情况下，可以将该片段称作肽模拟物，肽模拟物也在本发明的范围内。例如，合成的氨基酸以及它们的类似物可以替代如在以下方法中测定、提供创伤的愈合活性的这些天然氨基酸的一个或多个。“肽模拟物”是一种合成的化学化合物，其基本上具有本发明的肽的相同的结构和/或功能特征，在此进一步描述后者。典型地，肽模拟物具有与本发明的肽相同或相似的结构，例如，与乳铁蛋白的C-小叶相同或相似的序列。肽模拟物总体上包含至少一个非天然合成的残基。肽模拟化合物的非天然组分可以根据以下项一个或多个a)除天然酰胺键(“肽键”)连接之外的残基连锁群；b)非天然的残基代替天然发生的氨基酸残基；或()诱导二级结构拟态的残基，即，用以诱导或稳定二级结构，例如，P转角、Y转角、P片层、a螺旋构象、等。使用在科学以及专利文献中(例如，《有机合成集合卷》，吉尔曼等人，约翰.威利父子出版公司，纽约(Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman etal. (eds) John ffiley&Sons, Inc. , NY)；欧贝迪；《分子生物技术》(al-Obeidi ;MolBiotechnol 1998;9:205-223);赫鲁比《化学生物学新见》(Hruby Curr Opin ChemBiol 1997; 1: 114-119);奥斯特加德《分子多样性》(Ostergaard Mol Diversl997; 3:17-27)；奥斯德士《酶学方法》(Ostresh Methods Enzymoll996; 267:220-234))描述的多种步骤和方法学可以合成肽模拟物。优选地，功能上的活性片段具有30、40、50、60、70、80、90或更大的氨基酸长度。优选地，该功能上的活性片段或变体具有该片段或变体对应的SEQ ID号I的有关部分的至少约60%同一性，更优选至少约65%、70%、75%、80%或85%同一性，甚至更优选90%同一性，甚至更优选至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。该功能上的活性片段或变体可以对应于，或者具有与来自乳铁蛋白的C-小叶的连续的氨基酸序列的同一性，然而，还考虑至IJ，一个功能上的活性片段对 应于，或者具有与空间上聚集在乳铁蛋白的C-小叶的立体结构中的氨基酸序列的同一性。此类功能上的活性片段与变体包括，例如，具有保守的氨基酸置换的那些。本领域的那些技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括实现对进行比较的序列的全长的最大比对所需要的任何算法(下述非限制性实例)。当比对氨基酸序列时，给出的氨基酸序列A与(to、with或against)给出的氨基酸序列B(可以可替代地被表述为给出的氨基酸序列A具有或包括与(to、with或against)给出的氨基酸序列B的某一百分数的氨基酸序列同一性)的百分数氨基酸序列同一性可以被计算为百分数氨基酸序列同一性= (X/Y)xlOO，其中，X是通过A与B的序列比对程序的或算法的比对，被打分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且Y是B中的氨基酸残基的总数。如果氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不等，则A对B的百分数氨基酸序列同一性将不等于B对于A的百分数氨基酸序列同一性。在计算百分数同一性中，计数确切的匹配。两个序列之间的百分数同一性的确定可以通过使用数学算法来完成。用于两个序列的比较的一种数学算法的一个非限制性的实例是卡尔林和阿尔丘尔《美国国家科学院院刊》(Karlin and Altschul Proc Natl AcadSci 1990USA;87:2264)的算法，该算法被修改为卡尔林和阿尔丘尔《美国国家科学院院刊》(Karlin and Altschul Proc Natl Acad Sci USA1993;90:5873-5877)。