专利名称：一种o型口蹄疫分子标记疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是ー种O型ロ蹄疫分子标记疫苗及其制备方法。
背景技术：
ロ蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是危害偶蹄动物的烈性传染病，尤其对主要畜种猪、牛、羊的危害特别严重，能造成畜种生产カ下降和不良的社会影响，社会经济损失巨大。因该病传染性极强，世界动物卫生组织(FA0/0IE)将其列为头号必报烈性传染病，国际贸易予以严格限制。我国将该病列为ー类动物传染病之首。在世界上许多国家，尤其是非洲、亚洲和南美洲国家，该病发生次数频繁，流行严重。此外，不时出现全球的流行性爆发。ロ蹄疫的病原是ロ蹄疫病韋(foot-and-mouth disease virus, FMDV)。ロ蹄疫病毒有7个血清型(A，O, C，Asial，SATl，SAT2和SAT3)，各型中又有许多基因和抗原性有差异的分离株，差异主要表现在结构蛋白VPl上。VPl是ロ蹄疫病毒的主要抗原表位区，能激发产生主要的中和抗体。ロ蹄疫病毒血清型由结构蛋白决定，非结构蛋白无血清型之分。和大多数病毒一祥，ロ蹄疫病毒的基因组上既有组成病毒粒子的结构蛋白基因，也有仅參与复制过程而非病毒粒子成分的非结构蛋白基因(non-structure proteins, NSPs)(Forss b,btrebe丄 K,Beck E,et al. Nucleotide sequence and genome organization oifoot-and-mouth disease virus,Nucleic Acids Research, 1984,12 :6587-6601,AcharyaR，Fry E，Stuart D I，et al. The three-dimersional structure of foot and mouthdisease virus at 2.9人.Nature，1989，337 :709-716)。ロ蹄疫病毒感染动物后，在体内大量复制时，既能产生结构蛋白(VP4, VP2，VP3和VP1)，也能产生非结构蛋白(L，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D 以及ー些非结构蛋白的前体蛋白，如 3AB，3ABC) (Belsham GJ. Distinctiveieatures of foot-and-mouth disease virus, a member of the picornavirus family ；aspects of virus protein synthesis,protein processing and structure. Prog BiophyMol Biol，1993,60 :241-260.)。两者作为抗原，刺激动物体产生相应的抗体。因此，感染动物体内既有结构蛋白抗体，也有非结构蛋白抗体。据此，可以判定动物是否感染(过)ロ蹄疫病毒。ロ蹄疫病毒感染动物可变成无症状的病毒携帯者，是ロ蹄疫传播的一大隐患。因此，除患病动物外，无症状的病毒携帯者成为预防和控制ロ蹄疫的重点监控对象。预防和控制ロ蹄疫采取的措施是严格检疫，进出ロ限制，屠宰患病动物，及有计划地实施疫苗免疫易感动物。检疫的技术难题是如何区分感染动物和免疫动物。目前，区分ロ蹄疫感染动物和免疫动物的策略是检测ロ蹄疫病毒非结构蛋白抗体。其理论依据是ロ蹄疫病毒在感染动物体内复制产生的非结构蛋白，刺激动物体产生相应的抗体；而疫苗免疫动物的血清中检测不到相应的抗体，因疫苗制造エ艺的除细胞碎片环节去除了大部分非结构蛋白。研究表明，在众多非结构蛋白中，检测3AB或3ABC抗体区分感染动物和免疫动物的可信度最高(Sorensen KJ, Madsen KA, Madsen EA, et al..Differentntiation of infection irom vaccination in foot-and-mouth disease bythe detection of antibodies to the non—structural proteins 3D，3AB and 3ABC inELISA using antigens expressed in baculovirus. Arch Virol,1998,143 :1-16,)。