专利名称：一种重组墨吉明对虾溶菌酶及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学制药技术领域，具体的说是利用生物技术制备墨吉明对虾溶菌酶的方法。本发明还涉及该方法制备出来的墨吉明对虾溶菌酶的应用。
背景技术：
溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性酶，它能催化细菌细胞壁中粘多糖N-乙酚胞壁酸和N-乙酞葡萄糖胺之间的β _1，4糖苷键的水解，导致细胞裂解，内容物逸出而使细菌死亡，是一种很有效的广谱性抗菌剂。近来的研究发现溶菌酶的杀菌活性并不仅因为其能够溶解细菌的细胞壁，还因为其蛋白内部存在一个或多个双亲性的蛋白螺旋结构域，它们可以刺穿细菌的细胞膜，造成细菌的正常生理代谢发生紊乱直至死亡。溶菌酶蛋白分子经高温变性后，虽然其水解细菌细胞壁能力丧失，但由于位于分子内部的双亲性的蛋白螺旋结构域暴露在外部，其抗菌能力反而更强了。另外，溶菌酶还有保护炎症部位的正常组织作用、提高单核细胞吞噬外来病菌、抑制细菌内毒素释放和抑制真菌和病毒等作用。它广泛存在于自然界动植物和微生物的组织、体液及分泌物中，在生物机体的抗病性及免疫防御系统中发挥重要作用。溶菌酶作为天然的抗菌剂、免疫增强剂和防腐剂目前广泛应用于医药、食品及饲料等行业。需要特别指出的是，因为人和哺乳动物细胞是没有细胞壁结构的，也不含有肽聚糖成分，故任何来源的溶菌酶对人和哺乳动物均无毒性作用。溶菌酶的应用领域包括以下几个方面1)溶菌酶可以作为防腐剂。它本身是一种天然蛋白质，能被人体作为C和N源吸收代谢，且对人和哺乳动物无任何毒性，因此是一种安全性非常高的食品防腐剂；2)抗生素替代品。目前滥用抗生素带来的问题也越来越受到人们的关注，一是耐药性问题，二是药物残留问题，其副作用是不可忽视的，目前急需开发一种针对不同耐药菌株均有效的“超级抗生素”用于医学治疗和养殖产业。溶菌酶是一种天然无毒的酶制品，它对人类及大部分水生动物和畜禽动物即是体内自身的免疫因子，增强动物机体的免疫力，又可作为医疗和养殖生产中的杀菌剂，降解和杀死常见的致病菌。所以，该溶菌酶可以代替抗生素应用于临床治疗和养殖生产中。幻在食品、饮料和化妆品中作为添加剂使用。溶菌酶集药理、保健和防腐三个功能于一体，作为一种天然蛋白质无任何毒副作用。例如，食品中若加入溶菌酶， 可补充人体内的非特异性免疫因子，增强人体抗感染能力，杀死肠道内的腐败病菌，维持肠道内菌群正常化。若加入到化妆品中，可以治疗由金黄色葡萄球菌、丙酸杆菌和螨虫等引发的痤疮和青春痘的治疗。溶菌酶大体可分为3种类型C型、G型和噬菌体溶菌酶，它们在底物种类和杀菌活性方面存在着比较大的差异。迄今所发现的绝大部分的溶菌酶均属C型(如人溶菌酶和鸡蛋清溶菌酶)。目前生产上常用的溶菌酶都是从鸡蛋清中制备的。但高等动物的C型溶菌酶普遍杀菌活性不高，抗菌谱也不够广，不能杀灭革兰氏阴性细菌。来自低等动物一海洋甲壳类动物中提取的溶菌酶生物化学性质不同于人和鸡蛋白溶菌酶。来自于海洋类甲壳类动物的溶菌酶很少受到温度的影响，有很宽的适应范围。与蛋清溶菌酶相比，它具有嗜低温、抗氧化和杀菌谱广的特点，能特异性地分解革兰氏阳性和阴性菌的细胞壁形成溶菌现象，具有杀菌、防腐、抗病毒等功效，在医药、食品、饲料及化妆品等产业具有独特优势和广阔的市场前景。目前溶菌酶主要从蛋清中提取，由于来源有限，生产工艺复杂，溶菌酶产量十分有限，价格居高不下，难以满足越来越大的市场需求。因此用基因工程手段表达溶菌酶成为很重要的手段。前期的研究者利用RT-CR和RACE-PCR技术，从墨吉明对虾 (Fenneropenaeus merguiensis)机体中克隆得到一种溶菌酶基因(GenBank :EU591712)； 并通过生物信息软件分析得到关于其编码产物的结构特点信息(“Molecular cloning, characterization, expression and antibacterial analysis of a lysozyme homologue from Fenneropenaeus merguiensis", Mol Biol Rep(2009)36 :1587-1595, DOI 10.1007/ sll033-008-9355-8。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用生物技术制备墨吉明对虾溶菌酶的方法及其应用。