这样一种算法被结合到阿尔丘尔等人，《分子生物学杂志》(Altschul et al. J MoI Bioll990; 215:403)的BLASTN以及BLASTX程序中。为了获得用于比较目标的有缺口的比对，可以利用如在阿尔丘尔等人，《核酸研究》(Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Res25:3389)中所述的有缺口的BLAST (BLAST2. 0中)。可替代地，可以将PS1-Blast用于进行检测两个分子之间的距离关系的迭代检索。参看阿尔丘尔等人(Altschul et al. (1997))，同上。在一个优选实施方案中，利用BLAST、有缺口的BLAST以及PS1-Blast程序，使用各自程序的默认参数(例如，BLASTX以及BLASTN)。还可以通过检查，手动进行比对。用于序列比较的一种数学算法的另一个非限制性的实例是ClustalW算法(希金斯等人,《核酸研究》(Higgins et al. NucleicAcids Resl994; 22:4673-4680))。ClustalW比较多个序列并且将全部的氨基酸或DNA序列对齐，并且因此可以提供关于全部氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法被用在若干可商购的DNA/氨基酸分析软件包中，例如，Vector NTI程序套装的ALIGNX模块(Invitrogen 公司，加利福尼亚州，卡尔斯巴德(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA))。用ClustalW进行氨基酸序列比对之后，可以估算出百分数氨基酸同一性。对于ClustalW比对的分析有用的一个软件程序的非限制性实例是GENED0C 或JalView (htp://www.jalview. org/)。GENED0C 允许评估多个蛋白之间的氨基酸(或DNA)相似性以及同一性。用于序列比较的一种数学算法的另一个非限制性的 实例是梅耶斯和米勒的算法(algorithmof Myers and Miller) (CABI0S1988; 4:11-17)。这样一种算法被结合到 ALIGN 程序(2.0版)中，该程序是GCG威斯康辛州遗传学软件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage), 10版(得自美国，力口利福尼亚州,圣迭戈，斯克兰顿路9685的Accelrys公司(Accelrys, Inc. , 9685Scranton Rd. , San Diego, CA, USA))的一部分。在一个优选实施方案中，当估算百分比同一性时，利用被用于比较氨基酸序列的ALIGN程序，PAM120权重残基表、12的缺口长度罚分以及4的缺口罚分。术语“保守的氨基酸置换”是指一个氨基酸被另一个相同类别的氨基酸置换，这些类别如下非极性的Ala、Val、Leu、lie、Pro、MetPhe> Trp极性不带电荷的Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln酸性的Asp、Glu碱性的Lys、Arg、His其他保守的氨基酸置换还可以如以下组成芳香族的Phe、Tyr、His质子供体Asn、Gin、Lys、Arg、His、Trp质子接受体Glu、Asp、Thr>Ser> Tyr> Asn、Gln术语“治疗”(treating或treatment)是指向受试者给药一个治疗有效量的、包括该肽或肽模拟物(如，乳铁蛋白的C-小叶)的组合物，使得该受试者被治疗的病症(例如，角膜创伤)有所改善。将认识到，该治疗可以改善该病症，但是可能不会提供对该病症的完全治愈。该药用组合物可以包括乳铁蛋白的C-小叶、或它的一种或多种功能活性片段或变体。术语“受试者”是指向其给药一种包含乳铁蛋白的C-小叶的组合物的任何动物。在一个优选实施方案中，该受试者是有创伤的人类患者。该创伤优选是一种角膜创伤，并且在一个实施方案中，是一种角膜上皮创伤。虽然本发明发现了人类中的应用，但是本发明对于兽用目的也是有用的。如在此所述，本发明对于治疗家畜(例如牛、绵羊、马以及家禽);宠物(例如猫和狗)；以及动物园动物的创伤是有用的。