用于体内递送多核苷酸的多缀合物的制作方法

专利名称：用于体内递送多核苷酸的多缀合物的制作方法
用于体内递送多核苷酸的多缀合物本申请是申请日为2007年8月17日、发明名称为“用于体内递送多核苷酸的多缀合物”的中国专利申请200780029802. 3 (国际申请号PCT/US2007/076202)的分案申请。相关申请的交叉参考本申请要求2006年8月18日提交的美国临时申请号60/822，833和2007年5月3日提及的美国临时申请号60/915，868的优先权。
背景技术：
多核苷酸和其他膜不透性化合物向活细胞的递送受到细胞的复杂的膜系统的高度限制。用于反义和基因治疗的药物是相对较大的亲水聚合物并且通常也是带大量负电荷的。这两种物理特征阻碍了它们经细胞膜的直接扩散。为此原因，多核苷酸递送的主要障 碍是多核苷酸向细胞内部的递送。已经开发了多种转染试剂在体外将多核苷酸递送到细胞。然而，在体外有效的转染试剂的毒性、血清相互作用和弱的寻靶作用使得多核苷酸的体内递送复杂化。在体外良好运行的转染试剂、阳离子聚合物和脂类通常去稳定化细胞膜并形成大的颗粒。转染试剂的阳离子电荷促进了核酸结合以及细胞结合。膜的去稳定化促进了膜不透性多核苷酸经细胞膜的递送。这些性质使得转染试剂在体内无效或有毒性。阳离子电荷导致与血清组分的相互作用，其引起多核苷酸-转染试剂相互作用的去稳定化和弱的生物利用度和寻靶作用。阳离子电荷也可以导致体内毒性。在体外有效的转染试剂的膜活性通常导致体内毒性。对于体内递送，转染复合体(与待递送的核酸结合的转染试剂)应该是小的，直径小于IOOnm,并且优选小于50nm。甚至小于20nm或小于IOnm的更小的复合体将是更有效的。大于IOOnm的转染复合体在体内基本上不能接近除了血管细胞之外的细胞。体外复合体也是带正电荷的。该正电荷对于复合体与细胞的附着和膜融合、去稳定化或破坏是必须的。体内转染复合体上的阳离子电荷导致不利的血清相互作用并且因此导致弱的生物利用度。接近中性或负电荷的复合体将具有更好的体内分布和寻靶能力。然而，体外转染复合体通过电荷-电荷(静电)相互作用与核酸结合。带负电荷的聚合物和脂类不与带负电荷的核酸相互作用。此外，这些静电复合体当暴露于生理盐浓度或血清组分时倾向于聚集或瓦解。最后，在体外有效的转染复合体通常在体内是有毒的。用于转染的聚合物和脂类破坏或去稳定化细胞膜。用核酸递送平衡该活性在体外比在体内更容易达到。尽管一些研究小组已经在改善体内基因向细胞的递送方面取得了不断的进步，但是仍然需要将多核苷酸与递送剂一起有效递送到靶细胞而没有与体内施用转染试剂相关的毒性的制剂。本发明使用生物学不稳定的缀合物递送系统提供了将多核苷酸递送到细胞并释放的组合物和方法。发明概述在优选的实施方案中，本发明描述了用于在体内将多核苷酸递送到细胞的组合物，其包含与多核苷酸可逆地缀合的可逆掩蔽的膜活性聚合物。聚合物通过一个或多个第一种可逆共价连接连接到一种或多种掩蔽剂并且通过一个或多个第二种可逆共价连接进一步连接到一种或多种多核苷酸。第一种和第二种可逆共价连接可以包含在相同或相似的条件下被切割的可逆键或者它们可以在不同的条件下被切割，即它们可以包含正交(orthogonal)可逆键。