专利名称：中华眼镜蛇蛇毒在治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症中的用途的制作方法
技术领域：
本发明药物新用途技术领域，具体涉及一种物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物中的用途。
背景技术：
蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多种组分构成的复杂混合物。新鲜毒液呈蛋清样粘稠液体，具有特殊的腥味。祖国传统医学认为眼镜蛇及其毒性成分可通经络，祛风湿，并具有强身健体之功效。早在二十世纪初，人们就开始应用蛇毒来缓解恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛，随后出现一系列关于蛇毒有类似吗啡样镇痛作用的报道。随着研究的不断深入，现在， 蛇毒及其制品已应用于临床，除了镇痛作用外，研究发现在抗风湿、抗肿瘤以及在神经系统疾病治疗方面都有很好的疗效，但是在糖尿病及糖尿病肾病方面的作用还未见报道。本发明因此而来。
发明内容
本发明目的在于提供一种物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物中的应用，提供了一种治疗糖尿病及糖尿病肾病的新思路、新方法。需要说明的是，本发明采用物理改性的中华眼镜蛇蛇毒其治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症效果最好，相比而言未改性的眼镜蛇总毒和其中的神经毒素、膜毒素和眼镜蛇毒因子也是有效的。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是本发明目的是提供一种物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物中的应用。优选的，所述眼镜蛇蛇毒为中华眼镜蛇蛇毒的总毒。优选的，所述眼镜蛇蛇毒物理改性方法是将眼镜蛇蛇毒用去离子水溶解后加热变性，加热温度在50 100°C之间,加热时间为Imin 30min,然后自然复性后得到物理改性后的眼镜蛇蛇毒。优选的，所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒选自物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒或物理改性后的泰国眼镜蛇蛇毒。所述眼镜蛇蛇毒还包括含有类似蛇毒成分的泰国眼镜蛇、银环蛇等其它亚种蛇毒。优选的，所述治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物中可以包括未改性的眼镜蛇蛇毒和其中起主要作用的神经毒素、膜毒素和眼镜蛇毒因子。优选的，所述糖尿病包括具有肾病或神经病变等并发症的糖尿病。优选的，所述治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物还包括含有泰国眼镜蛇、银环蛇的类似蛇毒成分。优选的，所述糖尿病包括糖尿病肾病或糖尿病神经病变。优选的，所述治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物的给药剂型选自口腔速溶药膜、口服液、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂。优选的，所述治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物中物理改性后的眼镜蛇蛇毒与其他药物活性成分组成复方制剂或物理改性后的眼镜蛇蛇毒与药用辅料形成单方制剂 (如采用无菌操作法或冻干技术制成的注射用无菌粉末或块状制剂)。本发明中眼镜蛇蛇毒为眼镜蛇总毒，将其物理改性后可用于制备糖尿病及糖尿病肾病并发症的药物。所述的眼镜蛇蛇毒为中华眼镜蛇总蛇毒，根据成份和药效的相同性，所述蛇毒还包括泰国眼镜蛇蛇毒。所述药物可以制备成选自以下的剂型口腔速溶药膜、口服液、胶囊、 涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂。当然，所述药物还包括各种单方和复方制剂。本发明涉及中华眼镜蛇蛇毒在制备治疗糖尿病及糖尿病肾病药物中的用途。