术语“治疗有效量”或“有效量”是指导致该疾病或病症的一个或多个症状改善或恢复的肽或肽模拟物的量。术语“创伤”是指由于疾病或紊乱或者由于事故、偶然事件或外科手术(例如，LASIK或PRK)引起的一种损伤，例如溃疡或病损。例如，该创伤可以是由角膜与异物(例如，沙子)接触导致的一种磨损。该创伤可以是由于碱损伤，即碱诱导的创伤或任何其他化学烧伤引起的一种角膜创伤(确切地，包括具有或不具有与其他创伤或损伤一起的角膜上皮创伤)。溃疡可以是有传染性的、炎性的或自身免疫源性的。病损可以是一种不愈合角膜病损。该创伤还可能是由于干眼病引起的。术语“药用组合物”是指包括肽或肽模拟物(如，乳铁蛋白的C-小叶)的组合物，该组合物被分散在一种药学上可接受的载体中。该药用组合物可以包括乳铁蛋白的C-小叶或它的一种或多种功能活性片段或变体。该组合物可以进一步包括一种或多种额外的赋形剂，如，稀释剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、粘合剂、填充剂，以及类似物。可任选地，它可以包括一个有效量的其他的药学上的活性组分。例如，还可以包括一种抗生素，如喹诺酮家族的一个成员或氨基糖甙与￠-内酰胺的一个组合。其他抗生素包括但不局限于，氯霉素、四环素类并且还可以使用大环内酯类。此外，该组合物可以包括一种或多种抗炎剂，这个或这些抗炎剂可以是甾体的 或非甾体的抗炎剂。本发明的药用组合物还可以仅包含乳铁蛋白的C-小叶(S卩，主要由其组成)。可替代地，本发明包括一种药用组合物，该药用组合物包含与任何其他肽、肽模拟物和/或其他活性成分相比，一个更大浓度的一种主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的肽或肽模拟物。如在此使用，除非上下文另外要求，否则术语“包括”和该术语的变体，如“包括着”(comprising)、“包括了”(comprises)和“被包括”(comprised)不意在排除其他添加物、组分、整数或步骤。本发明治疗角膜创伤，并且涉及向受试者给药一种包括有效量的肽或肽模拟物(例如乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体)的药用组合物。本发明具体涉及角膜创伤的治疗。具体地，本发明考虑的角膜创伤的类型是上皮的角膜创伤。这些创伤可能是由于，例如，化学损伤，如由眼睛暴露于碱性试剂导致的(即，碱诱导的创伤)或外科的酒精清创术引起的。碱诱导的创伤可以，例如，由于眼睛意外暴露于碱性液体、肥料、石膏以及水泥粉、家用清洁产品(特别是含氨的那些)、排水沟清洁产品、烘箱清洁剂以及类似物而发生的。本发明还协助将病原体进入角膜中最小化。
碱暴露导致上皮细胞死亡、基质胶原变性并且危害角膜，以及使眼睛内部被异物与病原入侵。碱诱导的创伤特征为升高的炎症应答以及阻碍的创伤愈合，这将延长在其间可以发生威胁视力的次级并发症(例如，微生物感染)的危险期。一些损伤还可以导致上皮溃疡的复发、慢性基质溃疡、深度基质新生血管形成、结膜过度生长、或者甚至角膜穿孔。可以用本发明的肽或肽模拟物或者通过本发明的方法或用途治疗的其他角膜创伤是由清创术、磨损、刮伤或任何其他磨蚀损伤引起的创伤。这些创伤通常被认为是非炎性创伤。本发明的诸位申请人已经发现，乳铁蛋白的C-小叶能够比乳铁蛋白的N-小叶亦或天然的(即，整个)乳铁蛋白更有效地增加创伤闭合速率。由天然乳铁蛋白促进角膜不同部分愈合、角膜基质创伤愈合先前已经被归因于其刺激成纤维细胞增殖(致使细胞外基质的合成)。相比之下，本发明涉及不包含成纤维细胞的角膜上皮创伤的治疗。不希望受任何理论或行动模式的约束，本发明的诸位申请人提出乳铁蛋白的C-小叶通过促进上皮细胞迁移跨越眼表并且上调不同细胞因子以及生长因子(例如，IL-6以及roGF)的表达，来增加上皮创伤闭合的速率。图2示出了基本的角膜解剖。上皮是最前面的一层，形成了角膜的外表面。该层主要是细胞的(由角质化细胞组成)。基质在上皮下面并且包含角膜细胞。它大部分由胶原组成。角膜细胞形成了在由非常细的分支相连的胶原层之间的松散连接的网络，并且占基质的约10%。