本发明提供一种重组墨吉明对虾溶菌酶，是通过以下方法制备，将墨吉明对虾溶菌酶基因(GenBank :EU591712)(序列如SEQ ID No. 1)连接到真核表达载体pPIC9K中构建重组质粒，并将所形成的重组质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，经甲醇诱导表达，然后经分子筛层析柱纯化后得到重组溶菌酶。所述的重组溶菌酶可作为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抑菌剂。所述方法的具体操作步骤是1)重组fLysC质粒的构建从新鲜墨吉明对虾中取出墨吉明对虾肠组织，提取总RNA，并通过反转录PCR扩增墨吉明对虾溶菌酶的cDNA，用引物FM-7和FM-8进行PCR扩增。PCR产物纯化后与真核表达载体pPIC9K分别用EcoRl和NotI酶切，回收酶切片段，将这二片段于室温用T4连接酶连接2-8小时，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为重组fLysC质粒。2)溶菌酶的表达与制备将重组质粒DNA用Bglll酶解，用电击法将质粒DNA转化至酵母菌GSl 15中，并涂布于含有氨苄青霉素LB固体培养基上培养上，筛选转化子即为GS115/fLysC，将选出的高拷贝转化菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中继续培养，观察不同菌株对溶壁微球菌的抑菌活性，筛选高活性的重组菌株。3)重组墨吉明对虾溶菌酶的浓缩纯化将重组酵母菌株先在BMGY液体培养基中， 30°C摇瓶培养，250转/分钟；当OD值达到8. O士0. 5时，更换培养基，用原培养物10%体积的BMMY培养基，继续培养；每24h添加甲醇，保持甲醇浓度0. 3% (ν/ν)，4天后结束培养， 离心收集培养液上清；将该培养液上清经过硫酸铵饱和沉淀然后透析去除多余硫酸铵，再经过s印hadeX-G75分子筛层析柱洗脱，用0. 05M pH8. OTris-HCI连续洗脱，然后将洗脱液在冻干机上冻干，得到重组溶菌酶干粉。所述步骤1)中PCR使用特异性引物FM-7和FM_8，引物两端分别引入EcoRI和 Notl限制性酶切位点FM-7 :5’ —GCAGAATTCCCCTCCATCGTGGGCCGTGATTGC—3'
FM-8 5，—AAGTTTTGTAAGGTCACGTCCAGCCAGCTCAT—3，本发明还提供了上述重组墨吉明对虾溶菌酶在制备抑菌剂中的应用。所述的溶菌酶可作为作为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抑菌剂。对由上述方法制得的重组墨吉明对虾溶菌酶进行了相关的生物学活性分析，发现该酶具有很强的广谱抗菌作用，对常见的革兰氏阳性菌和阴性菌金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、痢疾志贺氏菌、 副溶血弧菌、创伤弧菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌均具有明显的抑菌作用，尤其是对临床医疗和养殖生产中常见的致病细菌和弧菌杀菌力极强。并且发现该重组墨吉明对虾溶菌酶比直接从对虾组织中提取的溶菌酶活性提高了 35% ；与鸡蛋清溶菌酶相比，抑菌谱范围要广很多，尤其对于鸡蛋清溶菌酶不能作用的革兰氏阴性菌抑菌效果更明
Mo本发明具有如下优点1.稳定表达。本发明的酵母表达系统可以稳定高效地表达溶菌酶。2.本发明的生产制备方法采用该基因工程菌生产溶菌酶适合大规模培养和分离提取，生产工艺不复杂，设备要求简单，生产周期短，成本比较低，无环境污染。3.广谱、高效抑菌作用。本发明的溶菌酶可以有效裂解多种革兰氏阴性和革兰氏阳性菌，因而可以用于防控细菌性疾病。
图1是实施例1中制得的重组墨吉明对虾溶菌酶干粉的SDS-PAGE检测结果。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中涉及到的常规性实验方法均采用如下方法1.质粒提取、DNA (PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆采用“TAKARA生物科技(大连)有限公司”的相应试剂盒。2.大肠杆菌转化用 Hanaha 方法(Sambrook and Resell :Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)酵母转化按 hvitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20)；聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照 Sambrook and Resell :Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 20013.