用于稳定含有蛋白质的制剂的含有烷基糖苷的组合物和方法

专利名称：用于稳定含有蛋白质的制剂的含有烷基糖苷的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及某些烷基糖苷组合物用于防止抗体和其他蛋白质在其治疗上有用的制剂中聚集和氧化的用途。
背景技术：
当需要蛋白制剂的稳定剂来保护蛋白质免于在摇动、搅动、剪切和冷冻-融化时变性或者保护其在界面处于静息状态时，通常使用非离子去污剂(即表面活性剂)(参见例如美国专利号5，183，746)。这由在许多含有蛋白质的产品中使用聚山梨酯所例`示。例如，在生物治疗产品的制剂中使用聚山梨酯20和80 (Tween 20和Tween 80),用于防止表面吸附并用作防止蛋白质聚集的稳定剂(Kerwin, J. Pharm. Sc1. 97 (8)2924-2936 (2008)) o聚山梨酯是由聚氧乙烯(POE)脱水山梨糖醇的脂肪酸酯构成的两性非离子型表面活性剂，对于聚山梨酯20，是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，并且对于聚山梨酯80，是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。然而，不幸地是，聚山梨酯可通过氧化或水解而发生降解。当聚山梨酯分子降解时，其产生不同的降解副产物，包括例如脂肪酸、POE脱水山梨糖醇、PEG、PEG酯和烷基酸。这些聚山梨酯降解副产物中的某些(包括游离脂肪酸)可引起含有蛋白质的制剂的浊度升高和蛋白质聚集。因此，虽然通常将聚山梨酯用作蛋白质稳定剂，但是随时间推移由聚山梨酯降解释放的脂肪酸和其他降解副产物可能不利地影响聚山梨酯在含有蛋白质的制剂中显示的保护作用。在纯化和贮存期间，蛋白质发生不同程度的降解，其中氧化(包括光诱导的氧化)是主要降解途径之一，其对蛋白质稳定性和效力具有破坏作用。氧化反应引起氨基酸残基的破坏、肽键的水解，从而由于蛋白质三级结构的变化和蛋白质聚集导致蛋白质的不稳定性(Davies, J. Biol. Chem. 262 :9895-901 (1987))。Nguyen (蛋白质和肽制剂和递送中的第 4 章(Chapter4in Formulation and Delivery of Protein and Peptides)(1994)) > Hovorka(J. Pharm Sc1. 90 :25369 (2001))和 Li (Biotech Bioengineering48 490-500 (1995))已经综述了蛋白质药物的氧化。根据上述，显然需要鉴定可用于提高含有蛋白质的制剂中的蛋白质的稳定性和防止含有蛋白质的制剂中的蛋白质的聚集和/或氧化的组合物。发明简沭本发明是基于如下新发现某些烷基糖苷组合物可用于稳定和/或降低治疗上有用的制剂中的抗体或其他蛋白质的聚集或免疫原性。此外，本发明还基于如下新发现某些烷基糖苷组合物可用于防止治疗上有用的制剂中的抗体或其他蛋白质上的氨基酸残基特别是色氨酸残基的氧化。更尤其是，本发明的一个方面涉及使用具有至少1. OmM临界胶束浓度(CMC)值的烷基糖苷类作为蛋白质稳定剂或作为降低蛋白质聚集的物质的方法。在本发明的某些实施方案中，以低于其各自CMC值的浓度，在含有抗体或其他蛋白质的制剂中使用烷基糖苷组合物。因此,一方面,本发明涉及含有蛋白质和烧基糖苷的物质组合物(composition ofmatter)，所述烷基糖苷在25oC下、在水中具有大约1. OmM或更大的CMC值。在一些实施方案中，存在于物质组合物中的蛋白质是抗体，其可以任选地是单克隆抗体。在其他实施方案中，烷基糖苷选自正己基-P -D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-P -D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-0 -D-吡喃葡萄糖苷、正壬基-P -D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-P -D-吡喃葡萄糖苷、3-环己基_1_丙基_ P _D_匍萄糖昔、3_环己基-1- 丁基_ P _D_匍萄糖昔、正己基_ P -D-卩比喃麦芽糖苷、正辛基-P -D-吡喃麦芽糖苷、正壬基-P -D-吡喃麦芽糖苷、正癸基-P -D-吡喃麦芽糖苷、环己基-甲基-P -D-麦芽糖苷、2-环己基-乙基-P -D-麦芽糖苷、3-环己基-丙基-0 -D-麦芽糖昔、4_环己基_ 丁基_ P -D-麦芽糖昔和5_环己基_戍基_ P -D-麦芽糖苷。在其它实施方案中，所述物质组合物含有抑制搅动诱导的聚集的量或者防止氧化的量的烷基糖苷。在另一实施方案中，烷基糖苷以比25°C下水中的烷基糖苷CMC值更低的浓度存在于物质组合物中。所述物质组合物可以是含水的，可以在大约2-8° C温度下稳定至少一年，和/或可以在大约3 0° C的温度下稳定至少一个月。任选地，所述物质组合物不是冻干的并且没有进行预先冻干(prior lyophilization)或者可以是重构的冻干制剂。另一方面，本发明涉及于制品(article of manufacture),该制品包含容纳上述物质组合物的容器。本发明的另一方面涉及制备药物制剂，其包括制备上述的物质组合物和评价所述物质组合物中蛋白质的物理稳定性、化学稳定性或生物活性。本发明的另一方面涉及抑制存在于第一水溶液中的蛋白质的搅动诱导的聚集的方法，其中该方法包括向第一水溶液中加入抑制搅动诱导的聚集的量的烷基糖苷的步骤，所述烷基糖苷在25°C、在水中具有大约1. OmM或更大的CMC值，由此提供第二水溶液。本发明的另一方面涉及防止存在于第一水溶液中的蛋白质氧化的方法，其中该方法包括向第一水溶液中加入抑制氧化的量的烷基糖苷的步骤，所述烷基糖苷在25°C、在水中具有大约1. OmM或更大的CMC值，由此提供第二水溶液。


图1显示某些表面活性剂对水溶液中的抗-MUC16单克隆抗体的搅动诱导的聚集的作用。图2显示某些表面活性剂对水溶液中的抗-MUC16单克隆抗体的搅动诱导的聚集的作用。图3显示某些表面活性剂对水溶液中的抗-MUC16单克隆抗体的搅动诱导的聚集的作用。图4显示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷对含有抗-MUC16单克隆抗体的水溶液的浊度的作用。图5显示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷对维持水溶液中抗-MUC16单克隆抗体的％单体的作用。图6显示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20对含有抗-MUC16单克隆抗体的水溶液的浊度的作用。图7显示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20对含有抗-1gE单克隆抗体的水溶液的浊度的作用。图8显示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20对含有抗-⑶Ila单克隆抗体的水溶液的浊度的作用。图9显示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20对含有抗-⑶22单克隆抗体的水溶液的浊度的作用。图10显示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20对维持水溶液中抗-MUC16单克隆抗体的％单体的作用。

图11显示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20对维持水溶液中抗-1gE单克隆抗体的％单体的作用。图12显示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20对维持水溶液中抗-⑶IIa单克隆抗体的％单体的作用。图13显示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20对维持水溶液中抗-⑶22单克隆抗体的％单体的作用。图14显示随时间推移由溶液中的各种烷基糖苷或聚山梨酯20产生的过氧化氢的量。图15显示各种烷基糖苷或聚山梨酯20对防止水溶液中抗-⑶IIa抗体氧化的作用。图16显示各种烷基糖苷或聚山梨酯20对防止水溶液中抗-⑶22抗体氧化的作用。优选实施方案详述通过参考以下具体实施方案详述以及文中包括的实施例，可以更容易地理解本发明。除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文描述的类似或等价的任意方法和材料均可用于实施或测试本发明，但以下描述了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均在此全文引入本文作为参考。文中，以术语“大约”开始的数值范围或者量明确包括所述确切的范围或者确切数
值的量。抗体和其他蛋白质的聚集主要由最终导致变性的疏水作用引起。当部分或完全展开的蛋白质的疏水区暴露于水中时，由于正常包埋的疏水内部现在暴露于亲水的水性环境中的事实，这造成热力学不利的情形。因此，形成疏水区周围的水分子的熵降低迫使变性的蛋白质聚集，其主要通过暴露的疏水区进行。因此，还可能损害蛋白质的溶解性。在一些情况下，蛋白质亚基的自联(天然的或错误折叠的)可于一些条件下发生，并且其可引起沉淀和活性丧失。影响溶液中蛋白质聚集的因素通常包括蛋白质浓度、pH、温度、其他赋形剂和物理应力。一些因素(例如温度)在纯化、混合、生产、贮存和使用期间比其他因素(例如物理应力)可能更容易控制。制剂研究将指导适当选择不会诱导聚集和/或事实上将有助于防止聚集的PH和赋形剂。蛋白质浓度由需要的治疗剂量决定，并且取决于该浓度是什么，其将决定是否存在更高联合状态(二聚体、四聚体等)的可能性，这可随后引起溶液中的聚集。制剂研发期间，必须进行仔细研究，以确定什么因素影响蛋白质的聚集，然后如何能够消除或控制这些因素。对鉴定用于肠胃外给药或其他给药的抗体或其他蛋白质的稳定溶液制剂的需求能够导致用于评价各种添加剂对物理稳定性的影响的检验方法学的发展。基于影响蛋白质聚集和所述施用需求的已知因素，可利用涉及搅动或旋转蛋白质溶液的机械操作来评价物理稳定性。用于鉴定各种添加剂防止聚集的能力的物理性应力测试方法学可能涉及暴露于在水平面的摇动或搅拌或者在垂直面以n转/min从旋转的轮子的轴转动X cm。通常通过视力检查或者光散射分析作为时间函数来测定聚集导致的浊度。或者，可通过HPLC分析作为时间函数来定量测定由于沉淀引起的可溶蛋白含量的减少。本发明是基于下述新发现某些烷基糖苷组合物可用于稳定和/或降低治疗上有用的制剂中的抗体或其他蛋白质的聚集和免疫原性。此外，本发明还基于下述新发现某些烷基糖苷组合物可用于防止或降低治疗上有用的制剂中的抗体或其他蛋白质的氧化。“表面活性剂”是因为其含有亲水和疏水基团的化学组成而能在固体-固体、固体-液体、液体-液体和液体-空气表面发挥其作用的表面活性物质。这些物质降低稀溶液中的蛋白质在能吸附和潜在聚集蛋白质的空气-水和/或水-固体界面处的浓度。表面活性剂可结合至蛋白质制剂的疏水界面。特别是当搅动时，由于解折叠和随后的蛋白质单层的聚集，水表面的蛋白质将聚集。“表面活性剂”可使蛋白质变性，但是也可稳定蛋白质，免于表面变性。一般来讲，离子型表面活性剂可使蛋白质变性。然而，即使在相对高的浓度(1%W/V)，非离子型表面活性剂通常不使蛋白质变性。大多数双亲 (parentally)可接受的非离子型表面活性剂来自聚山梨酯或聚醚组。聚山梨酯20和80是市售蛋白制剂中的同代的表面活性剂稳定剂。然而，蛋白制剂中所用的其他表面活性剂包括Pluronic F-68和“布里杰(Brij) ”类的成员。这些无一个是本发明的烷基糖苷类。物理事件可致使暴露于化学事件。蛋白质的化学不稳定性可能涉及蛋白质一级结构的共价键的裂解或形成。已报道蛋白质中的数个氧化反应。在碱性或中性媒介中，氨基酸残基半胱氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸尤其易于氧化。然而，在酸性条件中，甲硫氨酸是敏感的。通常，氧化反应引起生物活性的显著丧失甚至免疫原性。暴露于光线可引起蛋白质中氨基酸残基尤其是色氨酸残基的氧化是本领域众所周知的。过氧化物是非离子型表面活性剂的已知污染物。聚山梨酯中的过氧化物可引起蛋白质的氧化降解。制剂设计者(Formulators)往往就过氧化物污染筛选蛋白制剂中的聚山梨酯源和其他多聚体添加剂，并对于使用所述添建立过氧化物规范。或者，对于氧气-敏感的蛋白质，引入抗氧化剂用于帮助克服非离子型表面活性剂作为氧化催化剂的潜力。“表面活性剂”是具有非常明确的极性和非极性区域的分子，所述极性和非极性区域使得它们在溶液中聚集，形成胶束。根据极性区的性质，表面活性剂可是非离子的、阴离子的、阳离子的和两性离子的。非离子型表面活性剂可以是基于糖的。基于糖的表面活性剂可以是烷基糖苷类。如文中所用的，“烷基糖苷”指通过链接(linkage)连接至任何疏水烷基的任何糖，这是本领域所公知的。疏水烷基链和亲水糖类之间的链接可尤其包括糖苷、酯、硫苷、硫酯、醚、酰胺或酰脲键或者链接。文中描述了其示例。文中，术语烷基糖苷和烷基糖可互换使用。本发明的烷基糖苷的通用结构是R1-O-(CH2)x-R,其中R可以是例如CH3、环己基(C6H11)或其它烷基链，包括其异构体，并且R1是糖，典型地是葡萄糖或麦芽糖。示例性烷基糖苷包括下述那些，其中R1是葡萄糖，R是CH3,且X是5 (正己基-0 -D-吡喃葡萄糖苷)，X是6 (正庚基-P -D-吡喃葡萄糖苷)，X是7 (正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷)，X是8 (正壬基-0 -D-吡喃葡萄糖苷)，X是9 (正癸基-P -D-吡喃葡萄糖苷)，并且X是11 (正十二烷基-0 -D-吡喃葡萄糖苷)。有时，将吡喃葡萄糖苷称作葡萄糖苷。示例性烷基糖苷还包括下述那些，其中R1是麦芽糖，R是CH3,且X是5 (正己基-0 -D-卩比喃麦芽糖昔)，X是7 (正羊基_ P -D-卩比喃麦芽糖昔)，X是8 (正壬基_ P -D-批喃麦芽糖苷)，X是9 (正癸基-P -D-吡喃麦芽糖苷)，X是10 ( 烷基-P -D-吡喃麦芽糖苷)，X是11 (正十二烷基-P -D-吡喃麦芽糖苷)，X是12 (正十三烷基-P -D-吡喃麦芽糖苷)，X是13 (正十四烷基 -P -D-吡喃麦芽糖苷和X是15 (正十六烷基-P -D-吡喃麦芽糖苷)。有时，将吡喃麦芽糖苷称作麦芽糖苷。示例性烷基糖苷还包括下述那些，其中R1是葡萄糖，X是3，且R是环己基(3-环己基_1_丙基_D_匍萄糖苷)；和其中R1是麦芽糖，X是4,且R是环己基(4-环己基-1-丁基-P-D-麦芽糖苷)。在本发明的一特定方面，本发明中所用的烷基糖苷是在20-25 °C优选25°C、在水中显示大约1. OmM或更大的临界胶束浓度(CMC)值的那些。下面表I中显示具有所述CMC值的示例性烷基糖苷，其中其它的是本领域众所周知的。轰I烷磨苷CMC 值(mM) CMC 值(w/v) 正己基-P-D-吡喃葡萄糖苷250 mM6.6% w/v 正庚基-P-D-吡喃葡萄糖苷70 mM1.9% w/v