角膜上皮细胞(角质化细胞)的迁移发生在纤连蛋白的临时基质(provisionalmatrix)、粘连的胞外糖蛋白上，后两者出现在角膜上皮创伤部位处的基质的暴露面上。已经示出，纤连蛋白的表达在损伤之后增加，并且某些生长因子能够增强纤连蛋白对细胞迁移的效应。在上皮创伤愈合的病 例中，提出这些生长因子通过天然乳铁蛋白的上调可以被归因于它与不同受体(如，在创伤愈合以及TOGF-信号通路中涉及的那些)的相互作用。再次，不希望受任何理论或行动模式的约束，与N-小叶以及天然乳铁蛋白相比，C-小叶的增加的效力可能是由于空间因子、更大的底物亲和力或来自N-小叶的抑制效应。例如,将C-小叶从N-小叶的不必要的40kDa上释放，可以减少这些肽在具体靶结合位点的空间干扰，由此促进创伤愈合。可替代地，乳铁蛋白N-端附近的阳离子精氨酸对普遍存在的阴离子底物(例如，硫酸化的氨基聚糖)的吸引将减少可用于结合靶的乳铁蛋白，用于促进创伤愈合。最后，与创伤闭合温和地拮抗的活性(例如，蛋白水解活性)可以存在于N-小叶的肽上。本发明还涉及一种加速角膜创伤闭合的方法，包括向对其有需要的受试者给药一种药用组合物，该组合物包括一个有效量的多肽或肽模拟物(包括乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体)，或一个治疗有效量的多肽或肽模拟物(包括乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体)。与未治疗的创伤和/或用完整的乳铁蛋白治疗的创伤相比，用本发明的肽或肽模拟物治疗的创伤的闭合被加速。角膜创伤的加速闭合有利于防止对角膜的额外伤害，和/或最小化感染或溃疡的风险。此外，加速创伤闭合导致视觉功能的快速分辨。本领域的技术人员将理解的是，乳铁蛋白的C-小叶可以通过技术人员已知的任何合适的方法获得，这些方法包括但不局限于重组技术，使用遗传工程的从头合成和/或化学合成技术；从天然来源(例如，哺乳动物的奶)中分离、纯化并蛋白水解；以及购买自商业来源。以此方式，可以纯化、分离、重组或合成C-小叶。
在一个优选实施方案中，通过将天然来源的、重组的或可商购的乳铁蛋白蛋白水解为N-小叶和C-小叶来获得C-小叶。优选地,使用的蛋白酶是胰蛋白酶。然后可以使用任何数量的、技术人员已知的技术将N-小叶和C-小叶彼此分开，这些技术例如，色谱法。阳离子交换以及尺寸排阻色谱法都是合适的方法。存在于本发明的药用组合物中的肽或肽模拟物(例如C-小叶)的浓度可以是，例如，在10至70iiM之间。本发明的药用组合物可以是一种眼用组合物，它是一种适合向眼睛给药或应用于眼睛的组合物。根据本发明的眼用组合物的实例是悬浮液、软膏、持续释放的配制品(包括当负载到接触镜或其他生物材料中时)、凝胶或适合用作滴眼剂的溶液。优选地，根据本发明的药用组合物将被配制为用于局部给药或者用于持续释放递送。优选地，本发明的组合物处于一种适合向眼睛给药的形式。基于配制容易连同受试者借助滴入一至两滴的该溶液到病眼中，从而容易地给药此类组合物的能力，总体上优选水性溶液。然而，该组合物还可以是悬浮液、粘性的或半粘性的凝胶或者其他类型的固体或半固体组合物，或者适用于持续释放的那些。该药用组合物可以是一种眼部润滑剂，例如人工泪液配制品，或接触镜溶液。多种载体中的任一种都可以被用在本发明的组合物中，包括水，水和水可混溶溶剂的混合物，该水可混溶溶剂例如C1至C7链烷醇类、包括从0. 5%至5%的无毒的水溶性聚合物的植物油或矿物油、凝胶产品(例如明胶、藻酸盐、果胶、黄蓍胶、梧桐胶、黄胞胶、角叉菜胶、琼脂以及阿拉伯胶，以及它们的衍生物)、淀粉衍生物(例如淀粉乙酸酯以及羟丙基淀粉)、纤维素及其衍生物，并且还 有其他的合成产物(例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、聚乙烯基甲基醚、聚氧化乙烯，优选交联的聚丙烯酸，例如中性聚羰乙烯或那些聚合物的混合物)、天然发生的磷脂(例如，卵磷脂)、或烯基氧化物与脂肪酸的缩合物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合物(例如，十七烷亚乙基氧基鲸蜡醇)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯类的缩合物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯类的缩合物(例如，聚乙烯山梨醇单油酸酯)。