所有限制性内切酶和链接酶均购自“纽英伦生物技术有限公司”，北京。4. pPIC9K 购于 Invitrogen 公司(Catalog no. V17520)实施例1 重组墨吉明对虾溶菌酶的制备步骤1 质粒fLysC的构建从新鲜墨吉明对虾中取出墨吉明对虾肠组织，用TRIZOL REAGENT (Invitrogen)试剂从中提取总RNA ；用TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)扩增墨吉明对虾溶菌酶的cDNA。 根据己知不同生物种类的溶菌酶基因的序列，设计简并引物，序列如下FM-I :5，-GCTGCATTCGAGAAATG-3，(SEQ ID N0. 2)
FM-2 :5，-AGATTTGCAGGCTTGTCACC-3，(SEQ ID NO. 3)。首先进行反转录反应，条件为53°C，30min;在进行PCR扩增，反应条件为94°C， 2min ；94°C，30s ；45°C, 30s ；72°C，Imin 循环 5 次；接着 94°C, 30s ；55°C, 30s ；72°C，lmin 循环25次。将PCR产物回收，并将其连接到载体pMDIS-T上，在大肠杆菌感受态细胞(DH5a) 中表达，通过蓝白斑筛选带有目的基因的质粒，提取的质粒产物经测序检测为溶菌酶cDNA 序列，如 SEQ ID NO. 1。参照克隆得到的墨吉明对虾溶菌酶。DNA设计一对用于真核表达的特异性引物 FM-7和FM-8，引物两端分别引入EcoRI和Notl限制性酶切位点。FM-7 5' —GCAGAATTCCCCTCCATCGTGGGCCGTGATTGC—3，(SEQ ID NO. 4)FM-8 5‘ —AAGTTTTGTAAGGTCACGTCCAGCCAGCTCAT—3' (SEQ ID NO. 5)用TAKARA onestep RNA PCR Kit (AMV)进行 RT_PCR。PCR循环参数为50°C30min， 94°C 2min ；94°C 30s, 45 °C 30s, 72 °C lmin，5 个循环；94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin，30 个循环；最后72°C延伸lOmin。经PCR产物凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，用EcoR工和 Notl酶切扩增产物，与经同样酶酶切的酵母表达载体PPIC9K相连接。筛选重组质粒。步骤2 重组溶菌酶的转化和表达提取质粒DNA，用BglII酶解质粒DNA，用电击法将质粒DNA转化至感受态酵母菌 GSl 15中，并涂布于RDB固体培养板上，置30°C中培养2_3天至转化重组子出现。将长出的单菌落(重组子)分别点种MM平板和MD平板，进一步筛选在MD平板上生长正常，但在MM 平板上生长缓慢的转化子，得到高拷贝的转化菌株。将此类酵母菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中，30°C培养4天左右，观察不同菌株对溶壁微球菌的抑菌活性，筛选高活性的墨吉明对虾溶菌酶表达菌株。步骤3 重组墨吉明对虾溶菌酶的浓缩纯化含墨吉明对虾溶菌酶基因的酵母菌株先在BMGY液体培养基中，30°C摇瓶培养， 250转/分钟。当OD值达到8. 0士0. 5左右时，更换培养基，用原培养物1/10体积的BMMY 培养基，继续培养。每24h添加甲醇，保持甲醇浓度在0. 3%，4天后结束培养，5000rpm4°C 离心10分钟，收集培养液上清，用于墨吉明对虾溶菌酶的纯化制备。取培养液上清，在其中分别加入固体硫酸铵至饱和度达80%，在室温下搅拌 1小时，然后5000rpm室温下离心20分钟，收集沉淀，将沉淀重新悬浮在IOml 0. 05M pH8. OTris-HCl缓冲液中，并转移至透析袋中，在1L0. 05M pH8. OTris-HCl透析以去除剩余的硫酸铵，4°C透析Mh，期间更换3次外透析液。透析过的培养上清用0. 45 μ m的滤膜过滤， 然后用s印hadeX-G75分子筛凝胶柱进行进一步纯化，所使用的柱体积为80x1. 5cm。上样结束后，用0.05M pH8. OTris-HCl洗脱未结合蛋白，共洗脱4个柱床体积。