本发明经动物实验证实物理改性后的中华眼镜蛇总毒在药效上有效量(如大鼠10-3000 ii g/ kg，人I IOOOil g/kg)范围内能抑制糖尿病肾病大鼠体重降低和肾系数增加，提高抗氧化应激水平，并能纠正糖、脂代谢紊乱(血糖、血甘油三酯、血总胆固醇)，改善肾功能(尿蛋白、尿素氮、血肌酐等)，并对肾脏有明显的保护作用，其能减轻肾小球肿胀，减少炎症因子在肾脏的表达，改善肾组织和胰岛的病理学改变，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜和皮肤给药等优点。本发明采用的中华眼镜蛇蛇毒是在人工饲养条件下，无菌条件下采毒，低温冷冻干燥，结晶体呈淡黄色粉末。蛇毒的干物质中90%以上是蛋白质，是其毒性和其生物学活性的主要成分。中华眼镜蛇蛇毒成分主要有眼镜蛇蛇毒因子(1%-2%)、心脏毒素(又名细胞毒素40% -50% )、神经毒素(10% )等其它类蛋白质。本发明通过中华眼镜蛇总毒经物理方法处理达到减毒增效目的，物理处理后的眼镜蛇毒有抑制体重降低和肾系数变大，提高抗氧化应激水平，纠正糖、脂代谢紊乱，改善肾功能，改善肾脏和胰岛的病理学改变，因此具有治疗糖尿病及糖尿病肾病的作用。所述药物包括口服液、口腔速溶药膜、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂等，所述药物还包括各种单方和复方制剂。中华眼镜蛇蛇毒在临床上已用于治疗风湿和缓解恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛等，但都用纯化的神经毒素、多种蛇毒的混合制剂或眼镜蛇毒和其它中药的复方制剂。鉴于中华眼镜蛇毒毒性比较大，蛇毒中的药用成分主要是蛋白质，其结构和生物活性可以被理化因素改变。蛇毒在用过氧化氢处理后，二硫键被打开，其毒性大大降低，但是镇痛作用也几乎消失，提示生物学活性被破坏。而蛋白质加热后可发生可逆性变性，变性后空间结构发生了改变，或部分大分子蛋白质因加热部分分解为小分子量蛋白质。小鼠试验证明这种加热变性之后的蛇毒毒性明显减少，而药效增加。本发明人发现加热变性的中华眼镜蛇蛇毒对糖尿病模型大鼠血糖升高和尿蛋白增加具有明显的缓解作用，提示对糖尿病及其糖尿病肾病有很好的治疗作用。这一发现，将对糖尿病及糖尿病肾病的研究和药物开发产生重大的影响，并有临床实用价值，为中华眼镜蛇蛇毒开辟临床新的用途。所述物理变性后的眼镜蛇总毒是在用去离子水溶解的情况下，加热温度为50 100°C之间，时间在Imin 30min，自然复性后得到的。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是I.采用经物理改性的中华眼镜蛇总毒，毒性低而药效高。2.中华眼镜蛇蛇毒不仅能抑制糖尿病大鼠的体重降低，还能降低肾系数。3.中华眼镜蛇蛇毒不仅能升高血清SOD水平，还能降低血清MDA水平
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4.中华眼镜蛇蛇毒能纠正糖尿病大鼠的糖、脂代谢紊乱。5.中华眼镜蛇蛇毒能改善糖尿病肾病大鼠的肾功能。6.中华眼镜蛇蛇毒不仅能降低糖尿病肾病大鼠NF-k B和TGF-P在肾组织的表达，还能改善肾小球肿胀。7.中华眼镜蛇蛇毒能改善糖尿病肾病大鼠肾组织的病理学改变。8.中华眼镜蛇蛇毒能改善糖尿病肾病大鼠胰岛组织的病理学改变9.中华眼镜蛇蛇毒用量少，有效范围大，从10 3000ii g/kg都有很好的治疗糖尿病及糖尿病肾病的作用。人用剂量约为I IOOOiI g/kg。本发明得到一种中华眼镜蛇蛇毒在制备治疗糖尿病及糖尿病肾病药物中的用途。 本发明发现改性中华眼镜蛇总毒在(10-3000 yg/kg)范围内能抑制体重降低和肾系数变大，提高抗氧化应激水平，纠正糖脂代谢紊乱，改善肾功能等对糖尿病及糖尿病肾病有明显的治疗作用，其能减少肾组织的炎性因子的表达，改善肾组织和胰岛的病理学改变等症状， 具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜和皮肤给药等优点。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图I为中华眼镜蛇蛇毒对糖尿病肾病大鼠体重和肾系数的影响；其中###p