正辛基-P-D-吡喃葡萄糖苷18 inM0.53%、v/、
正壬基-P-D-吡喃葡萄糖苷6.5 mM0.2% w/v
正癸基-P-D-吡喃葡萄糖苷2.2 inM0.07% w/v
3-环己基-1-丙基-[5-D-葡萄糖苷28 mM0.86% w/v
3-环己基-1-丁基-[5-D-葡萄糖苷1.8 mM0.058% w/v
正己基-P-D-吡喃麦芽糖苷210 mM8.9% w/v正辛基-P-D-吡喃麦芽糖苷丨9.5mM0.89% w/v 正壬基-P-丨)-吡喃麦芽糖苷6 mM0.28% w/v 正癸基-P-D-吡喃麦芽糖苷丨.8 mM0.087% w/v 环己基-甲基-P-D-麦芽糖苷340 mM15% w/v
2-环己基-乙基-P-D-麦芽糖苷120 mM5.4% w/v
3-环己基-丙基-(3-D-麦芽糖苷34.5 mM1.6% w/v
4-环己基-丁基-P-D-麦芽糖苷7.6 mM0.37% w/v
5-环己基-戌基-(3-D-麦芽糖苷2.4 mM0.12% w/v正十二烷基-P-D-吡喃麦芽糖苷0.17 mM0.0087 w/v正十二燒基-P-D-吡喃葡萄糖苷0.19 mM0.0066 w/v
特定的烷基糖苷可单独用作抗体或其它蛋白质的稳定剂(或降低聚集的物质或降低氧化的物质)，或者可将其与其它烷基糖苷联合使用。发现在水溶液的宽浓度范围内烷基糖苷作为抗体或其它蛋白质的稳定剂(或降低聚集的物质或降低氧化的物质)的用途。在本发明的特定实施方案中，烷基糖苷(如果作为单一物质使用)或者烷基糖苷类(如果联合使用)可以以大约0. OOlmM至大约500mM、更优选大约0. 005mM至大约400mM、更优选大约0. OlmM至大约300mM、更优选大约0. 02mM至大约250mM、更优选大约0. 03mM至大约200mM、更优选大约0. 05mM至大约100mM、更优选大约0.1mM至大约100mM、更优选大约0.1mM至大约50mM的浓度存在于含有抗体或其它蛋白质的水性制剂中。在本发明的一特别优选的实施方案中，可将特定的烷基糖苷以比其各自CMC值低的浓度用作抗体或其它蛋白质的稳定剂(或降低聚集的物质或降低氧化的物质)。根据上述，在本领域可理解的是，文中描述的化合物例如烷基糖苷类的化学合成产生有些非均一的化合物混合物而不是完全均质的制备物。如此，当文中描述使用一具体的烷基糖苷时，应该理解所述定义指从其化学合成得到的非均一混合物的主要成分。
“多肽”或“蛋白质”是指其链长足以产生较高水平的三级结构和/或四级结构的氨基酸序列。因此，蛋白质区别于也是基于氨基酸的分子但没有此类结构的“肽”。通常，本文所使用的蛋白质具有至少约5-20kD、或者至少约15-20kD、优选至少约20kD的分子量。“肽”是指通常不展现出较高水平的三级结构和/或四级结构的氨基酸序列。肽通常具有少于约5kD的分子量。包括在本文定义之内的多肽的实例包括哺乳动物蛋白质，例如，肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；a -1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；滤泡刺激激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管性血友病因子(vonffiIlebrands factor);抗凝血因子如蛋白质C ;心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或者人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA);铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-a和-P ;脑啡肽酶；RANTES(活化正常T细胞表达和分泌的调节因子(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted));人巨嗤细胞炎性蛋白(MIP-l-a);血清白蛋白如人血清白蛋白；穆勒氏(Muellerian)抑制物；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原(prorelaxin);鼠促性腺素关连肽；微生物蛋白，诸如P -内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶(DNase) ；IgE ;细胞毒T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4 ;抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子的受体；蛋白质A或D ;类风湿因子；神经营养因子如骨衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或_6(NT_3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGN-P ;血小板衍生生长因子(I3DGF);成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF ;表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF)如TGF-a和TGF-3，包括 TGF-31、TGF-P 2、TGF-P 3、TGF-P 4 或 TGF-P 5 ;胰岛素样生长因子-1 和-1I (IGF-1和IGF-1I) ;des (1-3)-1GF-1 (脑IGF-1);胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs) ;CD蛋白，如 CD3、CD4、CD8、CD19 和 CD20 ;促红细胞生长素；骨诱导因子(osteoinductive factors)；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BM`P);干扰素，如干扰素-a、-P和-Y ;集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF ;白细胞介素(IL)，如IL-1至IL-10 ;超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS外膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，如⑶11a、⑶lib、⑶11c、⑶18、ICAM、VLA-4和VCAM ;肿瘤相关抗原，如CA125 (卵巢癌抗原)或HER2、HER3或HER4受体；免疫粘附素；以及上述任何蛋白的片段和/或变体，以及与上述任何蛋白结合的抗体包括抗体片段。被配制的蛋白质优选是基本上纯的，以及最好基本上是同质的(即没有污染蛋白)。“基本上纯的”蛋白质意指以组合物的总重量计包含至少约90%(重量)蛋白质、优选至少约95%(重量)蛋白质的组合物。“基本上同质”的蛋白质意指以组合物的总重量计，包含至少约99%(重量)的蛋白质的组合物。在某些实施方案中，所述蛋白质是抗体。本文的抗体针对所关注的“抗原”。优选的，所述抗原是生物学上重要的蛋白质，并且施用所述抗体至罹患疾病或病症的哺乳动物可在该哺乳动物中产生治疗益处。然而，也还考虑针对非蛋白抗原(如肿瘤相关糖脂抗原，参见美国专利5，091，178)的抗体。当抗原是蛋白质时，其可以是跨膜分子(例如受体)，或配体，如生长因子。示例性的抗原包括上文讨论的那些蛋白质。本发明包括的抗体的优选分子靶标包括⑶多肽，如⑶3、⑶4、⑶8、⑶19、⑶20和⑶34 ；HER受体家族的成员，如EGF受体(HERl)、HER2、HER3 或 HER4 受体；细胞粘附分子，如 LFA_l、Macl、pl50、95、VLA-4、ICAM-UVCAM和av/b3整联蛋白，包括它的a或b亚基(如，抗-⑶11a、抗-⑶18或抗⑶Ilb抗体)；生长因子如VEGF ；IgE ;血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA_4 ;多肽C等。可溶抗原或其片段(任选与其它分子缀合的)可用作免疫原用于产生抗体。对于跨膜分子，诸如受体，则它们的片段(例如，受体的细胞外结构域)可用作免疫原。或者，表达所述跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可衍生自天然来源(例如，癌细胞系)或可以是通过重组技术进行转化以表达所述跨膜分子的细胞。本文中 被纯化的抗体的实例包括但不限于HER2抗体，包括曲妥珠单抗(HERCEPTIN : ) (Carter 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 89:4285-4289 (1992)，美
国专利号5，725，856)以及培妥珠单抗(OMNITARG ) (W001/00245) ；CD20抗体(参见下面)；IL-8 抗体(St John 等，Chest, 103:932(1993)，以及国际公开号 TO95/23865)；VEGF或VEGF受体抗体，包括人源化和/或亲和力成熟的VEGF抗体，如人源化VEGF抗体huA4. 6.1 贝伐珠单抗(AVASTIN :)和雷珠单抗(LUCENTIS ) (Kim 等，GrowthFactors, 7:53-64(1992)，国际公开号 W096/30046,以及 W098/45331,1998 年 10 月 15日公开)；PSCA抗体(W001/40309) ;CDlla抗体，包括依法珠单抗(:RAPTIVA )(美国专利号 6，037，454，美国专利号 5，622，700，W098/23761, Stoppa 等，TransplantIntl. 4:3-7 (1991)，以及 Hourmant 等,Transplantation58:377-380 (1994))；与 IgE 结合的抗体，包括奥马佐单抗(XOLAIR ) (Presta 等，J.1mmunol. 151:2623-2632 (1993),以及国际公开号W095/19181 ;1998年2月3日授权的美国专利号5，714，338，或1992年2月25日授权的美国专利号5，091，313，1993年3月4日公开的TO93/04173，或1998年6月30日提交的国际申请号？(17^598/13410，美国专利号5，714，338) ;CD18抗体(1997年4月22日授权的美国专利号5，622,700，或1997年7月31日公开的W097/26912) ;Apo_2受体抗体抗体(1998年11月19日公开的W098/51793);组织因子(TF)抗体(1994年11月9日授权的欧洲专利号0 420 937 BI) ;a4-a7整联蛋白抗体(1998年2月19日公开
的TO98/06248) ；EGFR抗体(例如，嵌合或人源化225抗体，西妥昔单抗，ERBUTIX ，在1996年12月19日公开的W096/40210中);CD3抗体，诸如0KT3(1985年5月7日授权的美国专利号4，515，893) ;CD25或Tac抗体，诸如CH1-621 ( SIMLiLECT )和
ZENAPAX (参见1997年12月2日授权的美国专利号5，693，762) ;CD4抗体，诸如 cM-7412 抗体(Choy 等,Arthritis Rheum39(l) :52-56(1996)) ；CD52 抗体，诸如CAMPATH-1H(ILEX/Berlex)(Riechmann 等,Nature332:323-337 (1988)) ；Fc 受体抗体，诸如 M22 抗体，其针对 Fe YRI 如在 Graziano 等，J.1mmunol. 155(10) :4996-5002(1995)中)；癌胚抗原(CEA)抗体，诸如 hMN-14 (Sharkey 等,Cancer Res. 55 (23Suppl) : 5935s-5945s (1995));针对乳腺上皮细胞的抗体，包括 huBrE_3、hu_Mc3 和 CHL6 (Ceriani等，Cancer Res. 55 (23) : 5852s-5856s (1995)；以及 Richman 等，Cancer Res. 55 (23Supp) :5916s-5920s (1995));与结肠癌细胞结合的抗体，诸如 C242 (Litton等，Eur J.1mmunol. 26(1) : 1-9(1996)) ；CD38 抗体，例如 AH3/5 (Ellis 等，J.1mmunol. 155(2) :925-937(1995)) ;CD33 抗体，诸如 Hu M195 (Jurcic 等，Cancer Res55(23Suppl):5908s-5910s (1995))以及 CMA-676 或 CDP771 ;EpCAM 抗体，诸如17-1A( PANOREX ) ；Gpiib/nia 抗体，诸如阿昔单抗或 C7E3Fab ( REOPRO )；RSV 抗体，诸如 MED1-493 ( SYNAGIS ；) ；CMV 抗体，诸如 PROTOVIR ；
