专利名称：川芎嗪在制备治疗造影剂肾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药单体的应用，具体地说，是中药单体川芎嗪在制备治疗造影剂肾病药物中的应用。
背景技术：
造影剂肾病(contrast-inducednephropathy, CIN)是指由碘造影剂(contrast media, CM)的使用而引起的肾病，主要表现为急性肾功能衰竭(acute renal failure, ARF)。在高风险人群，如慢性肾病、糖尿病、高血压病或70岁以上的老年人，CIN发生率最高可达50%研究显示CIN是目前医院内获得性ARF的第三位诱因，约30%患者肾功能不能恢复而成为慢性肾功能衰竭(chronic renal failure, CRF)。按照CIN防治指南，CIN确切的分子机制尚未明确，并且尚缺乏能有效防治CIN 的药物。近年研究表明氧化应激、肾小管上皮细胞凋亡参与了 CIN病理过程。川芎嗪 (tetramethylpyrazine, TMP)是常用活血化瘀中药川芎的活性成分，除具有扩血管和抗血小板集聚效应外，还有抗R0S、清除自由基、阻滞钙离子通道、抗间质纤维化等作用。目前尚不清楚TMP的上述药理效应能否有效阻断造影剂的肾实质损伤。中国专利文献CN1555803A公开了一种阿魏酸川芎嗪在制药中的应用，阿魏酸川芎嗪具有抗血小板聚集，扩张微血管，接触血管痉挛，改善微循环，活血化瘀作用，并对已聚集的血小板有解聚作用，用于治疗各种原因所致的肾小球疾病，如肾炎、慢性肾炎，肾病综合症和尿毒症等，还用于治疗闭塞性以及闭塞性心脑血管疾病如冠心病、脉管炎、脑供血不全、脑血栓形成、脑栓塞、脑血管病、脑卒中等。中国专利文献CN1217663C公开了川芎嗪在制备用于治疗阴茎勃起功能障碍的药物中的应用。但是关于中药单体川芎嗪在制备治疗造影剂肾病药物中的应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种川芎嗪在制备治疗肾病的药物中的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是川芎嗪在制备治疗肾病的药物中的应用，所述的肾病是造影剂肾病。所述的川芎嗪的用量为80mg/kg。所述的药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、糖浆剂或注射剂。本发明优点在于
本发明提供了一种中药单体川芎嗪的新用途，实验结果证明，TMP能有效保护CIN模型大鼠的肾功能，表现出较好的防治CIN的效应，机制研究发现TMP能通过抑制CaSpaSe3而拮抗造影剂iohexol诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡。本发明为造影剂肾病提供了一种新的治疗药物，具有很好的应用前景。
附图1是光镜下各组大鼠肾脏病理形态学改变(HE，X200),A 正常组，B 模型组， C =NAC 组，D =TMP 组。附图2是各组大鼠肾小管上皮细胞电镜(X 4200)、TUNEL (X 400)染色结果，A 正常组电镜，B 模型组电镜，C 正常组TUNEL染色，D 模型组TUNEL染色，E =NAC组TUNEL染色，F =TMP组TUNEL染色，G 各组凋亡指数(Al)分析。附图3是免疫组化法测定各组大鼠肾组织CaSpaSe3蛋白表达，A 正常组，B 模型组，C =NAC 组，D =TMP 组。附图4是western印迹法测定各组大鼠肾组织CapaSe3蛋白表达，A 正常组，B 模型组，C =NAC组，D =TMP组。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例1 一、材料和方法
1.动物和试剂雄性SD大鼠32只，体重200士20g，由中科院上海实验动物中心提供。夕肖炎痛、L—NAME (L—NAME，艮口 #u_Nitro_L_arginine methyl ester hydrochloride, 分子式为 C7H15N5O4 · HCl，是 NOS (nitric oxide synthase)的非选择性抑制物)、TMP、NAC (N-acetylcysteine)均购自Sigma公司，造影剂Iohexol购自通用电气药业(上海)公司。 TUNEL试剂盒为美国Roche产品，Caspase3多克隆抗体购自Cell Signaling公司。2.动物模型的建立及分组随机分为4组，每组8只A组为正常组，B组为模型组，C组为NAC组，D组为TMP组。其中B-C-D三组均按照文献制备CIN模型(详见=Yukiyo Yokomaku, Toshiro Sugimoto, Shinji Kume, et al. Asialoerythropoietin Prevents Contrast-Induced Nephropathy. J Am Soc Nephrol 2008,19: 321 - 328.)，具体方法如下尾静脉注射10 mg/kg消炎痛；15min后注射10 mg/kg L-NAME ;15min后注射2g iodine/ kg Wiohexol (350 mg iodine/ml) ；A组注射等量PBS液。C-D两组分别于造模前3天每日腹腔注射 150 mg/kg NAC、80mg/kg TMP。3.肾功能和组织形态学检测