<0. 001，与正常组比较；*p < 0. 05 ；**p < 0.01，与模型组比较。图2为中华眼镜蛇蛇毒对糖尿病肾病大鼠氧化应激水平的影响；其中##p
<0.01 ；###p < 0. 001，与正常组比较；*p < 0. 05 ；**p < 0.01，与模型组比较；图3为中华眼镜蛇蛇毒对糖尿病肾病大鼠糖、脂代谢的影响；其中##p <0.01 ； ###p < 0. 001，与正常组比较；*p < 0. 05 ；**p < 0.01，与模型组比较。图4为中华眼镜蛇蛇毒对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响；其中##p < 0. 01 ；###p
<0. 001，与正常组比较；*p < 0. 05 ；**p < 0.01，与模型组比较。图5为中华眼镜蛇蛇毒对糖尿病肾病大鼠肾组织NF- K B和TGF- ^表达的影响； 其中##p < 0. 01 ；###p < 0. 001，与正常组比较；*p<0. 05；**p<0. 01，与模型组比较。图6为中华眼镜蛇蛇毒对糖尿病肾病大鼠肾小球肿胀的影响；其中##p < 0. 01， 与正常组比较广p < 0. 05，与模型组比较。图7为中华眼镜蛇蛇毒对糖尿病肾病大鼠肾组织病理学改变的影响(HE染色， 400 X)；图8为中华眼镜蛇蛇毒对糖尿病肾病大鼠胰岛组织病理学改变的影响(HE染色， 400X)。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体实验的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例物理处理后的中华眼镜蛇毒的动物药效学实验在中华眼镜蛇蛇毒在治疗糖尿病及糖尿病肾病中的动物实验中，实施例采用灌胃给药，给药剂量在10_3000li g/kg,—天一次。采用的眼镜蛇是人工饲养的眼镜蛇，在无菌条件下采毒，经冷冻干燥成淡黄色粉末，低温保存。蛇毒来源于江西余江县彩虹养蛇场。本实施例动物实验研究情况如下链脲佐菌素(STZ)是一种广泛使用的致大鼠糖尿病模型的药物，雄性Wistar大鼠体重180-220g，单次腹腔注射溶于pH = 4. 5柠檬酸钠的STZ (27. 5mg/ml)，按体重计算为 55mg/kg。对照组注射相同体积的溶媒柠檬酸钠(0. 2ml/100g)。注射三天之后，尾静脉取血测血糖。筛选出血糖> 16. 7mmol/L大鼠为实验用大鼠。筛选出的大鼠分成四组并开始口服给予改性眼镜蛇蛇毒，第一组模型对照大鼠，第二组眼镜蛇蛇毒小剂量组(30 u g/kg)、第三组中剂量组(90 y g/kg)、第四组大剂量组(270 y g/kg)。注射柠檬酸钠的大鼠用做正常对照。从注射STZ开始每隔两周用大鼠代谢笼收集12h (21:00-9:00)尿量并测定尿蛋白含量。 第0、4、8、12周的前天晚上21点禁食之后，第二天早上9点尾静脉取血测定血糖浓度。第12 周各组大鼠称重之后，处死动物。右侧肾脏和胰腺10%甲醛固定，切片染色。腹主动脉取血后4°C 3000转/分钟，离心IOmin后取血清测定血糖、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、血清肌酸酐、尿素氮、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。第12周收集尿测定尿蛋白、微量白蛋白(Microalbumin,mALB)、N_ 乙酸-P -D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-b-glucosaminidase, NAG),并计算肌酐清除率,计算公式为CCr (ml/kg/min)=尿Cr(mg/dl) X尿体积(ml)/血 Cr (mg/dl) X 体重(kg) /720 (min)。本实施例各种给药制剂和相关给药途径情况如下(按照成人体重50kg计算)眼镜蛇毒口服(片剂，胶囊):眼镜蛇毒0. 5mg-50mg :淀粉40g ;10%淀粉浆24g ； 干淀粉约占总重的4% ;硬脂酸镁约占总重的0. 5%。眼镜蛇毒口腔含片(速溶膜剂)乳糖88. 8g ;糖粉38. Og ; 17%淀粉浆，适量；10% 眼镜蛇毒溶液0. 6g(眼镜蛇毒量)；硬脂酸镁I. Og ;每片含眼镜蛇毒0. 5mg-50mg。