HIV抗体，诸如PR0542 ;肝炎抗体，诸如H印B抗体OSTAVIR ;CA125抗体，包括抗-MUC16(W02007/001851;Yin,BffT 和 Lloyd, KO, J. Biol. Chem. 276:27371-27375(2001))以及OvaRex ;个体基因型⑶3表位抗体BEC2 ; a v 0 3抗体(例如，VITAXIN ;Medimmune);人肾细胞癌抗体，诸如 ch_G250 ;ING_1 ;抗-人 17-lAn 抗体(3622W94)；抗-人结肠直肠肿瘤抗体(A33);针对GD3神经节苷脂的抗-人黑色素瘤抗体R24;抗-人鳞状细胞癌(SF-25);人白细胞抗原(HLA)抗体，诸如Smart IDlO和抗-HLA DR抗体 Oncolym(Lym-1) ；CD37 抗体，诸如 TRU016 (Trubion) ;IL_21 抗体(Zymogenetics/Novo Nordisk);抗-B 细胞抗体(Impheron) ;B 细胞革巴向的 MAb (Immunogen/Aventis)；1D09C3(Morphosys/GPC) ；LymphoRadl31(HGS) ；Lym-1 抗体，诸如 Lym-1Y-90(USC)或抗-Lym-1OncoIym(USC/Peregrine) ；LIF226 (Enhanced Lifesc1.) ；BAFF 抗体(例如，W003/33658) ；BAFF受体抗体(例如参见，W002/24909) ；BR3抗体；Blys 抗体，诸如贝利木单抗(belimumab) ；LYMPHOSTAT-B ；ISF154 (UCSD/Roche/Tragen);戈利昔单抗(gomilixima) (Idecl52;Biogen Idee) ;IL_6 受体抗体，诸如atlizumab (ACTEMRA ; Ch ugai/Roche) ;IL_15 抗体，诸如 HuMax-1l-15 (Genmab/Amgen)；趋化因子受体抗体，诸如CCR2抗体(例如，MLN1202; Mi I Iieneum);抗-补体抗体，诸如C5抗体(例如，依库珠单抗(eculizumab)，5G1.1; Alexion);人免疫球蛋白的口服制剂(例如，IgPO;Protein Therapeutics) ;IL_12 抗体，诸如 ABT-874(CAT/Abbott)；替萘昔单抗(Teneliximab) (BMS-224818;BMS) ;CD40抗体，包括S2C6及其人源化变体(W000/75348)和 TNXlOO (Chiron/Tanox) ；TNF- a 抗体，包括 cA2 或英夫利昔单抗(REM1CADE )、CDP571、MAK-195、阿达木单抗(HUMIRA )，PEG 化 TNF- a 抗体片段，诸如0^-870(0611七6吐)，02￡7(1(11011)，抗-1,-0 多克隆抗体(例如，PassTNF; Verigen)；CD22抗体，诸如LL2或依帕珠单抗(LYMPHOC丨DE ; Immunomedics),包括依帕珠单抗Y-90和依帕珠单抗1-131, Abiogen，s CD22抗体(Abiogen, Italy)，CMC544(ffyeth/Celltech), combotox(UT Soutwestern), BL22(NIH),以及 LympoScanTc99(Immunomedics)。⑶20抗体的实例包括“C2B8”，其现在称为“利妥昔单抗”(“RITUXAN ，，)(美国专利号5，736，137);钇-[90]-标记的2B8鼠抗体，称为“Y2B8”或“替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan) ”( ZEVALIN )，可从 IDEC Pharmaceuticals, Inc.商业获得(美国专利号5，736，137 ;1993年6月22日在ATCC以登录号HB11388保藏的2B8)；鼠IgG2a “BI”，也称为“托西莫单抗”，任选地用131I标记，以产生“1311-B1”或“碘1131托西莫单抗”抗体(BEXXAR )，其可从Corixa商业获得(也参见美国专利号5，595，721)；鼠单克隆抗体“1F5” (Press等，Blood69(2) :584-591(1987))及其变体，包括“框架修补(framework patched)，，或人源化 1F5 (W02003/002607, Leung, S. ; ATCC 保藏 HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗体(美国专利号5，677，180);人源化2H7 (W02004/056312, Lowman等)；2F2 (HuMax-⑶20)，其为完全的人高亲和抗体，靶向B细胞细胞膜中的⑶20分子(Genmab, Denmark;例如 参见，Glennie and van de ffinkel, Drug DiscoveryToday8:503-510 (2003)以及 Cragg 等，BloodlOl:1045-1052 (2003) ；W02004/035607 ；US2004/0167319) ;W02004/035607 和 US2004/0167319 中所示的人单克隆抗体(Teeling等)；US2004/0093621中描述的具有与Fe区域结合的复杂N-糖苷连接的糖链的抗体(Shitara等)；与CD20结合的单克隆抗体或抗原结合片段(W02005/000901，Tedder等)，诸如HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11 ；CD20结合分子，诸如AME系列抗体，例如 W02004/103404 和 US2005/0025764 中所示的 AME33 抗体(Watkins 等，Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME) ;CD20 结合分子,诸如 US2005/0025764 (Watkins 等)中描述的那些；A20抗体或其变体，诸如嵌合或人源化A20抗体(分别为cA20、hA20)或IMMU-106 (US2003/0219433, Immunomedics) ;CD20-结合抗体，包括去除表位的 Leu_16、lH4或 2B8,任选地与 IL-2 缀合，如在 US2005/0069545A1 和 W02005/16969 (Carr 等)中的那样；与CD22和CD20结合的双特异性抗体，例如hLL2xhA20(W02005/14618，Chang等);可从 International Leukocyte Typing Workshop 获得的单克隆抗体 L27、G28_2、93_1B3、B-Cl 或 NU-B2 (Valentine 等，In:Leukocyte Typing III (McMichael,编辑，p. 440，OxfordUniversity Press(1987)) ; 1H4(Haisma 等，Blood92:184(1998));抗 _CD20auristatin E缀合物(Seattle Genetics);抗-CD20-1L2 (EMD/Biovation/City of Hope);抗-CD2OMAb治疗(EpiCyte);抗-CD20 抗体 TRUO15 (Trubion)。本文使用的术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fe区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、双抗体(diabodies)和单链分子，以及抗体片段(例如，Fab、F(ab，)jFv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可与“抗体”互换地使用。基本的4链抗体单位是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重⑶链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单位与另外的称为J链的多肽组成，并且包含10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个基本的4链单位，其中所述的基本的4链单位能与J链一起聚合形成多价的集聚物(assemblages)。对于IgG来说,4链单位一般约为150，000道尔顿。每条L链通过`一个共价二硫键与H链相连，而两条H链取决于H链同种型通过一个或多个二硫键相互连接。每条H和L链也具有有规则地间隔的链内二硫键。每条H链在N-末端具有可变域(Vh)，对于a和Y链各自继之以三个恒定域(Ch)、对于ii和e同种型继之以四个Ch域。每条L链在N-末端具有可变域(')，在另一个末端继之以恒定域。Vl与Vh相对应(align)，而Q与重链的第一个恒定域(ChI)相对应。认为特殊的氨基酸残基形成轻链和重链可变域之间的界面。Vh和\的配对一同形成了单一抗原结合位点。对于不同类型的抗体的结构和性质，参见例如，Basic and Clinical Immunology, 8thEdition, Daniel P. Sties, Abba1.Terr and Tristram G. Parsolw(eds), Appleton &Lange, Norwalk, Conn. , 1994,第 71 页和第 6 章。来自任何脊椎动物物种的L链可以根据它们恒定域的氨基酸序列被分为两种明显不同类型中的一种，称为K和X。取决于它们的重链恒定域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分为不同的类型或同种型。有五类免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,分别具有被命名为a、S、e、Y和ii的重链。根据CH的序列和功能方面的相对小的差异，Y和a类被进一步分成亚类，例如，人类表达以下的亚类IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。术语“可变”是指在抗体之间可变域的某些片段在序列上有很大差异的事实。V结构域介导抗原结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在整个可变域中不是均匀分布的。而是，V区由被极度可变的称为“高变区”或有时称为“互补决定区”(CDR)的较短区域(每个长度约9-12个氨基酸残基)分隔的相对不变的区域组成，该相对不变的区域被称为框架区(FR)，具有约15-30个氨基酸残基。天然重链和轻链的可变域各自都包含四个FR，大多采取3 -折叠构型，通过三个高变区连接，高变区形成环形连接，有些情况下形成￠-折叠结构的部分。每条链中的高变区通过FR紧密邻近地保持在一起，并且与来自另一链的高变区一同，促成抗体的抗原结合位点的形成(见Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。恒定域没有直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出各种效应子作用，诸如参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。当在本文中使用时，术语“高变区”(也称为“互补决定区”或⑶R)是指位于免疫球蛋白V区结构域内的抗体氨基酸残基(通常为三个或四个极度序列可变性的短区域)，其形成抗原结合位点，并且是抗原特异性主要决定因素。有至少两种方法来鉴定⑶R残基(I)基于跨物种(cross-species)序列可变性的方法(即，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute ofHealth, Bethesda, MS1991);和(2)基于抗原抗体复合物的结晶学研究的方法(Chothia, C.等，J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。然而，就两种残基鉴定技术确定重叠的区域而不是相同的区域而言，可以组合它们来确定杂混(hybrid)CDR。本文所用的术语“单克隆抗体”指的是从一群基本上均一的抗体中获得的抗体，SP除了可能少量存在的可能发生的天然突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)夕卜，群体中包含的个体抗体是相同的。单克隆抗体对单一的抗原位点有高度的特异性。而且，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了特异性外，单克隆抗体的优点是它们是用杂交瘤培养来合成的，不被其它免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆”指明从基本上均一的抗体种群中获得的抗体的特征，不应被理解为需要任何特定的方法来生产抗体。例如，本发明所用的单克隆抗体可用首先在Kohler等，Nature, 256:495 (1975)中描述的杂交瘤方法来制备,或可用重组DNA方法来制备(见美国专利号4，816，567)。“单克隆抗体”也可用例如Clackson等，Nature, 352:624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol.，222:581-597(1991)描述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，该“嵌合”抗体中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，还包括该抗体的片段，只要它们显示出期望的生物学活性(美国专利号 4，816，567 ；Mor rison 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 81:6851-6855 (1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化(primitized)”的抗体，其包含来源于非人灵长类动物(例如，旧大陆猴(Old World Monkey)、猿(Ape)等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链结构域C0U Ch2和CH3的抗体。恒定域可以是天然序列的恒定域(例如，人类天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子作用。“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利号 5，641，870，实施例 2 ;Zapata 等，Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 [1995]);单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及残余的“Fe”片段，该命名反映易于结晶的能力。Fab片段由完整的L链以及H链的可变区结构域(Vh)和一条重链的第一个恒定域(ChI)组成。每个Fab片段对于抗原结合是单价的，SP它具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab’)2片段，其大略地相应于具有不同抗原结合活性的两个二硫化物连接的Fab片段，并仍能够交联抗原。Fab’片段与Fab片段的不同在于其在ChI结构域的羧基末端具有几个额外的残基，包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指其中恒定域的半胱氨酸残基携带有游离硫醇基的Fab’。