因此，国际上多个实验室建立了不同模式的检测3AB、3A或3ABC抗体ELISA方法(AlfonsoしIavi jo，Peter WrightiPaul Kitchmg, et al. Developments in diagnostic techniquesfor differentiating infection from vaccination in foot-and-mouth disease. TheVeterinary Journal，2004，167 :9 22.)。世界动物卫生组织(FA0/0IE)的动物疫病诊断手册中推荐应用该法(Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrialanimals，http\\www. oie. int)。ロ蹄疫免疫常用疫苗是灭活疫苗。该苗的生产采用的是病毒接种细胞、组织培养物，病毒増殖后，收获培养物，加化学灭活剂(如ニこ烯亚胺，BEI)使病毒失去感染性，与佐剂混合乳化制成疫苗。病毒在细胞内増殖，结构蛋白和非结构蛋白同时表达，但部分非结构蛋白的ー个可能的特性是与细胞膜成份结合，在疫苗制造エ艺的除细胞碎片环节去除了。然而，游离的，以及与病毒粒子大小相近的非结构蛋白复合物是难以清除的，在疫苗中或多或少的残留，多次免疫动物后也能产生相应的抗体(Bergmann I E,Malirat E V,NeitzertE，Beck N，et al. Improvement oi a serodiagnostic strategy for foot-and-mouthdisease virus surveillance in cattle under systematic vaccination a combinedsystem of an indirect ELISA—3ABC with an enzyme—丄inked immunoelectrotransferblot assay. Arch Virol，2000，145 :473 489)，给区分感染动物和免疫动物带来了障碍。世界动物卫生组织(FA0/0IE)的动物疫苗手册中将ロ蹄疫疫苗免疫动物3次能否产生非结构蛋白抗体，作为疫苗评价的一项指标(Manual of diagnostic tests and vaccines forterrestrial animals, http\\www. oie. int)。ロ蹄疫灭活疫苗的制造要动用活病毒，考虑到严格的生物安全，已开始了 ロ蹄疫基因工程疫苗的研制和使用。但ー些基因工程疫苗也使用了 ロ蹄疫病毒的ー些非结构蛋白
因(Abrams C C,King A M Q,Belsham G J. Assembly of foot-and-mouth disease virusempty capsids synthesized by a vaccinia virus expression system. J Gen Virol,1995,76 :3089-3098.),在疫苗中存有这些非结构蛋白，多次免疫动物后也能产生相应的抗体，同样给区分感染动物和免疫动物带来了障碍。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供ー种O型ロ蹄疫分子标记疫苗及其制备方法。本发明的技术方案如下ー种O型ロ蹄疫分子标记疫苗，标记疫苗种毒为rV-0/3Ad病毒，rV_0/3Ad的基因组序列为SEQ ID NO :2，所述rV-0/3Ad病毒含3A91 114位氨基酸的缺失，并且含有緬甸98VP1氨基酸 序列。所述的O型ロ蹄疫分子标记疫苗的制备方法，包括以下步骤:A1、O型ロ蹄疫病毒基因组RNA全长cDNA重组质粒构建；A2、置换VPl基因和缺失3A蛋白91 114氨基酸编码区的O型ロ蹄疫病毒基因组全长CDNA重组质粒构建；A3、拯救缺失3A蛋白91 114位氨基酸编码区的基因工程病毒，作为标记疫苗种毒。A4、利用针对3A蛋白91 114氨基酸的单克隆抗体建立的竞争ELISA方法可以鉴别该疫苗毒株免疫动物与ロ蹄疫病毒自然感染动物。用本发明方法得到的疫苗免疫动物5次后，动物血清中检测不到缺失3A 91 114位优势表位的抗体。因此，用本发明方法得到的疫苗免疫动物，能准确区分感染动物和免疫动物