3. 1.肾功能检测造模后24h处死动物，尾静脉采血，分离血清，由全自动生化分析仪测定血清肌酐、尿素氮、Cystatin C。3.2.肾组织形态学检测大鼠乙醚麻醉，腹正中切开，取双肾，左肾分别戊二醛+ 锇酸固定及放入-80°C冰箱，用于电镜检测及western印迹检测；右肾经多聚甲醛固定后， 乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，用于HE染色及免疫组化和TUNEL检测。3.3.细胞凋亡检测按照美国罗氏公司(Roche)产品说明书进行，步骤包括肾组织常规固定，石蜡包埋后切片5 μ m，常规脱蜡、水合，Proteinase K工作液处理，加TUNEL 反应液，加converter-POD，加底物DAB显色系统，光镜下观察，细胞核呈棕黄色的为凋亡细胞。在细胞凋亡区域，随机选取5个视野(X200)，以肾小管上皮细胞凋亡阳性细胞数占肾小管上皮细胞总数的百分比作为肾小管上皮细胞凋亡指数(Al)。同时设阴性对照。3. 4.免疫组织化学检测免疫组织化学法检测肾组织Caspase-3的表达石蜡切片常规脱蜡、水化，微波抗原修复，室温孵育15 min，消除内源性过氧化物酶，滴加 Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体(1 :40)，再滴加相应的生物素标记的二抗，以PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色，阳性表达呈棕黄色着色，光镜观察阳性信号。每张切片随机选取10个不重叠视野，应用北航图像分析系统计算其积分光密度(integrated optical density, I0D)。3. 5. western印迹检测caspasd蛋白表达组织块称重、粉碎，裂解液裂解，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。上样、电泳、转膜(IOOmA 40分钟)，放入到丽春红染色剂中染色5 min，观察蛋白转移效果，将转移成功的转移膜浸入5%脱脂奶粉封闭液中，37°C封闭池；加一抗4°C过夜，加辣根过氧化酶标记的二抗室温反应lh，用ECL化学发光法检测，χ线片显影成像，将显色条带扫描至计算机中，以beta-actin为内参，Gel-Pro凝胶分析软件半定量分析。4.统计学分析计量资料数据以 士 s表示，组间差异用单因素方差分析。用
SPSS15. 0统计软件进行统计学分析。二、结果
1. TMP预处理对CIN大鼠肾功能、Cystatin C的影响如表1所示造模后MhB组大鼠出现了肾损伤，表现为Scr、BUN、Cystatin-C均较A组明显升高(p<0. 01);而TMP预处理能有效防止造模导致的肾损伤发生，表现为与B组相比Scr、BUN、Cystatin-C的明显回落 (ρ<0· 01)，其肾保护效应与NAC (C组)相近(ρ>0. 05)。表1肾功能检查G 士 S)
权利要求
1.川芎嗪在制备治疗肾病的药物中的应用，其特征在于，所述的肾病是造影剂肾病。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的川芎嗪的用量为80mg/kg。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、糖浆剂或注射剂。
全文摘要
本发明涉及川芎嗪(TMP)在制备治疗肾病的药物中的应用，所述的肾病是造影剂肾病(CIN)。本发明优点在于本发明提供了一种中药单体TMP的新用途，实验结果证明，TMP能有效保护CIN模型大鼠的肾功能，表现出较好的防治CIN的效应，机制研究发现TMP能通过抑制Caspase3而拮抗造影剂iohexol诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡。本发明为CIN提供了一种新的治疗药物，具有很好的应用前景。
文档编号A61P13/12GK102552267SQ20121003595
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者龚学忠 申请人:上海市中医医院