F(ab’)2抗体片段最初作为Fab’片段的成对物而产生,其在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。Fe片段包含由二硫 键连接的两个H链的羧基末端部分。抗体的效应子作用由Fe区的序列决定，该区也是在某些类型的细胞上发现的被Fe受体(FcR)识别的区域。“Fv”是含有完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密地非共价连接的一个重链可变域与一个轻链可变域的二聚体组成。这些两个结构域的折叠产生6个高变环(H和L链各3个环)，其提供用于抗原结合的氨基酸残基，并且对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或仅含有3个抗原特异性CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管与完整的结合位点相比其亲和力较低。“单链Fv”也可简写成“sFv”或“scFv”，其为包括连接进单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽在Vh和\结构域之间还包含多肽连接体,其能使sFv形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述见Pluckthun在《单克隆抗体的药理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》，第 Il3 卷，Rosenburg 和 Moore 编，Springer-Verlag, New York,第 269-315 页(1994)。术语“双抗体”是指如下制备的小的抗体片段，用短连接体(约5-10)残基)在Vh和\结构域之间构建sFv片段(参见前段)，因而获得链间而不是链内的V结构域对而制得，从而得到二价的片段，即，具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉(crossover) ” sFv片段的异二聚体，其中所述两个抗体的Vh和\结构域存在于不同的多肽链上。双抗体在例如 EP404, 097 ；W093/11161 ;Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sc1.USA90:6444-6448 (1993)中有更详细的描述。“特异性结合”特定多肽或特定多肽上的表位的抗体或者对特定多肽或特定多肽上的表位“是特异性”的抗体是与该特定多肽或特定多肽上的表位结合而基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合的抗体。术语“固相”描述了本发明的抗体可以附着在上面的非水的基质。本文包括的固相的实例包括部分地或全部由玻璃(例如，可控孔度玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮(silicones)形成的那些固相。在某些实施方案中，取决于具体情况，固相可以包括分析板的孔；在其它实施方案中，其是纯化柱(例如，亲和色谱柱)。这个术语还包括离散微粒的不连续固相，例如在美国专利号4，275，149中描述的那些。非-人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是主要人序列的嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’ )2或抗体的其它抗原结合子序列(subsequences)),它们包含最小的来源于非人免疫球蛋白的序列。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者高变区(也称CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和性能的小鼠、大鼠或兔等非人物种(供体抗体)的高变区残基所替代。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应的非人类残基所替代。此外，文中所用的“人源化抗体”也可包含受者抗体或供者抗体中均不存在的残基。为了进一步改进和优化抗体表观，进行了所述修饰。人源化抗体最理想地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fe)的至少一部分，典型地包含人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。对于进一步的报道，参见Jones等，Nature, 321:522-525(1986);Riechmann等,Nature, 332:323-329 (1988);和 Presta, Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596 (1992)。“物种依赖性抗体(species-dependent antibody) ”,例如哺乳动物抗人IgE抗体，是与对来自第二哺乳动物物种的该抗原的同系物相比，对来自第一哺乳动物物种的抗原具有更强的结合亲和性的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性地结合”人抗原(即，具有不超过约I X 10_7M、或者不超过约I X 10_8M、或者不超过约I X 10_9M的结合亲和性(Kd)值)，但对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原的同系物的结合亲和性比其对所述非人抗原的结合亲和性弱至少约50倍、至少约500倍、或至少约1000倍。物种依赖性抗体可以是如上述定义的各种类型的抗体中的任何一种，但优选是人源化或人抗体。抗体“效应子作用”是指归因于抗体的Fe区(天然序列Fe区或氨基酸序列变体Fe区)并随抗体同种型变化的那些生物学活性。抗体效应子作用的实例包括Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体`结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC是指细胞毒性的形式，其中与某些细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fe受体(FcR)结合的分泌的Ig使得这些细胞毒效应细胞与拥有抗原的靶细胞特异性结合，并随后用细胞毒素杀死靶细胞。该抗体“武装”细胞毒细胞，并且是通过这一机制杀死靶细胞所需要的。介导ADCC作用的主要细胞NK细胞仅表达Fe y RIII，而单核细胞则表达Fe y R1、Fe Y RII和Fe Y RIII。关于造血细胞上Fe表达的总结见Ravetch和Kinet, Annu. Rev.1mmunol. 9:457-92 (1991)的464页上的表3。为了评价目的分子的ADCC活性，可进行体外A⑶D测试法，诸如美国专利号5，500, 362或5，821，337中所述的。对于这类测试法的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，可在体内，例如在Clynes等，PNASUSA95:652-656 (1998)所述的动物模型中，评估目的分子的ADCC活性。“Fe受体”或“FcR”描述与抗体的Fe区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。而且，优选的FcR是结合IgG抗体的FcRU受体)，包括Fe Y R1、Fe Y RII和Fe Y RIII亚类的受体(包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接型)，Fe y RII受体包括Fe y RIIA(“活化受体”)和Fe Y RIIB ( “抑制受体”)，其具有主要区别在于其细胞浆结构域的相似的氨基酸序列。活化受体Fe y RIIA在其细胞浆结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体Fe y RIIB在其细胞浆结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见 M. Daeron, Annu. Rev. Tmmuno1. 15:203-234 (1997)。FcR 的综述见 Ravetch和 Kinet, Annu. Rev. Tmmuno1. 9:457-92(1991) ；CapeI 等,Immunomethods4:25-34 (1994);以及 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)。本文中术语“FcR” 函盖其它 FcR，包括那些在将来将被鉴定的FcR。该术语还包括负责将母体IgG转移到胎儿的新生儿受体FcRn0 Guyer 等,J. Tmmuno1. 117:587 (1976)和 Kim 等,J. Tmmuno1. 24:249 (1994)。“人类效应细胞”是表达一或多种FcR并执行效应子作用的白细胞。优选地，所述细胞表达至少Fe y RIII并执行ADCC效应子作用。介导ADCC的人类白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMC和MNK细胞。所述效应细胞可从其天然来源中分离，例如从血液中分离。“CDC”的“补体依赖性细胞毒性”是指在补体的存在下靶细胞的溶胞。经典补体途径的活化是由补体系统的第一个组分(Clq)与结合它们的相应(cognate)抗原的(适当亚型)抗体的结合而起始的。为了评价补体活化作用，可进行cdC测试,如Gazzano-Santoro等,J. Tmmun01. Methods202:163 (1996)所述的。术语“药物制剂”是指以允许活性成分的生物活性有效的形式存在的制剂，并且其不含对待施用该制剂的受试者具有不能接受的毒性的其它成分。如果抗体的生物活性在给定时间内为制备药物制剂时具有的生物活性的约10%以内(在测试法误差之内)，则抗体在药物制剂中拥有“生物活性”，如通过抗体在体外或体内与抗原结合并导致可测量的生物学反应的能力所确定的那样。“稳定的”制剂是这样的制剂，在贮存期间其中的蛋白质基本上保持它的物理和/或化学稳定性。可以在选定的温度测量选定时段的稳定性。优选地，制剂在室温( 300C )或40°C稳定至少1个月和/或在约2-8°C稳定至少1年，并且优选稳定至少2年。例如，在贮存期间的聚集度可以被用作蛋白质稳定性的指标。因而，“稳定的”制剂可以是这样的制剂，其中少于约10%并优选少于约5%的蛋白在该制剂中以聚集物存在。本领域现有各种测量蛋白质稳定性的分析技术，并且例如在Peptide and Protein DrugDelivery, 247-301, Vincent Lee编辑，Marcel Dekker, Inc. , New York, N. Y. , Pubs. (1991)和 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90(1993)中有综述。提高含有蛋白质制剂的“稳定性”指降低(与未处理的含有蛋白的制剂相比)或防止所述制剂中形成蛋白聚集物。术语“水性溶液”是指其中水是溶解介质或溶剂的溶液。当物质溶解于液体中时，该混合物称为溶液。被溶解的物质是溶质，而进行溶解的液体(该情况中为水)为溶剂。本文使用的术语“稳定剂”是这样的化学物质或化合物，即将其添加至溶液或混合物或混悬液或组合物或治疗组合物中，以使其保持处于稳定状态或不改变的状态；或之所以使用其是因为其产生导致更稳定或不改变的状态的涉及原子或分子的变化的反应。本文使用的术语“聚集”是指大量或完全汇聚或集中在一起，例如肽、多肽、抗体或其变体的聚集。聚集可以是自行聚集或者可以是由于其它因素例如导致聚集的物质、导致沉淀的物质、搅动或者其它致使肽、多肽、抗体或其变体汇聚的手段和方法诱导的聚集。搅动诱导的聚集形成搅动诱导的含有蛋白质的溶液中的聚集物，其中搅动是通过摇动或搅拌而使运动。“易于聚集”的抗体是尤其当搅动时，已观察到与其它抗体分子聚集的抗体。“抑制”搅动诱导的聚集意指防止、减轻或降低搅动诱导的聚集的量，其通过将包含至少一种搅动诱导的聚集的抑制剂的含有蛋白质的溶液中存在的聚集物的量与不含至少一种搅动诱导的聚集的抑制剂的含有蛋白质的溶液中存在的聚集物的量进行比较而测量。烷基糖苷的“抑制搅动诱导的聚集”的量是与不含烷基糖苷的相同处理的蛋白质相比，可检测地抑制搅动诱导的聚集的烷基糖苷的量。本文“氧化的”蛋白质是其中一个或多个氨基酸残基已被氧化的蛋白质。在一些实施方案中，氧化的氨基酸是色氨酸。蛋白质中氨基酸的氧化可由暴露于光线中引起，因此，本文将其称为“光诱导的氧化”。“易于氧化的”蛋白质是含有一个或多个已发现易于氧化的残基的蛋白质。“抑制”或“防止”氧化意指减少或降低氧化的量，其通过将包含至少一种氧化抑制剂的含有蛋白质的溶液中存在的氧化的量与不含至少一种氧化抑制剂的含有蛋白质的溶液中存在的氧化的量进行比较而测量。烷基糖苷的“防止氧化”的量是与不含烷基糖苷而进行相同处理的蛋白质相比，可检测地抑制或减少蛋白质氧化的 该烷基糖苷的量。可找到的用于本发明测量搅动诱导的聚集和/或蛋白质氧化的方法包括凝胶电泳、等电聚焦、毛细管电泳、色谱法(如分子排阻色谱、离子交换色谱和反相高效液相色谱)、肽谱、寡糖谱(oligosaccharide mapping)、质谱、紫外吸收光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法、等温滴定量热法、示差扫描量热法、分析型超速离心、动态光散射、蛋白酶解和交联、池度测量、滤器阻滞(filter retardation)分析、免疫学分析、突光染料结合分析(fluorescent dye binding assays)、蛋白染色分析(protein-staining assays)、显微镜检查法和通过ELISA或其它结合测试检测聚集物。“临界胶束浓度”(CMC)是表面活性剂在溶液中聚集而形成称作胶束的簇的阈值浓度。如文中所用的，任何特定表面活性剂的CMC值在20-25 °C、在水中测量，优选在25°C、在水中测量，并可将其以mM或w/v单位进行表述。因为由组分单体形成胶束涉及平衡，已确定对于胶束存在狭窄的浓度范围，低于该浓度范围，溶液含有可以忽略的量的胶束，并且高于该浓度范围，发现所有另外的(additional)表面活性剂实际上为另外的胶束形式。Mukerjee，P.和MySelS，K.J. (1971)水性表面活性剂体系的临界胶束浓度(Critical Micelle Concentrations of Aqueous Surfactant Systems), NSRDS-NBS36.Superintendent of Documents, U. S. Government Printing Office,Washington, DC 已完成了数百种化合物在水溶液中的CMCs的编辑物。还参见，http: //www. anatrace. com/does/detergentdata. pdf。用于测定CMC的一项普通技术是利用表面张力计直接测量作为表面活性剂浓度函数的平衡表面张力。其它方法包括测量作为表面活性剂浓度函数的散射光强度、荧光染料的增溶等。上述的和其它此类技术是本领域众所周知的，并且是常规使用的。