用含有0. INaCI 的0.05M pH8. OTris-Hcl溶液洗脱。将透析过的洗脱液在冻干机上冻干，得到重组墨吉明对虾溶菌酶干粉；12% SDS-PAGE鉴定蛋白质，发现其蛋白纯度可达99%以上，结果如附图1 所示。此外，溶菌酶重组蛋白经过硫酸铵、透析和柱层析等长时间处理后，其杀菌活性未受到任何损失。实施例2 重组墨吉明对虾溶菌酶活性测定采用浊度法测定上述制得的溶菌酶活性用60mM、pH6. 2的磷酸缓冲液配制-定浊度(A450 = 0. 6-0. 7)的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)为底物，取 0. ImL 酶液加入2. 5mL底物(20°C )中，在波长450nm处读取反应体系^iin内每隔15s的吸光度。 以ΔΑ45(1/π η变化0.001个吸光度值为一个活性单位。酶活力=Δ A450nm/Imin X 0. OOlX 0. ImL(ΔA450nm Imin内吸光度的变化)。在不同的温度和ρΗ条件下，对重组墨吉明对虾溶菌酶进行了生物学分析。最适作用ρΗ值为6. 6，最适作用温度为34°C -46°C。重组墨吉明对虾溶菌酶酶活力为56U/mg ；同样方法测定直接从对虾组织中提取的溶菌酶酶活力为42U/mg，前者比后者酶活性提高了 35. 5%。实施例3 重组墨吉明对虾溶菌酶杀菌谱的测定采用管碟法测定重组墨吉明对虾溶菌酶的抑菌圈大小，以其半径(IOmm)来表示。取革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus),溶血性链球菌(Streptoccus hemolyticus),以及革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)，痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)， 副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)，创伤弧菌(Vibrio vulnificus)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa),嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens)，并将这些细菌在LB液体培养基中37°C，200r/min过夜培养，稀释至0D600为0. 001左右。取IOOul以上所选菌液于牛肉膏蛋白脉培养基中涂勻后，放入无菌牛津杯，于牛津杯中加入重组墨吉明对虾溶菌酶酶液100 μ L(蛋白含量约10 μ g)，370C 过夜培养，测量抑菌圈。取重组墨吉明对虾溶菌酶和鸡蛋清溶菌酶(做对照)，测定两个样品对10种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌圈大小。结果如表1所示表 权利要求
1.一种重组墨吉明对虾溶菌酶，其特征在于通过下述方法制备将墨吉明对虾溶菌酶基因连接到真核表达载体PPIC9K中构建重组质粒，并将所形成的重组质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，经甲醇诱导表达，然后经分子筛层析柱纯化后得到重组溶菌酶。
2.如权利要求1所述的重组溶菌酶，其特征在于具体的制备步骤是1)重组《^《质粒的构建从新鲜墨吉明对虾中取出墨吉明对虾肠组织，提取总RNA，并通过反转录PCR扩增墨吉明对虾溶菌酶的cDNA，用引物FM-7和FM-8进行PCR扩增；PCR产物纯化后与真核表达载体 PPIC9K分别用EcoRl和NotI酶切，回收酶切片段，将这二片段于室温用T4连接酶连接2_8 小时，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为重组fLysC质粒；所述 FM-7 :5’ —GCAGAATTCCCCTCCATCGTGGGCCGTGATTGC—3'FM-8 :5’ —AAGTTTTGTAAGGTCACGTCCAGCCAGCTCAT—3'；2)溶菌酶的表达与制备将重组fLysC质粒DNA用Bglll酶解，用电击法将质粒DNA转化至酵母菌GSl 15中，并涂布于含有氨苄青霉素LB固体培养基上培养上，筛选转化子即为GS115/fLysC，将选出的高拷贝转化菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中继续培养，筛选含墨吉明对虾溶菌酶基因的重组酵母菌株；3)重组墨吉明对虾溶菌酶的浓缩纯化将重组酵母菌株先在BMGY液体培养基中，30°C 摇瓶培养，250转/分钟；当OD值达到8. O 士 0. 5时，更换培养基，用原培养物10%体积的 BMMY培养基，继续培养；每24h添加甲醇，保持甲醇浓度0. 3% (ν/ν)，4天后结束培养，离心收集培养液上清；将该培养液上清经过硫酸铵饱和沉淀然后透析去除多余硫酸铵，再经过 sephadex-G75分子筛层析柱洗脱，用0. 05M pH8. O Tris-HCI连续洗脱，然后将洗脱液在冻干机上冻干，得到重组溶菌酶干粉。