眼镜蛇毒注射剂眼镜蛇蛇毒0. 5mg-50mg,水解明胶(填充剂)5mg甘露醇(填充剂)IOmg葡萄糖酸|丐(填充剂)，Img半胱氨酸(稳定剂)，0. 5mg临用前用5%葡萄糖注射液500ml，溶解后滴注或临用前用生理盐水2ml溶解后注射。巴布剂基质用材料主要有黏着剂、填充剂、保湿剂、透皮促进吸收剂等，其眼镜蛇蛇毒、基质和背衬为一整体，相互对皮肤和黏膜发挥作用。试验结果如下I)对糖尿病肾病大鼠一般状况的影响糖尿病典型的症状是“三多一少”，即多饮，多食，多尿，体重降低。注射STZ3天后， 模型大鼠体重显著降低，12周之后，体重进一步降低。与模型组比较，给予中华眼镜蛇蛇毒治疗近12周后，能显著抑制体重减轻(见图I)。糖尿病继发肾病，肾肿大。肾的重量与体重的比值就是肾系数，与正常组比较，模型组左、右肾系数有近2. 5倍的增加。给予蛇毒药之后，肾系数降低明显(图I)。2)对糖尿病肾病大鼠血清中氧化应激水平的影响腹主动脉取血离心之后取上层血清直接测定SOD和MDA。考马斯亮蓝法检测蛋白质含量。SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法测定；MDA活性测定10%匀浆用TBA比色法测定。结果发现，与正常对照组比较，模型大鼠血清SOD活性明显下降，给予中华眼镜蛇蛇毒之后，血清SOD活性明显升高。与正常对照组比较，模型大鼠血清MDA明显上升，给予中华眼镜蛇蛇毒之后，血清MDA活性明显降低。SOD和MDA的比值，比值越大说明抗氧化能力越强。与正常对照组比较，模型大鼠血清比值明显下降，给予中华眼镜蛇蛇毒之后，比值明显升高(图2)。3)对糖尿病肾病大鼠糖脂代谢紊乱的影响糖尿病各种并发症的原因在于血糖升高引起，所以临床上的一些药物主要是通过降低血糖水平起作用的。试验发现造模后的血糖明显升高，一直到造模的第12周，在第12 周，蛇毒的各个剂量均能明显减少血糖水平(图3)。由于糖的代谢紊乱，导致脂的代谢出现紊乱。试验测定了糖尿病肾病大鼠的血清中总胆固醇(Total Cholesterol)和甘油三酯 (Triglyceride)水平。与正常组相比，模型大鼠血清中总胆固醇和甘油三酯水平具有显著性增加。虽然蛇毒的三个剂量都降低了血清中总胆固醇和甘油三酯的水平，只有蛇毒中剂量组(90 u g/kg)有统计学意义(图3)。4)对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响糖尿病后期并发的肾病对机体损害更为严重。肾脏病变，会引发一系列的变化。 肾小球滤过率下降，重吸收能力下降，尿中的蛋白会显著增加，并引发血中尿素氮等明显增加。造模2周后尿蛋白明显升高，造模之后的第八周蛇毒中剂量组能明显减低尿蛋白，随后在第10周和第12周发现蛇毒各个剂量组均能降低尿蛋白(见图4)。肾脏的损害，会出现一系列的肾功能异常。试验对血尿素氮、肌酐和白蛋白以及尿中￠2-微球蛋白、肌酐和N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)等有关肾功能的指标做了检测，并计算了肌酐清除率。与正常对照组相比，模型组中大鼠肾功能的各个指标均出现显著性增加，给予蛇毒之后，均出现了下降，其中蛇毒中剂量组(90 y g/kg)改善肾功能指标最为明显(图4)。5)对糖尿病大鼠肾病变的影响本实施例对右肾组织中NF-k B和TGF-P做免疫组织化学染色(图5)。转录因子NF-K B是一类普遍存在的、控制着各种基因转录的重要转录调节因子促炎症细胞因子、 细菌、病毒和紫外照射等细胞外的刺激都能引起的激活。糖尿病肾病大鼠中NF-k B表达与正常组明显增加，而中剂量组和大剂量组均能减少NF-K B表达。糖尿病肾病是糖尿病常见的微血管并发症，其主要的病理改变为肾小球细胞外基质(ECM)沉积。ECM积聚可引起肾小球系膜区扩张、基底膜增厚、进而进展为肾小球硬化。TGF-^是调节ECM代谢最重要的细胞因子，主要分布在肾小球和肾小管上皮细胞，通过自分泌和旁分泌促进系膜细胞、肾小管细胞肥大，增加ECM沉积，抑制ECM降解。试验发现糖尿病肾病模型大鼠中TGF- ^表达与正常组明显增加，而中剂量组和大剂量组均能减少TGF-P表达。与正常大鼠比较，糖尿病肾病大鼠的部分肾小球大小增大。给药组小剂量和中剂量改善肾脏炎症，改善肾小球肿胀，与模型大鼠比较有统计学意义(见图6)。6)对肾脏病理学改变的影响各组肾脏组织病理学改变H E染色结果显示(图7):正常对照组肾小球结构正常， 未见系膜细胞及基质增生；糖尿病组肾小球固有细胞数目及基质增多，毛细血管管腔狭窄， 部分肾小球出现明显的分叶、硬化、缩小；蛇毒中剂量和大剂量组肾小球体积较糖尿病组减小，肾小球固有细胞数目增生减轻，系膜增生及基底膜增厚明显减轻。7)对糖尿病肾病大鼠胰岛的影响