当用于描述本文公开的各种多肽和抗体时，“分离的”是指已从其产生环境的组分中鉴定、分离和/或收回的多肽或抗体。优选地，分离的多肽没有与来自其产生环境的所有其它组分相缔合(association)。其产生环境中的污染成分(诸如从重组转染细胞中产生的那些)是通常将干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，并可包括酶、激素和其它蛋白质或非-蛋白质溶质。在优选的实施方案中，多肽被纯化至(I)用转杯式序列分析仪，足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或者(2)使用考马斯蓝或优选银染色，达到在非-还原或还原条件下SDS-PAGE同质性的程度。然而，通常用至少一个纯化步骤来制备分离的多肽或抗体。编码本文的多肽和抗体的“分离的”核酸分子是鉴定的并从至少一种污染物核酸分子分离的核酸分子，所述核酸分子通常在其产生的环境中与污染物核酸分子缔合。优选的，所述分离的核酸不与其产生环境相关的所有组分缔合。编码本文多肽和抗体的分离的核酸分子处于与其在自然状态中被发现的形式或环境不同的形式。因此分离的核酸分子不同于天然存在于细胞中的编码本文多肽和抗体的核酸。术语“控制序列”是指在特定的宿主生物中表达可操作(operably)连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适合于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

当一种核酸与另一种核酸序列处于功能相关的位置时，该核酸与该另一种核酸是“可操作相连的”。例如，前序列或分泌前导序列(secretory leader)的DNA与多肽的DNA是可操作相连的，如果其表达为参与该多肽的分泌的前蛋白的话；启动子或增强子与编码序列可操作相连，如果其影响该序列的转录的话；或核糖体结合位点与编码序列可操作相连，如果其位置能促进翻译的话。通常“可操作相连”指被连接的DNA序列是相邻的，而且，在分泌前导序列的情况下，则是相邻的且处于阅读相。然而，增强子不必是相邻的。连接可通过在方便的限制性位点处联接(ligation)而实现。如果不存在这样的位点，可根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或连接体。本文使用的术语“附加表位(epitope tagged) ”是指包含与“标记(tag)多肽”融合的本文描述的多肽或抗体的嵌合多肽。标记多肽具有足够的残基以提供针对其可以产生抗体的表位，而该标记多肽又足够短从而不干扰与其融合的多肽的活性。标记多肽优选还是十分独特的，以致所述抗体基本上不与其它表位交叉反应。适合的标记多肽一般具有至少六个氨基酸残基，且通常约8至50个氨基酸残基(优选的，约10至20个氨基酸残基)。本文中使用的术语“免疫粘附素”是指抗体样分子，其组合了异源蛋白(“粘附素”)的结合特异性和免疫球蛋白恒定域的效应子作用。结构上，免疫粘附素包含具有所需结合特异性的氨基酸序列与免疫球蛋白恒定域序列的融合物，所述具有所需结合特异性的氨基酸序列不同于抗体的抗原识别和结合位点(即为“异源的(heterologous)”)。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以得自任何免疫球蛋白，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。Ig融合物优选包括在Ig分子内的至少一个可变区的位置处用本文描述的多肽或抗体的结构域替代。在特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包括IgGl分子的铰链、CH2和CH3区域；或铰链、CHl、CH2和CH3区域。关于免疫球蛋白融合物的生产还参见1995年6月27日授权的美国专利号5，428，130。
“等渗的”制剂是基本上具有与人类血液相同的渗透压的制剂。等渗的制剂一般具有约250至350m0sm的渗透压。术语“低渗的”描述渗透压低于人类血液渗透压的制剂。相应地，术语“高渗的”用于描述渗透压高于人类血液渗透压的制剂。例如，可以利用蒸气压或冰冻型渗透压计来测量等渗性。由于盐和/或缓冲剂的加入，本发明的制剂是高渗的。“重构的(reconstituted) ”制剂是已经通过将冻干的蛋白或抗体制剂溶解在稀释剂中以使蛋白分散在该重构制剂中而制备的制剂。重构的制剂适合于向需要用目的蛋白治疗的患者施用(例如，肠胃外施用)，在本发明的某些实施方案中，可以是适合于皮下施用的制剂。“可药用酸”包括无机酸和有机酸，在它们被配制的浓度和方式下是无毒的。例如，适合的无机酸包括盐酸、高氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磺酸、亚磺酸、磺胺酸、磷酸、碳酸等等。适合的有机酸包括直链和支链的烷基、芳族的、环状的、环脂肪族的、芳基脂肪族的、杂环的、饱和的、不饱和的、单羧酸、二羧酸和三羧酸，包括例如甲酸、乙酸、2-羟基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、邻氨基苯甲酸、丙酸、2-羟基丙酸、2-氧代丙酸、丙二酸、环戊烷丙酸、环戊烷丙酸、3-苯基丙酸、丁酸、丁二酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、抗坏血酸、肉桂酸、十二烷基硫酸、硬脂酸、粘康酸、扁桃酸、琥拍酸、扑酸(embonic acid)、富马酸、苹果酸、马来酸、轻基马来酸、丙二酸、乳酸、朽1檬酸、酒石酸、乙醇酸、葡萄糖酸(glyconic acid)、葡糖酸(gluconic acid)、丙酮酸、乙醒酸、草酸、甲磺酸、琥拍酸、水杨酸、邻苯二甲酸、palmoic acid> palmeic acid、硫氰酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、萘-2-磺酸、对甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2. 2. 2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、4，4’-亚甲基双-3-(羟基-2-烯-1-甲酸)、羟基萘甲酸。“可药用碱”包括无机碱和有机碱，在它们被配制的浓度和方式下是无毒的。例如，适合的碱包括由形成无机碱的金属例如锂、钠、钾、镁、钙、铵、铁、锌、铜、锰、铝形成的那些碱，N-甲基葡糖胺，吗啉， 哌啶，和有机无毒碱，包括伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺、环胺和碱离子交换树脂[例如，N(R’)4+(其中R’独立地是H或Cy烷基，例如，铵、Tris)]，例如，异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、氨基丁三醇(trimethamine)、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。特别优选的有机无毒碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、氨基丁三醇、二环己基胺、胆碱和咖啡因。本发明可用的其它的可药用酸和碱包括那些来源于氨基酸的酸和碱，所述氨基酸例如组氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和天冬酰胺。“可药用的”缓冲剂和盐包括来源于上述指明的酸和碱加成盐的那些缓冲剂和盐。具体的缓冲剂和/或盐包括组氨酸、琥珀酸盐和乙酸盐。“冻干保护剂(Iyoprotectant) ”是这样的分子，当其与目的蛋白质组合时,其在冻干和随后的贮存中显著地防止或减少蛋白质的物理化学不稳定性。示例性的冻干保护剂包括糖和它们相应的糖醇；氨基酸，诸如谷氨酸单钠或组氨酸；甲胺，诸如甜菜碱；易溶盐,诸如硫酸镁；多元醇，诸如三元的或较高分子量的糖醇，例如甘油(glycerin)、葡聚糖、赤藓醇、丙三醇(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronics ;及其组合。其它的示例性冻干保护剂包括甘油和明胶，以及糖类蜜二糖(mellibiose)、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水苏糖。还原糖的实例包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和乳果糖。非还原糖的实例包括非还原的多羟基化合物的糖苷，所述多羟基化合物选自糖醇及其它直链多元醇。优选的糖醇是单糖苷，特别是通过将二糖诸如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖还原而获得的那些化合物。配糖(glycosidic)侧基可以是葡糖苷的(glucosidic)或半乳糖苷的(galactosidic)。糖醇的其它的实例是葡糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖。优选的冻干保护剂是非还原糖海藻糖或蔗糖。将冻干保护剂以“冻干保护量”添加到冻干前的制剂中，这意味着，在存在冻干保护量的冻干保护剂的情况下对蛋白质冻干之后，在冻干和贮存期间蛋白质基本上保持它的物理化学稳定性。“可药用糖”是当其与目的蛋白质组合时，在贮存期间显著地防止或减少蛋白质的物理化学不稳定性的分子。当制剂将要被冻干然后被重构时，“可药用糖”也可称为“冻干保护剂”。示例性的糖和它们相应的糖醇包括氨基酸，诸如谷氨酸单钠或组氨酸；甲胺，例如甜菜碱；易溶盐，例如硫酸镁；多元醇，例如三元的或较高分子量的糖醇，例如甘油(glycerin)、葡聚糖、赤藓醇、丙三醇(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；
丙二醇；聚乙二醇；Pluronics ;及其组合。其它的示例性冻干保护剂包括甘油和明胶，以及糖类蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水苏糖。还原糖的实例包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和乳果糖。非还原糖的实例包括非还原的多羟基化合物的糖苷，所述多羟基化合物选自糖醇及其它直链多元醇。优选的糖醇是单糖苷，特别是通过将二糖例如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖还原而获得的那些化合物。配糖(glycosidic)侧基可以是葡糖苷的(glucosidic)或半乳糖苷的(galactosidic)。糖醇的其它的实例是葡糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖。优选的可药用糖是非还原糖海藻糖或蔗糖。以“保护量”将可药用糖添加到制剂中(例如，冻干前)，这意味着在贮存期间(例如，在重构和贮存之后)蛋白质基本上保持它的物理化学稳定性。本文感兴趣的“稀释剂”是可药用的(对于向人类施用是安全的和无毒的)、可用于配制液体制剂的稀释剂，所述液体制剂诸如是在冻干之后重构的制剂。示例性的稀释剂包括无菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、Ringer’s溶液或葡萄糖溶液。在备选的实施方案中，稀释剂可以包括盐和/或缓冲剂的水溶液。“防腐剂”是可被添加到本文制剂中以降低细菌活性的化合物。添加防腐剂可以，例如便于生产多次使用(多剂量)的制剂。可能的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲氯铵、苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基基团是长链化合物)和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇类，诸如苯酚、丁基和苄基醇、烷基对羟苯甲酸酯，诸如甲基或丙基对羟苯甲酸酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇、和m-甲酚。本文最优选的防腐剂是苄醇。“治疗”是指治疗处理以及预防性或防范性措施。需要治疗的对象包括已经患有疾病以及需要预防疾病的那些对象 。用于治疗目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家养动物和农场动物、和动物园、体育或宠物动物，诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等等。优选的，哺乳动物是人。“疾病”是将从所述蛋白质治疗中受益的任何病患。这包括慢性的和急性的病症或疾病，包括使得哺乳动物易患所谈论的疾病的那些病理学情况。文中待被治疗的疾病的非限制性实例包括癌和炎症。“治疗有效量”至少是对于特定的疾病引起可测量的改善或预防所需的最小浓度。已知蛋白的治疗有效量是本领域公知的，在下文中揭示的蛋白质的有效量可以通过技术人员例如普通医师的能力范围内的标准技术来确定。制备可如本文描述的那样配制的抗体(包括与毒素缀合的抗体)及其它蛋白质的方法是本领域公知的，并且例如详述于W02007/001851。抗体和其它蛋白质可根据本发明配制为水性(aqueous)形式或冻干形式,如果能重构为水性形式，后者是可能的。本文描述的制剂可以被制备为重构的冻干制剂。冻干本文描述的蛋白质或抗体，然后重构以广生本发明的液体制剂。在这一特定的实施方案中，在如上所述制备感兴趣的蛋白质之后，产生“冻干前(pre-lyophilized)制剂”。存在于所述冻干前制剂中的蛋白的量考虑到期望的剂量体积、施用的方式等来确定。例如，完整抗体的起始浓度可以为约2mg/ml至约50mg/ml,优选约5mg/ml至约40mg/ml以及最优选约20_30mg/ml。待配制的蛋白一般存在于溶液中。例如，在本发明的液体制剂中，蛋白可以存在于PH值约4-8、优选约5-7的pH缓冲溶液中。取决于，例如，缓冲液和期望的制剂张力(例如重构的制剂的张力)，缓冲液浓度可以为约ImM至约20mM，备选地约3mM至约15mM。示例性的缓冲剂和/或盐是可药用的、并可以从适合的酸、碱和它们的盐产生的那些缓冲剂或盐，诸如在“可药用”酸、碱或缓冲剂下定义的那些。