图I为FMDV 0ZK/93-08株全长cDNA分子克隆的构建策略，图中文字中间删除线表示改变了原序列中限制性内切酶位点；图2为重组质粒p0MQ-Z123的EcoR I酶切鉴定.1，重组质粒酶切后电泳条带；M，DNA分子质量标准电泳条带；图3为重组质粒pSK-Z4D NotI和BglII酶切鉴定.1，重组质粒酶切后电泳条带；M, DNA分子质量标准电泳条带；图4为重组质粒p0MQ-Z1234D EcoR I酶切鉴定.1，重组质粒酶切后电泳条带；M，DNA分子质量标准电泳条带；图5为含嵌合緬甸98vpl并含3A氨基酸缺失的ozk/93全长克隆的构建示意图；图6为病毒rV-0/3Ad感染BHK-21细胞后引起的CPE. A，正常BHK-21细胞；B，出现CPE的细胞；图7为拯救病毒rV_0/3Ad与0ZK/933A蛋白氨基酸的比对；图8为拯救病毒rV_0/3Ad与0ZK/93VP1蛋白氨基酸的比对；图9为间接免疫荧光检测拯救病毒在BHK上的复制 ふ，接种rV_0/3Ad病毒的BHK-21细胞；B，未接种病毒的BHK-21细胞；图10为电镜下rV_0/3Ad拯救病毒粒子；
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。一、O型ロ蹄疫病毒基因组RNA全长cDNA重组质粒构建设计合成下列寡核苷酸引物，按图I策略构建O型ロ蹄疫病毒0ZK/93-08株基因组RNA全长cDNA重组质粒。Zl agactagttaatacgactcactatagggttgaaagggggcgctagggt(SEQ ID NO 4)Zl-2 tggttggggggggggggggggtgaa(SEQ ID NO 5)Z2 ttcaccccccccccccccccaacca(SEQ ID NO :6)Z2-2 agcgtggagtcgagcacagtac(SEQ ID NO :7)Z3 ggtctaagcaggtttccacaactg(SEQ ID NO :8)Z3-2 aactgcagtgcttcgtgctgccctttctcaatg(SEQ ID NO :9)TA gctaagcttggaactccacgaaaaggtgtcga(SEQ ID NO :10)
Z4-2 ttggcgcgccgcggccgcttttttttttttttttttttt(SEQ ID NO :11)Tl gaaaacgcctgaggccgccgcacactgcatt(SEQ ID NO :12)Tl-2 aatgcagtgtgcggcggcctcaggcgttttc(SEQ ID NO :13)T2 gtgaagaagatatctgactcgctctccagt (SEQ ID NO :14)
T2-2 actggagagcgagtcagatatcttcttcac(SEQ ID NO :15)提取ロ蹄疫病毒0ZK/93-08株(购买自国家农业部指定的ロ蹄疫病毒保藏机构国家ロ蹄疫參考实验室)的总RNA，分别用Z2-2、Z3-2和Z4-2引物，合成第一链cDNA。以第ー链cDNA为模板，用4对引物Zl/Zl-2、Z2/Z2-2、Z3/Z3-2和Z4/Z4-2，扩增获得4个相互重叠的cDNA双链片段，分别命名为ZlcDNA、Z2cDNA、Z3cDNA和Z4cDNA片段。Z3cDNA和pBluescript II SK-质粒载体(Invitrogen公司)分别用XbaI和BglII消化后连接，得到重组质粒PSK-Z3。Z4cDNA和pBluescript II SK-质粒载体分别用Bglll/Notl消化后连接，得到重组质粒PSK-Z4。利用QuikChangeOLightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene 公司)定点突变试剂盒，以引物对T1/T1-2和T2/T2-2进行定点突变引入分子标签。分别依次突变了重组质粒PSK-Z3中2985位的NotI位点和4238位的BglII位点，得到阳性重组质粒 p0ZKF-Z3。ZlcDNA和Z2cDNA混合作模板，用一对引物Z1/Z2-2进行融合PCR，得Z12cDNA。Z12cDNA与pMD20-T质粒(大连宝生物公司)连接，得到重组质粒pMD_Z12。pMD_Z12和pBluescript II SKhdv质粒载体(Invitrogen公司)分别用KpnI/Xbal双酶切消化后，纯化回收相应的目的片段，连接得到重组质粒P0ZKF-Z12。用Bglll/Xbal分别双酶切消化重组质粒P0ZKF-Z12和p0ZKF-Z3，纯化回收相应的目的片段，连接得到重组质粒p0ZKF_Z123。