通过添加水，适合制备水性悬浮液的可分散粉以及颗粒提供了与分散剂或湿润齐U、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂通过上文已经提及的那些进行举例说明。根据本发明的组合物可以包括至少一种胶凝剂。适用于药用组合物的胶凝剂是本领域那些普通技术人员熟知的，并且包括，例如，黄原胶及其衍生物，卡波姆及其衍生物，基于丙烯酸酯的共聚物以及交联聚合物，聚丙烯酸钠及其衍生物，纤维素及其衍生物，以及淀粉和琼脂以及它们的衍生物。根据本发明的胶凝剂的选择在提供透明凝胶(Clear gel)中是重要的。添加到该组合物中的胶凝剂的量可以轻易地由本领域的一个普通技术人员用最少的实验来确定，并且将取决于本领域的普那些技术人员已知的因素，例如胶凝剂的特性以及药用组合物的希望的特性。可以包括在本发明的药用组合物中的额外成分包括张度增强剂、防腐剂、增溶剂、稳定剂、无毒的赋形剂、缓和剂、掩蔽剂、pH调节剂、共溶剂以及粘度助剂。对于pH调节，优选地对于生理学pH调节，缓冲剂会尤其有用。本溶液的pH应当保持在4至8，优选6至7. 5之间的范围内。本领域的普通技术人员将理解的是，与眼表相容的任何PH都是合适的。可以添加合适的缓冲剂，例如硼酸、硼酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸、碳酸氢钠、TRIS、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)以及不同的混合的磷酸盐缓冲剂(包括Na2HP04、NaH2P04以及KH2PO4的组合)以及它们的混合物。通常，在浓缩中将使用的缓冲剂的范围是从约0. 05至0. 5M。如果需要的话，典型地通过张度增强剂来调节张度。此类试剂可以是，例如，离子和/或非离子型的。离子张度增强剂的实例是碱金属或土金属卤化物，例如像CaCl2、KBr,KCl、LiCl、Na1、NaBr或NaCUNa2SO4或硼酸。非离子张度增强剂是，例如，脲、甘油、山梨醇、甘露醇、丙二醇、或右旋糖。典型地用张度剂将本发明的水性溶液调节至接近正常泪液的渗透压。在某些实施方案中，本发明的这些组合物额外包括一种防腐剂。防腐剂可以典型地选自季胺类化合物，例如氯化苄烷铵(N-苄基-N- (C8-C18烷基)-N. N- 二甲基氯化铵)、苯佐氯铵或类似物。不同于季铵盐的防腐剂的实例是硫代水杨酸的烷基汞盐，例如像，硫柳汞、硝酸苯汞、乙酸苯汞或硼酸苯汞，过硼酸钠，亚氯酸钠，对羟苯甲酸酯，例如像，对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯，苯甲酸钠，水杨酸，醇类，例如像，三氯叔丁醇、苯甲醇或苯乙醇，胍基衍生物，例如像，氯己定或聚六亚甲基双胍，过硼酸钠，Germafjc或山梨酸。优选的防腐剂是季胺类化合物，特别是氯化苄烷铵或其衍生物，例如多季胺聚合物(Polyquad)(参见，美国专利号4，407，791)、烷基汞盐以及对羟基苯甲酸酯。在适当情况下，添加足够量的防腐剂到该眼用组合物中，从而确保对使用期间由细菌和真菌引起的继发性污染的保护。在其他实施方案中，本发明的这些组合物不包括防腐剂。此类配制品对于佩戴接触镜的受试者会特别有用。本发明的组合物可能额外要求存在一种增溶剂，特别是如果该活性的或非活性的成分倾向于形成一种悬浮液或乳液。适合上文有关的组合物的增溶剂是，例如，选自下组，该组由以下项组成泰洛沙泊、脂肪酸甘油聚乙二醇酯、脂肪酸聚乙二醇酯、聚乙二醇、甘油醚、环糊精(例如a-、￠-或Y-环糊精，例如，烷基化的、羟烷基化的、羧基烷基化的或烷氧基羰基-烷基化的衍生物，或单-或二糖基-a-、￠-或Y-环糊精，单-或二麦芽糖基或Y-环糊精或潘糖残基( panosyl)-环糊精)、聚山梨醇20、聚山梨酯80或那些化合物的混合物。