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在一个实施方案中，向冻干前制剂中添加冻干保护剂。在冻干前制剂中冻干保护剂的量一般要使得一旦重构产生的制剂是等渗的。然而，高渗的重构制剂也可能是适合的。此外，冻干保护剂的量不能太低，以致在冻干时发生无法接受量的蛋白质降解/聚集。然而，在冻干前制剂中示例性的冻干保护剂浓度是约IOmM至约400mM，备选地约30mM至约300mM,备选地约50mM至约100mM。示例性的冻干保护剂包括糖和糖醇，诸如蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。然而，在特定的环境下，某些冻干保护剂也可增加制剂的粘度。如此，应当小心地选择能最小化并中和该影响的特定的冻干保护剂。在“冻干保护齐U”的定义下的上述额外的冻干保护剂在本文中也称为“可药用糖”。对于每一特定的蛋白质或抗体与冻干保护剂的组合，蛋白质与冻干保护剂的比例可以变化。对于抗体作为选取的蛋白以及糖(例如，蔗糖或海藻糖)作为冻干保护剂用来产生高蛋白浓度的等渗重构制剂的情况，冻干保护剂与抗体的摩尔比例可以是约100至约1500摩尔冻干保护剂比I摩尔抗体，以及优选地约200至约1000摩尔冻干保护剂比I摩尔抗体，例如约200至约600摩尔冻干保护剂比I摩尔抗体。可以在所述冻干前制剂的制备中使用冻干保护剂(例如蔗糖或海藻糖)和填充剂(例如甘露醇或甘氨酸)的混合物。填充剂可以容许产生没有过多孔穴在其中的均匀的冻干块。其它可药用载体、赋形剂或稳定剂，诸如在Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，0sol，A.Ed. (1980)中描述的那些，可以被包括在冻干前制剂(和/或冻干制剂和/或重构制剂)中，只要它们不会对制剂的期望特性有不利的影响。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在应用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的，包括其它的缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，诸如EDTA ;金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；可生物降解的聚合物，诸如聚酯；和/或成盐抗衡离子，诸如钠。本文的制剂也可包含超过一种的为被治疗的特定适应征所必需的蛋白质，优选具有不对其它蛋白质造成不利影响的互补活性的那些。例如，在单个制剂中提供与期望的靶点(例如，受体或抗原)结合的两种或更多种抗体可能是需要的。此类蛋白质以对预定目的有效的量适当地组合存在。用于体内施用的制剂必须是无菌的。在冻干和重构之前，或在之后，这可以用无菌过滤膜来过滤来很容易地实现。备选地，可以通过对除蛋白以外的成分，在约120°C高压灭菌例如约30分钟来实现整个混合物的无菌化。在蛋白、任选的冻干保护剂及其它任选组分混合在一起之后，将制剂冻干。为此，许多不同的冷冻干燥器是可用的，例如Hul 150 (Hull，USA)或GT20 (LeyboId-Heraeus，Germany)冷冻干燥器。通过冷冻制剂，随后在适合于初级干燥的温度下从冷冻的内容物中升华冰来实现冻干。在这一情况中，产品温度低于制剂的低共熔点或坍缩温度(collapsetemperature)。一般地,用于 初级干燥的搁板温度(shelf temperature)范围为约_30°C至25°C (前提是初级干燥期间产物保持冷冻)，处于适当的压力下，范围一般为约50至250mTorr。制剂、容纳样品的容器的大小和类型(例如,玻璃小瓶)和液体的体积将主要决定干燥所需的时间，其可以在几小时到几天(例如，40-60小时)的范围内变动。任选地，取决于产品中期望的残留水分水平，也可以进行次级干燥(secondary drying)阶段。进行次级干燥的温度范围为约0-40°C，主要取决于容器的类型和大小以及使用的蛋白的种类。例如，在冻干的该整个除水阶段中搁板温度可以是约15-30°C (例如，约20°C)。次级干燥所需的时间和压力是能产生适合的冻干块的时间和压力，取决于，例如温度及其它参数。次级干燥时间由在产物中期望的残留水分水平来决定，典型地需要至少约5小时(例如，10-15小时)。压力可以是与初级干燥步骤期间使用的相同的。取决于制剂和小瓶的大小，冻干条件可以变化。在向患者施用之前，用可药用稀释剂重构冻干制剂，从而使在重构制剂中的蛋白浓度为至少约50mg/ml,例如约50mg/ml至约400mg/ml,备选地约80mg/ml至约300mg/ml,备选地约90mg/ml到约150mg/ml。当希望在皮下递送重构制剂时,在重构制剂中的这种高蛋白浓度被认为是特别有用的。然而，对于其它施用途径，诸如静脉内施用，重构制剂中较低的蛋白浓度可能是所期望的(例如，在重构制剂中的蛋白为约5-50mg/ml，或约10_40mg/ml)。在某些实施方案中，重构制剂中的蛋白浓度比冻干前制剂中的浓度显著更高。例如，重构制剂中的蛋白浓度可以是冻干前制剂中的蛋白浓度的约2-40倍、或3-10倍、或3-6倍(例如至少三倍或至少四倍)。尽管若需要的话也可以使用其它温度，但一般地在约25°C进行重构以确保完全水化。重构所需的时间取决于，例如，稀释剂的类型、赋形剂的量和蛋白质。示例性的稀释剂包括无菌水、抑菌注射用水(BWF)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、Ringer溶液或葡萄糖溶液。稀释剂任选地含有防腐剂。示例性的防腐剂已经在上文中描述了，其中芳香醇类诸如苄醇或酚醇是优选的防腐剂。使用的防腐剂的量通过就对蛋白的相容性和防腐效率试验而言评定不同的防腐剂浓度来确定。例如，如果防腐剂是芳香醇类(诸如苄醇)，其可以以约0. 1-2. 0%以及优选约0. 5-1. 5%、但最优选约1. 0-1. 2%的量存在。优选地，重构制剂每小瓶含有少于6000个粒子大小彡IOum的粒子。通过将具有期望的纯度的活性成分与任选的可药用载体、赋形剂或稳定剂混合，制备用于忙存的治疗制剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第18版，MackPublishing Co. , Easton, Pa. 18042 [1990])。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，包括缓冲剂，抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素EJl亚硫酸氢钠，防腐剂，等渗剂，稳定剂，金属复合物(例如Zn蛋白质复合物)，和/或螯合剂诸如EDTA。当治疗剂 是抗体片段时，特异地与目标蛋白的结合结构域结合的最小片段是优选的。例如，根据抗体的可变区序列，可以设计抗体片段或甚至肽分子，其保留与目标蛋白序列结合的能力。这类肽可以化学合成和/或通过DNA重组技术生产(参见，例如，Marasco等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA90:7889-7893[1993])。使用缓冲剂来将pH值控制在能使疗效最优化的范围内，特别是当稳定性依赖于PH值时。缓冲剂优选以约50mM至约250mM的浓度存在。本发明使用的适合的缓冲剂包括有机的和无机的酸，和它们的盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲剂可以由下面物质组成组氨酸和三甲胺盐，例如Tris0添加防腐剂以延缓微生物生长，防腐剂一般以0. 2%-l. 0%(w/v)存在。本发明使用的适合的防腐剂包括十八烧基二甲基节基氯化铵；六甲氯铵；苯甲烧铵(benzalkonium)卤化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)，苄索氯铵；硫柳汞，苯酚，丁基或苄基醇；烷基对羟苯甲酸酯，诸如甲基对羟苯甲酸酯或丙基对羟苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇，3-戊醇，和m-甲酚。张力剂(tonicity agent)，有时被称为“稳定剂”，其用来调整或维持液体组合物的张力。当与大的、带电生物分子诸如蛋白和抗体一起使用时，它们通常称为“稳定剂”，因为它们能与氨基酸侧链的带电基团相互作用，从而减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑其它成分的相对量，张力剂可以以0. 1%至25%重量、优选I至5%间的任何量存在。优选的张力剂包括多羟基糖醇，优选三羟基或更高的糖醇，诸如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。其它的赋形剂包括可以充当下列的一种或多种的物质(I)填充剂，(2)增溶剂，
(3)稳定剂和(4)防止变性或对容器壁附着的物质。此类赋形剂包括多羟基糖醇(在上文中列举的)；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等等；有机糖或糖醇，诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、myoinisitol、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、a -单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如，乳糖、麦芽糖、鹿糖)；三糖，诸如棉子糖；和多糖诸如糊精或葡聚糖。为了将制剂用于体内施用，它们必须是无菌的。可以用无菌滤膜过滤来使制剂无菌化。本文的治疗组合物一般被放入到具有无菌进入口的容器中，例如，静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。施用途径是按照已知的和公认的方法，诸如一次或多次推注(bolus)或以合适的方式在一段长时间内输注，例如，通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内或关节内途径注射或输注，局部施用，吸入或通过持续释放或延时释放方式。本文的制剂还可包含为被治疗的特定适应征所需要的超过一种的活性化合物，优选不会相互带来不利影响的具有互补活性的那些活性化合物。备选地或此外，所述组合物可包含细胞毒性剂、细胞因子或生长抑制剂。此类分子以对预定目的有效的量适当地、组合存在。也可以将活性成分包裹在微囊、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米粒子和纳米囊)或粗乳液(macroemulsions)中,所述微囊通过例如凝聚技术或界面聚合作用来制备，分别例如羟甲基纤维素或明胶微囊和聚_(甲基丙烯酸甲脂)微囊。这些技术公开在Remington’s Pharmaceutical Sciences第18版中，同上。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合的实例包括，含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质为有形物的形式，例如薄膜，或微囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3，773，919)、L-谷氨酸和Y _乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物，诸如LUPRON DEPOT (由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。已经用人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白细胞介素-2和丽rpgl20成功地进行了用于持续释放的重组蛋白的微囊化。Johnson等人，Nat. Med. 2:795-799 (1996) ; Yasuda等人，Biomed. Ther. 27:1221-1223 (1993) ; Hora 等人，Bio/Technology8:755-758 (1990) ; Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using PolylactidePolyglycolide Microsphere Systems, ^in Vaccine Design:The Subunit and AdjuvantApproach, Powell and Newman, eds., (Plenum Press:New York, 1995), pp.439-462 ；W097/03692 ；W096/40072 ；W096/07399 ;以及美国专利号 5，654，010。这些蛋白的持续释放制剂可以利用聚乳酸-共羟基乙酸(PLGA)聚合物来开发，因为PLGA具有生物相容性和广泛的生物可降解性质。PLGA的降解产物(乳酸和羟基乙酸)可以很快地从人体中清除。此外，取决于其分子量和组成，这一聚合物的降解性可以从数月到数年间调整。Lewis, “Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer”，在 Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(MarcelDekker; New York, 1990), M. Chasin 和 R. Langer (编辑)pp. 1-41。聚合物诸如乙烯醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸使得能够在超过100天的时间释放分子，某些水凝胶在较短的时期内释放蛋白。当封装的抗体在体内保持很长时间时，由于在37°C暴露于的湿气，它们可能变性或聚集，导致生物学活性的丧失和可能的免疫原性的变化。