最后用Bglll/Notl消化重组质粒p0ZKF-Z123和Z4cDNA片段，纯化回收，连接得到含ロ蹄疫病毒0ZK/93-08株全基因组cDNA克隆的重组质粒p0ZKF_Z1234。测得p0ZKF_Z1234的核酸序列见SEQ ID NO :1，即ロ蹄疫病毒0ZK/93-08株全基因组序列(SEQ ID N0:1;结构蛋白VPl基因序列位于3228-3867，3A蛋白基因序列位于5332-5760，3A的91 114位氨基酸编码序列位于5602-5643 )。ニ、置换VPl基因和缺失3A蛋白91 114氨基酸编码区的O型ロ蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒构建考虑到近年的ロ蹄疫优势流行毒为緬甸98系，为增强本发明的适用性，将P0ZKF-Z1234中ロ蹄疫病毒的主要抗原表位区VPl基因置換，并缺失3A蛋白91 114氨基酸编码区。设计合成下列寡核苷酸引物(用于构建嵌合緬甸98病毒VPl序列所用的引物)并由上海桑尼有限公司合成E2888 (+) CAACCTACACTTCATGTTCACAGG(SEQ ID NO 16)MQVPl(-) CTCGCCTGTCGAAGTGGTCTGCGTGCGGGCGTCAAC(SEQ ID NO 17)MQVP1(+) GTTGACGCCCGCACGCAGACCACTTCGACAGGCGAG(SEQ ID NO :18)MQVP2(-) CTTGAGGAGGTCGAAGTTCAGAAGCTGTTTTGCGGG(SEQ ID NO :19)MQVP2(+) CCCGCAAAACAGCTTCTGAACTTCGACCTCCTCAAG(SEQ ID NO :20)
E4183(-) ACCGGTGTCAGCTAGCATGA(SEQ ID NO :21)0Z5269 (+) CAAGAAGTGATTGAGCGGGT(SEQ ID NO :22)0ZD91(-) GCGCTGGCGCCACTCGCCTCCAGTGAGTCATCCACTGACT(SEQ ID NO :23)0ZD91(+) AGTCAGTGGATGACTCACTGGAGGCGAGTGGCGCCAGCGC(SEQ ID NO :24)0Z681K-) TTTGTCCTCTTCAGACATCT (SEQ ID NO :25)I)根据样品量，按下表列量混合试剂进行反转录；
权利要求
1.一种O型口蹄疫分子标记疫苗，其特征在于，标记疫苗种毒为rV-0/3Ad病毒，rV-0/3Ad的基因组序列为SEQ ID NO :2，所述rV_0/3Ad病毒含3A 91 114位氨基酸的缺失，并且含有緬甸98 VPl氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述的O型口蹄疫分子标记疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤A1、0型口蹄疫病毒基因组RNA全长cDNA重组质粒构建；A2、置换VPl基因和缺失3A蛋白91 114氨基酸编码区的O型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒构建；A3、拯救缺失3A蛋白91 114位氨基酸编码区的基因工程病毒，作为标记疫苗种毒；A4、利用针对3A蛋白91 114氨基酸的单克隆抗体建立的竞争ELISA方法可以鉴别该疫苗毒株免疫动物与口蹄疫病毒自然感染动物。
全文摘要
本发明公开了一种O型口蹄疫分子标记疫苗，标记疫苗种毒为rV-O/3Ad病毒，rV-O/3Ad的基因组序列为SEQ ID NO2，所述rV-O/3Ad病毒含3A 91～114位氨基酸的缺失，并且含有缅甸98 VP1氨基酸序列。用本发明方法得到的疫苗免疫动物5次后，动物血清中检测不到缺失3A 91～114位优势表位的抗体。因此，用本发明方法得到的疫苗免疫动物，能准确区分感染动物和免疫动物。
文档编号A61P31/14GK102614507SQ20121003598
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者付元芳, 刘在新, 包慧芳, 卢曾军, 孙普, 曹轶梅, 李冬, 李平花, 殷宏, 白兴文, 谢宝霞, 陈应理 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所