一种尤其优选的增溶剂的特定实例是蓖麻油与环氧乙烷的反应产物，例如，商业产品Cremophor EU*+或Cremophor RH408。已经证明蓖麻油与环氧乙烧的反应产物是眼睛极好地耐受的特别好的增溶剂。另一种优选的增溶剂选自泰洛沙泊并且选自环糊精。使用的浓度尤其取决于活性成分的浓度。添加的量典型地足以溶解该活性成分。这些组合物可以进一步包括无毒的赋形剂，例如像，乳化剂，湿润剂或填充剂，例如像，指定的聚乙二醇200、300、400和600，或指定的碳蜡1000、1500、4000、6000和10000。添加的赋形剂的量以及类型是根据具体要求，并且本领域普通技术人员将理解的是，可以存在于一种组合物中的赋形剂以及其他添加剂的类型以及量，使得该组合物与眼睛相容。还可以添加其他的化合物到本发明的组合物中，从而增加载体的粘性。粘度增强剂的实例包括但不局限于多糖(如透明质酸)及其盐，硫酸软骨素及其盐，葡聚糖，纤维素族的不同聚合物；乙烯基聚合物；以及丙烯酸聚合物。本发明的示例性的眼用溶液包括本发明的肽或肽模拟物、氯化钠、马来酸二钠、氯化苄烷铵、氢氧化钠、盐酸、无菌纯净水以及具有约7. 45的生理pH或者在眼部舒适范围内的PH的溶液。为了最大舒适度，眼用溶液应当具有与泪液相同的pH或者该溶液的pH应当位于眼部舒适范围内，即PH6. 6至7. 8之间。可替代地，该溶液可以包括本发明的肽或肽模拟物、氯化钠、磷酸二氢钠二水合物、氯化苄烷铵、氢氧化钠、盐酸、无菌纯净水以及具有如上文讨论的PH的溶液。一种示例性的眼用溶液是
权利要求
1.一种药用组合物，包括一个有效量的主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟物。
2.根据权利要求1所述的一种药用组合物，其中该乳铁蛋白是牛乳铁蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的一种药用组合物，其中该多肽或肽模拟物主要由SEQID号1中示出的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的一种药用组合物，其中该多肽或肽模拟物由乳铁蛋白的C-小叶组成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的一种药用组合物，其中该功能活性片段是具有大于30个氨基酸序列长度并且与SEQ ID号I的连续序列具有大于65%的同一性的多肽或肽模拟物。
6.根据权利要求1或2所述的一种药用组合物，其中该C-小叶通过整个乳铁蛋白的蛋白水解获得。
7.根据前述权利要求中任一项所述的一种药用组合物，它处于一个适合向眼部给药的形式。
8.根据前述权利要求中任一项所述的一种药用组合物，它是一种水溶液。
9.根据前述权利要求中任一项所述的一种药用组合物，其中该组合物处于滴眼剂的形式。
10.一种治疗角膜创伤的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予根据前述权利要求中任一项所述的一种药用组合物。
11.根据权利要求10所述的一种方法，其中该受试者是一个人类患者。
12.根据权利要求10或11所述的一种方法，其中该角膜创伤是一种上皮的角膜创伤。
13.根据权利要求12所述的一种方法，其中该上皮的角膜创伤是一种碱诱导的创伤。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的一种方法，其中该受试者已经被鉴定为具有一种角膜创伤。
全文摘要
本发明涉及包含乳铁蛋白或其片段的药用组合物以及它们在创伤，特别是角膜创伤的治疗中的用途。本发明还提供了一种药用组合物，包括一个有效量的主要由乳铁蛋白的C-小叶或其功能活性片段或变体组成的多肽或肽模拟物。
文档编号A61K38/40GK103037894SQ201180037142
公开日2013年4月10日 申请日期2011年7月1日 优先权日2010年7月1日
发明者本杰明·大卫·阿什比, 齐安·加勒特, 马克·威尔科克斯 申请人:华柏恩视觉研究中心