取决于所涉及的机制，为了稳定化可以设计出合理的策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物互换的分子间S-S键形成，则可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制含水量、利用适当的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。脂质体或类蛋白组合物也可被用于配制本文公开的蛋白或抗体。参见美国专利号4，925，673 和 5，013，556。本文描述的蛋白和抗体的稳定性可以通过使用无毒的“水溶性多价金属盐”来增强。实例包括 Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Sn2+、Sn3+、Al2+和 Al3+。可以与上述多价金属阳离子形成水溶性盐的阴离子的实例包括由无机酸和/或有机酸形成的那些阴离子。此类水溶盐在水中的溶解度(20°C )是至少约20mg/ml，或至少约100mg/ml，或至少约200mg/ml。可用于形成所述“水溶性多价金属盐”的适合的无机酸包括盐酸、乙酸、硫酸、硝酸、硫氰酸和磷酸。可以使用的适合的有机酸包括脂肪族羧酸和芳香酸。在这个定义下的脂肪族酸可被定义为饱和的或不饱和的C2_9羧酸(例如，脂肪族的单、二和三羧酸)。例如，在这个定义中的示例性单羧酸包括饱和的C2_9单羧酸，乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和capryonic酸,和不饱和的C2_9单羧酸,丙烯酸、丙炔酸(propriolic acid)、甲基丙烯酸、巴豆酸和异巴豆酸。示例性二羧酸包括饱和的C2_9 二羧酸，丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸，而不饱和C2_9 二羧酸包括马来酸、富马酸、柠康酸和甲基延胡索酸。示例性的三羧酸包括饱和的C2_9三羧酸，丙三羧酸和1，2，3-丁烷三羧酸。另外，该定义的羧酸还可包含一个或两个羟基形成羟基羧酸。示例性的羟基羧酸类包括羟基乙酸、乳酸、甘油酸、羟基丙二酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸。这个定义中的芳香酸包括苯甲酸和水杨酸。通常使用的可用来帮助稳定本发明的封装的多肽的水溶性多价金属盐包括，例如(1)卤化物的无机酸金属盐(例如，`氯化锌、氯化钙)、无机酸金属的硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和硫氰酸盐；(2)脂肪族羧酸金属盐(例如，乙酸钙、乙酸锌、丙酸钙(calciumproprionate)、轻基乙酸锌、乳酸I丐、乳酸锌和酒石酸锌)；和(3)芳香族羧酸金属盐,苯甲酸盐(例如,苯甲酸锌)和水杨酸盐。为了预防或治疗疾病，活性剂的合适剂量将取决于需治疗的如上文定义的疾病类型、疾病的严重度和进程、施用活性剂是为了预防目的还是治疗目的、先前的治疗、患者的病史和对活性剂的反应，以及主治医师的判断。一次性或在一系列治疗中将活性剂适当地施用给患者。可以将本发明的方法与已知的治疗疾病的方法组合，既可以作为组合的或附加的治疗步骤，也可以作为治疗制剂的另外组分。本发明药物组合物的剂量和期望的药物浓度可取决于预想的特定用途而变化。确定合适剂量或给药途径完全在普通技术人员的能力范围内。动物试验为确定用于人类治疗的有效剂量提供了可靠的指导。可以根据Mordenti, J.和Chappell, W. "The Useof Interspecies Scaling in Toxicokinetics,〃In Toxicokinetics and New DrugDevelopment, Yacobi 等编辑，Pergamon Press, New Yorkl989，pp. 42-46 中提出的原则进行有效剂量的种间换算。当进行本文描述的多肽或抗体的体内施用时，正常的剂量数取决于施用途径可以从每天约10ng/kg直至约100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选约lmg/kg/天到IOmg/kg/天。已经在文献中提供了对递送的特别剂量和方法的指导，参见，例如美国专利号4，657，760,5, 206, 344或5，225，212。包含在本发明的范围之内的是，不同的制剂对于不同的治疗和不同的疾病是有效的，以及意图治疗特定器官或组织的施用可能需要以不同于治疗另一器官或组织的方式来递送。此外，剂量可以通过一次或多次独立的施用，或通过连续的输注来施用。对于持续几天或更长时间的重复施用，取决于情况，持续进行治疗直到产生期望的对疾病症状的抑制。然而，其它剂量方案可能是有用的。可以通过常规的技术和测量来容易地监测治疗的进展。根据已知的方法将本发明的制剂包括但不限于重构制剂施用至需要用所述蛋白治疗的哺乳动物优选人，所述已知方法例如以推注(bolus)或在一段时间内的连续输注的静脉施用、通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑液内、鞘膜内、口服、局部或吸入途径。在优选的实施方案中，通过皮下施用(即，在皮肤之下)将所述制剂施予哺乳动物。为此，可以利用注射器注射所述制剂。然而，用于施用所述制剂的其它装置是可用的，诸如注射装置(例如，Inject-ease 和Genject 装置)；注射笔(诸如GenPen )；自动注射装置、无针的装置(例如，Medijector 和Biojector )和皮下贴剂递送系统。在一特定的实施方案中，本发明涉及用于单剂量施用单位的试剂盒。这种试剂盒包含治疗蛋白或抗体的水性制剂的容器，包含单腔的或多腔的预填充注射器。示例性的预填充注射器可从 Vetter GmbH, Ravensburg, Germany 获得。蛋白质的合适剂量(“治疗有效量”)将取决于，例如，需治疗病患、病患的严重度和进程、施用蛋白是为了预防目 的还是治疗目的、先前的治疗、患者的病史和对蛋白的反应，使用的蛋白种类、和主治医师的判断。一次性或在一系列治疗中向患者适当地施用蛋白，也可自诊断后任何时候向患者施用。所述蛋白可以作为唯一的治疗来施用，或与可用于治疗所讨论病患的其它药物或治疗组合施用。当所选择的蛋白是抗体时,约0. l_20mg/kg是施用至患者的最初候选剂量,例如，不论是一次施用还是多次独立施用。然而，其它剂量方案可能是有用的。可以通过常规技术来容易地监测治疗的进展。在本发明的另一个实施方案中，提供包含所述制剂的制品，并且优选提供它的使用说明。所述制品包含容器。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶(例如，双腔小瓶)、注射器(例如，单腔或双腔注射器)和试管。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。位于装有所述制剂的容器上的或与之关联的标签可以标明重构和/或使用的指导。标签可进一步指明所述制剂可用于或意欲用于皮下施用。装有所述制剂的容器可以是多次使用的小瓶，其容许重复施用(例如，2-6次施用)重构制剂。所述制品可进一步包含含有适合的稀释剂(例如，BWFI)的第二容器。一旦混合所述稀释剂和冻干制剂，在重构制剂中的最终蛋白浓度一般是至少50mg/ml。所述制品可进一步包含从商业和用户立场出发需要的其它材料，包括其它的缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和带使用说明的包装说明书。通过参考以下实施例将能更充分地理解本发明。然而，这些实施例不应当被看作是对本发明的范围的限制。在本公开文本中的所有引文在此明确引入作为参考。实施例1:烷基糖苷作为非离子表面活性剂防止蛋白质/抗体聚集的研究该实施例说明烷基糖苷作为非离子表面活性剂防止水溶液中的抗体聚集的用途。利用两种不同形式的搅动摇动(shaking)和搅拌(stirring),评价不同烧基糖苷和聚山梨酯20对抗溶液中各种单克隆抗体的搅动诱导的聚集的保护作用。
_7] 摇动诱导的聚集在该组研究中，在37oC的受控温度下，将单克隆抗体的缓冲溶液(20mM磷酸钠缓冲液，pH7. 4)在定轨摇床上以150rpm进行摇动。利用3ml抗体溶液填充至6cc玻璃瓶中，进行这些研究。以规则间隔抽取样品，并利用分子排阻色谱分析单体的百分数。评价烷基糖苷类的不同表面活性剂在摇动期间防止蛋白质聚集的效力。将表面活性剂在低于其各自临界胶束浓度(CMC)或高于其各自CMC的浓度下使用。搅拌诱导的聚集在该组研究中，使用特氟龙涂层的(Tefloncoated)磁力搅拌棒在单克隆抗体的缓冲溶液(20mM组氨酸-乙酸盐，pH5. 5)中引起搅动。将3ml抗体溶液填充于6cc玻璃瓶中，并利用特氟龙涂层的搅拌棒将所述溶液在500rpm下搅拌。将所述溶液搅拌90分钟，并以规则间隔抽取样品，并分析作为不溶聚集物形成的指征的浊度。评价烷基糖苷类的不同表面活性剂在摇动期间防止蛋白质聚集的效力。将表面活性剂在低于其各自临界胶束浓度(CMC)或高于其各自CMC的浓度下使用。MS图1显示在37°C下、以150rpm摇动64小时后，不含表面活性剂的溶液中和存在不同表面活性剂的溶液中抗-MUC16单克隆抗体的单体百分数的时间依赖性，所述表面活性剂包括正癸基-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20。以各自CMC值的浓度的一半(即1.1mM(0. 035%w/v)正癸基-D-吡喃葡萄糖苷、9mM(0. 24%)正辛基-0 -D-吡喃葡萄糖苷和0. 04mM(0. 0035%)聚山梨酯20)使用表面活性剂。如图1中所示的，在无任何表面活性剂的情况下，在摇动64小时时，观察到抗体单体百分数的降低。尽管在这些条件下聚山梨酯20对防止摇动诱导的单体损失是无效的，但是测试的烷基糖苷类的两种表面活性剂即正癸基-D-吡喃葡萄糖苷和正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷在防止摇动引起的抗-MUC16单克隆抗体的单体损失方面是有效的。因此，正癸基-0 -D-吡喃葡萄糖苷和正辛基- P -D-吡喃葡萄糖苷(即具有大于1. OmM的CMC值的烷基糖苷)有效地防止溶液中的抗-MUC16单克隆抗体的搅动诱导的聚集。图2和3显示在环境温度下，利用特氟龙涂层的磁力搅拌棒以500rpm搅拌90分钟后，抗-MUC16单克隆抗体的溶液中浊度形成的时程。在不含表面活性剂的溶液中和在含有不同烷基糖苷表面活性剂或聚山梨酯20的溶液中评价浊度。图2中，使用的表面活性剂浓度是其各自CMC值的十分之一，S卩1.8mM(0.053%)正辛基-P-D-吡喃葡萄糖苷、
0.18mM(0. 008%)正癸基-P-D-吡喃麦芽糖苷、0. 22mM(0. 007%)正癸基-P-D-吡喃葡萄糖苷、25mM(0. 66%)正己基-D-吡喃葡萄糖苷和0. 008mM(0. 0007%)聚山梨酯20。图3中，使用的表面活性剂浓度是其各自CMC值的二倍，即36mM(l. 0%)正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷、3. 6mM(0. 16%)正癸基-D-吡喃麦芽糖苷、4. 4mM(0. 14%)正癸基-D-吡喃葡萄糖苷、500mM(12%)正己基-D-吡喃葡萄糖苷和0. 16mM(0. 014%)聚山梨酯20。如图2中所示，与不含表面活性剂的抗体溶液相比，在各自CMC值的十分之一浓度下的正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷和聚山梨酯20有效防止混浊发展。混浊的形成通常归因于抗体的大的不溶聚集物的形成。如图3中所示，在各自CMC的二倍浓度下，根据浊度形成测量，所述烷基糖苷类表面活性剂都有效防止溶液中抗体的聚集。图4中，研究了在37°C下、以300rpm摇动72小时期间，改变正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷的浓度对抗-MUC16单克隆抗体制剂的浊度的作用。如图4中所示，如通过浊度形成所测量，在所有不同的测试浓度下，即 0. 72mM(0. 02w/v)、1. 8mM(0. 05w/v)、3. 6mM(0. lw/v)、9mM(0. 25w/v)U8mM(0. 5w/v)，正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷在摇动期间有效抑制可见的抗体聚集物的形成。图5中，研究了在37°C下、以300rpm摇动72小时后，改变正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷的浓度对溶液中抗-MUC16单克隆抗体的单体百分数的作用。如图5中所示，与在类似条件下贮存的未摇动样品的单体百分数相比，在所测试的不同浓度下，正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷都有效保持摇动时抗-MUC16抗体的单体百分数。图6-9中，研究了 37 °C下、以300rpm摇动72小时期间，0. 23mM(0. 02%w/v)聚山梨酯20或3. 6mM(0. l%w/v)正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷对抗-MUC16单克隆抗体(图6)、抗-1gE单克隆抗体(图7)、抗-CDlla单克隆抗体(图8)和抗-CD22单克隆抗体(图9)的水性制剂的浊度的作用。如图6-9中所示，如通过浊度形成所测量，聚山梨酯20和正辛基-3 -D-吡喃葡萄糖苷都有效抑制摇动期间所有测试抗体的可见的抗体聚集物的形成。在图10-13 中，研究了在 37°C 下、以 300rpm 摇动 72 小时期间，0. 23mM(0. 02%w/v)聚山梨酯20或3. 6mM(0. l%w/v)正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷对抗-MUC16单克隆抗体(图10)、抗-1gE单克隆抗体(图11)、抗-⑶Ila单克隆抗体(图12)和抗-⑶22单克隆抗体(图13)的水性制剂的单体百分数的作用。如图10-13中所示，与在类似条件下贮存的未摇动样品的单体百分数相比，正辛基-D-吡喃葡萄糖苷有效地保持摇动时各种测试抗体的单体百分数。实施例2 :烷基糖苷作为非离子表面活性剂防止蛋白质/抗体氧化的研究本实施例阐明烷基糖苷作为非离子表面活性剂防止水溶液中的抗体氧化的用途。在第一个试验中，将烷基糖苷类表面活性剂即正癸基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-0 -D-吡喃葡萄糖苷和正癸基-P -D-吡喃麦芽糖苷以及聚山梨酯20的0. l%w/v浓度的水溶液在40°C下贮存I个月。