光镜下，正常组中大鼠胰岛数目较多，呈现圆形或椭圆形细胞团状，边界清晰胰岛内数目较多，排列整齐，胞浆丰满，核多为圆形。糖尿病大鼠与正常组比较，胰岛萎缩，胰岛边缘皱缩，与周围组织边界不清，胰岛细胞核大小、形态不规则，胰岛内细胞数下降。给予蛇毒之后，病理改变均减轻，胰岛内数目增多，体积增加，部分胰岛外观基本正常(图8)。综上所述，可知I.物理改性后的中华眼镜蛇毒口服给药能抑制体重降低，减少肾系数。2.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药提高抗氧化应激水平。3.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒能减轻糖、脂代谢紊乱。4.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能改善肾功能。5.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能降低肾组织中的NF-k B和TGF-3 的表达。6.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能减轻肾小球肿胀。7.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能改善糖尿病肾病肾组织病理学改变。8.物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能改善糖尿病肾病胰岛组织的病理学改变。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述眼镜蛇蛇毒的物理改性方法包括将眼镜蛇蛇毒用去离子水溶解后加热变性，加热温度在50 100°C之间，加热时间为Imin 300min的步骤。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述眼镜蛇蛇毒选自中华眼镜蛇蛇毒或泰国眼镜蛇蛇毒。
4.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物还包括未改性的中华眼镜蛇蛇毒和其中起主要作用的神经毒素、膜毒素和眼镜蛇毒因子。
5.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物还包括含有泰国眼镜蛇、银环蛇的类似蛇毒成分。
6.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述糖尿病包括糖尿病肾病或糖尿病神经病变。
7.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物的给药剂型选自口腔速溶药膜、口服液、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂。
8.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物中物理改性后的眼镜蛇蛇毒或天然眼镜蛇蛇毒与其他药物活性成分组成复方制剂或物理改性后的眼镜蛇蛇毒或天然眼镜蛇蛇毒与药用辅料形成单方制剂。
全文摘要
本发明公开了一种眼镜蛇蛇毒在制备治疗糖尿病及糖尿病肾病并发症药物中的应用。本发明经动物实验证实物理改性复性后的中华眼镜蛇蛇毒总毒在(10-3000μg/kg)范围内能降低糖尿病肾病大鼠体重降低、降低糖尿病大鼠血糖水平，减少尿蛋白，升高血浆白蛋白，降低血浆甘油三酯，降低血浆肌酐和尿素氮，减少炎症因子在肾脏的表达，降低氧化应激水平，减少肾小球硬化，减轻肾组织和胰岛损伤。
文档编号A61P13/12GK102526695SQ20121000103
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者朱扣柱, 秦正红, 谢燕 申请人:苏州人本药业有限公司