3.—种重组墨吉明对虾溶菌酶的制备方法，其特征在于该方法是将墨吉明对虾溶菌酶基因连接到真核表达载体PPIC9K中构建重组质粒，并将所形成的重组质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，经甲醇诱导表达，然后经分子筛层析柱纯化后得到重组溶菌酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)重组fLysC质粒的构建从新鲜墨吉明对虾中取出墨吉明对虾肠组织，提取总RNA，并通过反转录PCR扩增墨吉明对虾溶菌酶的cDNA，用引物FM-7和FM-8进行PCR扩增；PCR产物纯化后与真核表达载体 PPIC9K分别用EcoRl和NotI酶切，回收酶切片段，将这二片段于室温用T4连接酶连接2_8 小时，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为重组fLysC质粒；所述 FM-7 :5’ —GCAGAATTCCCCTCCATCGTGGGCCGTGATTGC—3'FM-8 :5’ —AAGTTTTGTAAGGTCACGTCCAGCCAGCTCAT—3'；2)溶菌酶的表达与制备将重组fLysC质粒DNA用Bglll酶解，用电击法将质粒DNA转化至酵母菌GSl 15中，并涂布于含有氨苄青霉素LB固体培养基上培养上，筛选转化子即为GS115/fLysC，将选出的高拷贝转化菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中继续培养，筛选含墨吉明对虾溶菌酶基因的重组酵母菌株；3)重组墨吉明对虾溶菌酶的浓缩纯化将重组酵母菌株先在BMGY液体培养基中，30°C摇瓶培养，250转/分钟；当OD值达到8. 0 士 0. 5时，更换培养基，用原培养物10%体积的 BMMY培养基，继续培养；每24h添加甲醇，保持甲醇浓度0. 3% (ν/ν)，4天后结束培养，离心收集培养液上清；将该培养液上清经过硫酸铵饱和沉淀然后透析去除多余硫酸铵，再经过 sephadex-G75分子筛层析柱洗脱，用0. 05M pH8. 0 Tris-HCI连续洗脱，然后将洗脱液在冻干机上冻干，得到重组溶菌酶干粉。
5.一种权利要求1所述的重组墨吉明对虾溶菌酶作为抑菌剂的应用。
6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于是作为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抑菌剂的应用。
7.按照权利要求5所述的溶菌酶的应用，其特征在于作为金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、痢疾志贺氏菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌的抑菌剂的应用。
全文摘要
一种高杀菌活力溶菌酶的制备方法及其应用。该方法是将墨吉明对虾溶菌酶基因(SEQIDNo.1)连接到真核表达载体pPIC9K中构建重组质粒，并将所形成的重组质粒转化毕赤酵母GS115，对转化子进行甲醇诱导表达，收集上清，经分子筛层析柱纯化后得到对虾溶菌酶。本发明的酵母表达工艺可以稳定高效地生产溶菌酶，制备工艺不复杂，设备要求简单，生产周期短，成本比较低，无环境污染。所制得的对虾溶菌酶比直接从对虾组织中提取的溶菌酶活性提高了35%，对多种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均具有高效杀菌作用，因此可以广泛应用在医药、食品、农业和化妆品等行业。
文档编号A61K38/47GK102433314SQ201210005020
公开日2012年5月2日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者周亚竟, 李国辉, 祈增华, 陈克平, 陈慧卿, 陈焰, 麦维军 申请人:江苏大学