然后,抽取样品，并利用Amplex Red过氧化氢检测法分析过氧化氢的存在。图14中显示这些分析的结果。如图14中所示，将含有烷基糖苷表面活性剂的溶液在40°C下贮存I个月后，这些溶液产生可忽略量的过氧化氢。相反，在类似的贮存条件下，含有聚山梨酯20的溶液中形成大约IOyM过氧化氢。这些数据表明与聚山梨酯20相比，将烷基糖苷用作水性制剂中的蛋白质稳定剂可能是更好的，因为烷基糖苷具有相对更低的随时间推移在溶液中产生氧化性过氧化氢的本性。第二个试验中，评价了含有正癸基-P -D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20的溶液中的抗-CDlla单克隆抗体中的Met256氨基酸残基的氧化。为了这个目的，将3ml含有0. l%w/v表面活性剂的抗体缓冲溶液(pH6. 0)在5°C或40°C下、于6cc小瓶中贮存2或4周。然后，抽取样品，并分析抗-CDlla—级氨基酸序列中的氨基酸Met256残基的氧化，先前已表明该残基易于氧化。图15中显示了这些分析的结果。如图15中所示，与起始样品相比，在如上所述贮存后，在含有正癸基-D-吡喃葡萄糖苷或正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷的溶液中未观察到抗-CDlla的氧化的Met256百分含量的显著增加。然而，在含有聚山梨酯20的抗-CDlla溶液中，发现与时间点O的相同氨基酸残基的大约2%的氧 化相比，在40°C下贮存4周后，大约16%的Met256残基被氧化。因此，所述数据表明与聚山梨酯20相比，将烷基糖苷用作水性制剂中的蛋白质稳定剂可能是更好的，因为烷基糖苷具有相对更低的随时间推移在溶液中氧化配制的蛋白质的本性。在第三个试验中，分析抗-⑶22单克隆抗体中Met和Trp氨基酸残基(即已知的易于氧化的氨基酸)的芬顿(Fenton)试剂诱导的氧化。具体地讲，制备含有0.1ppm Fe3+和Ippm过氧化氢的抗-⑶22单克隆抗体的缓冲(20mM组氨酸乙酸盐，pH5. 5)溶液，并在无表面活性剂或者存在0. 23mM(0. 02%w/v)聚山梨酯20或3. 6mM(0. l%w/v)正辛基-D-吡喃葡萄糖苷的条件下，将其在40°C贮存2周或4周。然后，抽取样品，并从经苯基RP-HPLC柱洗脱的抗体的早先峰(early peaks)的百分数确定Met和Trp残基的氧化百分数。图16中显示这些分析的结果。如图16中所示，与含有聚山梨酯20的那些溶液相比，单克隆抗-⑶22中敏感氨基酸(Trp，Met)的芬顿(Fenton)试剂诱导的氧化在含有正辛基-P-D-吡喃葡萄糖苷的溶液中得到抑制，并与不含表面活性剂的溶液相当。因此，这些数据表明与聚山梨酯20相比，将烷基糖苷用作水性制剂中蛋白质的稳定剂可能是更好的，因为烷基糖苷具有相对更低的随时间推移在溶液中氧化配制的蛋白质的本性。实施例3:烷基糖苷作为非离子表面活性剂防止蛋白质/抗体中色氨酸残基的光i 秀导的氧化的研究本实施例阐明作为非离子表面活性剂的烷基糖苷防止水溶液中蛋白质/抗体上色氨酸残基的光诱导的氧化的 用途。所有下面试验如下进行。MAb样品和光处理基因泰克公司(Genentech, Inc.)从CHO细胞株生产人源化抗氧化的LDL单克隆抗体。对于光稳定性研究，制备3个独立的样品1)对照样品，用铝箔纸包住的小瓶；2)测试样品，光暴露的小瓶(未包裹的)；3)测试样品，含有指明的非离子表面活性剂的光暴露的小瓶(未包裹的)。将对照&光暴露的样品都保持于光盒中24小时。按照ICH准则，采用对于Atlas SUNTEST CPS+光盒(Light Box)的下述设置进行光暴露发光水平=250瓦特/平方米；时间设定24小时；总UV量=538瓦特-小时/平方米；总的可见量=1，320, OOOlux-小时。胰蛋白酶MAb肽图的LC/MS/MS :还原和烷基化后，将样品用胰蛋白酶消化。将得到的肽用偶联有安捷伦1200毛细管HPLC系统的Thermo LTQ-Orbitrap质谱仪进行分析。HPLC 柱子Jupiter5um C18250X1. 0mm,流速:70uL/min,柱子恒温器温度:55°C。溶剂 A
0.1%TFA 的水溶液，B :0. 09%TFA 的 90%ACN 溶液。Orbitrap 设置MS 分辨率 60000，利用 LTQ以数据依赖模式收集的MS/MS。费光测量利用装配有控温水浴的Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4突光分光光度计(Edison，NJ)得到溶液的内在的(Intrinsic)色氨酸荧光发射光谱。在295nm激发后，在300-450nm收集色氨酸发射光谱。测定光对抗氧化的LDL抗体上的色氨酸残基的氧化作用和非离子表面活性剂对抗氧化的LDL抗体上的色氨酸残基的氧化的保护作用。测试的抗体在氨基酸位置33 (即Trp33)和92(即Trp92)处具有色氨酸残基，并按照上述，测定所述位点的光诱导的氧化百分数。将所述分析的结果列于下面的表2中。表2条件/表面活性剂%氣化的 %氣化的
Trp33Trp92
无光/无表面活性剂0.0 %0.6 %
光/无表面活性剂0.3%6.0 %光/0.39m'1正己基-P-D-吡喃葡萄糖苷 0.3%4.9 %
光/300 mM正己基-P-D-吡喃葡萄糖苷 0.0 %1.6 %
光/0.39 mM正己基-P-D-吡喃麦芽糖苷 0.3 %5.7 %
光/300 niM正己基-P-D-吡喃麦芽糖苷 0.0 %2.2 %
光/0.03 mM正十二烷基-P-D-吡喃麦芽糖苷0.0 %10.6 %
光/0.39 mM正十二烷基-P-D-吡喃麦芽糖苷0.1 %2.7 % 光/0.03 mM正十二烷基-P-D-吡喃葡萄糖苷0.4 %8.9 % 光/0.02%聚山梨酯 200.6%8.9%益论 具有大约ImM或更大的CMC值的烷基糖苷具有针对蛋白质包括单克隆抗体的搅动诱导的聚集的稳定作用。具有大约ImM或更大的CMC值的烷基糖苷所提供的针对搅动诱导的聚集的稳定性不是抗体依赖的，因为对不同氨基酸序列的不同抗体观察到所述有益作用。令人惊讶地，在低于其各自CMC值的浓度下应用烷基糖苷时，观察到具有大约ImM或更大的CMC值的烷基糖苷提供针对搅动诱导的聚集的稳定性。不像聚山梨酯20，贮存一段延长的时间后，具有大约ImM或更大的CMC值的烷基糖苷不形成过氧化氢。不像聚山梨酯20，具有大约ImM或更大的CMC值的烷基糖苷不显著诱导各种单克隆抗体中的易氧化氨基酸的氧化。不像聚山梨酯20，具有大约ImM或更大的CMC值的烷基糖苷能抑制或降低抗体和其它蛋白质中色氨酸残基的光诱导的氧化的量，特别是在高于其各自CMC值的浓度下使用时。
权利要求
1.物质组合物，其包含蛋白质和在25°C、在水中具有大约1. OmM或更大的CMC值的烷基糖苷。
2.权利要求1所述的物质组合物，其中蛋白质是抗体。
3.权利要求2所述的物质组合物，其中抗体是单克隆抗体。
4.权利要求1所述的物质组合物，其中烷基糖苷选自正己基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷、正壬基-P -D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-P -D-吡喃葡萄糖苷、3-环己基-1-丙基-P -D-葡萄糖苷、3-环己基-1- 丁基-P -D-葡萄糖苷、正己基-P -D-吡喃麦芽糖苷、正辛基-P -D-吡喃麦芽糖苷、正壬基-P -D-吡喃麦芽糖苷、正癸基-P -D-吡喃麦芽糖苷、环己基-甲基-P -D-麦芽糖苷、2-环己基-乙基-P-D-麦芽糖苷、3-环己基-丙基-P-D-麦芽糖苷、4-环己基-丁基-0 -D-麦芽糖苷和5-环己基-戍基_ P -D-麦芽糖苷。
5.权利要求1所述的物质组合物，其中烷基糖苷是正辛基-P-D-吡喃葡萄糖苷。
6.权利要求1所述的物质组合物，其中烷基糖苷是正癸基-P-D-吡喃葡萄糖苷。
7.权利要求1所述的物质组合物，其中烷基糖苷是正癸基-P-D-吡喃麦芽糖苷。
8.权利要求1所述的物质组合物，其中烷基糖苷是正己基-P-D-吡喃葡萄糖苷。
9.权利要求1所述的物质组合物，其中烷基糖苷是正十二烷基-P-D-吡喃麦芽糖苷。
10.权利要求1所述的物质组合物，其中烷基糖苷是正十二烷基-P-D-批喃葡萄糖苷。
11.权利要求1所述的物质组合物，其包含抑制搅动诱导的聚集的量的所述烷基糖苷。
12.权利要求1所述的物质组合物，其包含防止氧化的量的所述烷基糖苷。
13.权利要求1所述的物质组合物，其中烷基糖苷以低于烷基糖苷在25°C、水中的CMC值的浓度存在。
14.权利要求1所述的物质组合物，其是水性的。
15.权利要求1所述的物质组合物，其在大约2-8°C的温度下稳定至少I年。
16.权利要求1所述的物质组合物，其在大约30°C的温度下稳定至少I个月。
17.权利要求1所述的物质组合物，其不是冻干的，且没有进行预先冻干。
18.权利要求1所述的物质组合物，其是重构的冻干制剂。
19.权利要求2所述的物质组合物，其中抗体是易于聚集的。
20.权利要求2所述的物质组合物，其中抗体是易于氧化的。
21.含有容纳权利要求1所述的物质组合物的容器的制品。
22.制备药物制剂的方法，其包括制备权利要求1所述的物质组合物，并评价物质组合物中蛋白质的物理稳定性、化学稳定性或者生物活性。
23.抑制存在于第一水溶液中的蛋白质的搅动诱导的聚集的方法，该方法包括向所述第一水溶液中加入抑制搅动诱导的聚集的量的烷基糖苷的步骤，所述烷基糖苷在25° C、水中具有大约1. 0mM或更大的CMC值，由此提供第二水溶液。
24.权利要求23所述的方法，其中蛋白质是抗体。
25.权利要求24所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
26.权利要求25所述的方法，其中烷基糖苷选自正己基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正壬基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-P-D-吡喃葡萄糖苷、3-环己基-1-丙基-P-D-葡萄糖苷、3-环己基-1-丁基-P-D-葡萄糖苷、正己基-β -D-吡喃麦芽糖苷、正辛基-β -D-吡喃麦芽糖苷、正壬基-β -D-吡喃麦芽糖苷、正癸基-β -D-吡喃麦芽糖苷、环己基-甲基-β -D-麦芽糖苷、2-环己基-乙基-β -D-麦芽糖昔、3_环己基_丙基_ β -D-麦芽糖昔、4_环己基_ 丁基_ β -D-麦芽糖昔和5_环己基-戍基_ β -D-麦芽糖昔。
27.权利要求23所述的方法，其中烷基糖苷是正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
28.权利要求23所述的方法，其中烷基糖苷是正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
29.权利要求23所述的方法，其中烷基糖苷是正癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷。
30.权利要求23所述的方法，其中烷基糖苷是正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
31.权利要求23所述的方法，其中将烷基糖苷加至低于烷基糖苷在25°C、水中的CMC值的终浓度。
32.权利要求23所述的方法，其包括进一步冻干所述第二水溶液的步骤。
33.防止第一水溶液中存在的蛋白质氧化的方法，该方法包括向所述第一水溶液中加入防止氧化的量的烷基糖苷的步骤，所述烷基糖苷在25° C、水中具有大约1. OmM或更大的CMC值，由此提供第二水溶液。
34.权利要求33所述的方法，其中蛋白质是抗体。
35.权利要求34所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
36.权利要求33所述的方法，其中烷基糖苷选自正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-环己基-1-丙基-β-D-葡萄糖苷、3-环己基-1-丁基-β-D-葡萄糖苷、正己基-β -D-吡喃麦芽糖苷、正辛基-β -D-吡喃麦芽糖苷、正壬基-β -D-吡喃麦芽糖苷、正癸基-β -D-吡喃麦芽糖苷、环己基-甲基-β -D-麦芽糖苷、2-环己基-乙基-0 -D-麦芽糖昔、3_环己基_丙基_ β -D-麦芽糖昔、4_环己基_ 丁基_ β -D-麦芽糖昔和5_环己基-戍基_ β -D-麦芽糖昔。
37.权利要求33所述的方法，其中烷基糖苷是正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
38.权利要求33所述的方法，其中烷基糖苷是正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
39.权利要求33所述的方法，其中烷基糖苷是正癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷。
40.权利要求33所述的方法，其中烷基糖苷是正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
41.权利要求33所述的方法，其中烷基糖苷是正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷。
42.权利要求33所述的方法，其中烷基糖苷是正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
43.权利要求33所述的方法，其中将烷基糖苷加至低于烷基糖苷在25°C、水中的CMC值的终浓度。
44.权利要求33所述的方法，其中将烷基糖苷加至高于烷基糖苷在25°C、水中的CMC值的终浓度。
45.权利要求33所述的方法，其包含进一步冻干所述第二水溶液的步骤。
46.权利要求33所述的方法，其中所述氧化是光诱导的氧化。
47.权利要求46所述的方法，其中所述光诱导的氧化是所述抗体或其它蛋白质中的色氨酸残基的光诱导的氧化。。
全文摘要
本发明涉及某些烷基糖苷组合物用于防止抗体和其他蛋白质在其治疗上有用的制剂中聚集和氧化的用途。
文档编号A61K31/7024GK103068367SQ201180040661
公开日2013年4月24日 申请日期2011年6月23日 优先权日2010年6月24日
发明者O·厄叙尔, V·K·夏尔马 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司