对哺乳动物施用可药用载体或稀释剂中的多核苷酸-聚合物缀合物。 在优选实施方案中，公开了膜活性聚合物，其包含聚乙烯醚随机共聚物。可以从两种、三种或多种不同的单体合成聚乙烯醚共聚物。单体可以选自受保护的氨基乙烯醚，如含有苯二甲酰亚氨基的乙烯醚、丁基乙烯醚、十二烷基乙烯醚、十八烷基乙烯醚。优选的聚乙烯醚随机共聚物包含三种单体含有胺的单体、丁基乙烯醚和十八烷基乙烯醚。在优选实施方案中，膜活性聚合物的一种或多种生物物理学特征通过掩蔽剂可逆地屏蔽或修饰。掩蔽剂可以选自位阻稳定剂、寻祀基团(targeting groups)和电荷修饰齐U。掩蔽剂可以通过抑制聚合物与血清组分或非靶细胞的非特异性相互作用而改善聚合物-多核苷酸的生物分布或寻靶作用。掩蔽剂也可以减少聚合物或聚合物-多核苷酸缀合物的聚集。含有寻靶基团的掩蔽剂可以通过将缀合物系统靶向细胞表面受体而增强细胞特异性寻靶作用或细胞内化。在聚合物缀合到多核苷酸之前或之后，可以将掩蔽剂缀合到膜活性聚合物。在优选实施方案中，使用所述的缀合物系统可以被递送到细胞的多核苷酸可以选自DNA、RNA、封闭性多核苷酸、反义寡核苷酸、质粒、表达载体、寡核苷酸、siRNA、微RNA、mRNA、shRNA 和核酶。在优选实施方案中，掩蔽剂和多核苷酸通过可逆连接共价连接到膜活性聚合物。尽管聚合物的掩蔽和多核苷酸与聚合物的连接是重要的，但是这些连接可以干扰聚合物的转染活性或多核苷酸的活性。通过经由可逆连接将掩蔽剂和多核苷酸连接到聚合物，所述可逆连接在合适的时间被切割，聚合物恢复活性并且多核苷酸被释放。可逆的共价连接含有可逆的或不稳定的键，其可以选自生理学不稳定的键、细胞生理学不稳定的键、pH不稳定键、非常pH不稳定键、极端pH不稳定键、酶可切割的键和二硫键。将聚合物连接到多核苷酸和掩蔽剂的两种可逆连接的存在提供了多核苷酸与递送聚合物的共同递送和掩蔽剂对递送聚合物的选择性寻靶作用和失活。连接的可逆性提供了多核苷酸从膜活性聚合物的释放和膜活性聚合物的选择性活化。在优选实施方案中，我们描述了一种组合物，其包含递送聚合物，其a)通过一种或多种可逆连接共价连接到一种或多种寻靶基团、位阻稳定剂或电荷修饰剂；和b)通过一种或多种可逆连接共价连接到一种或多种多核苷酸。在一个实施方案中，寻靶作用剂、位阻稳定剂或电荷修饰剂的可逆共价连接与多核苷酸可逆共价连接是正交的。在优选实施方案中，我们描述了聚合物缀合系统，其用于将多核苷酸递送到细胞并将该多核苷酸释放到细胞中，所述聚合物缀合系统包含可逆地缀合到膜活性聚合物的多核苷酸，所述膜活性聚合物自身可逆地缀合到掩蔽剂。缀合键可以是相同的或者它们可以是不同的。此外，缀合键可以在相同或不同条件下被切割。在优选实施方案中，我们描述了聚合物缀合系统，其用于将膜不透性分子递送到细胞并在细胞中释放分子。聚合物缀合系统包含可逆地连接到膜活性聚合物的膜不透性分子，其中多种掩蔽剂通过可逆的共价键连接到膜活性聚合物。膜活性聚合物当在体内应用时可以是无毒的或者可以不是被靶定的。掩蔽剂的可逆连接可逆地抑制或改变了聚合物的膜相互作用、血清相互作用、细胞相互作用、毒性或电荷。优选的可逆共价键包含不稳定键、生理学不稳定键或在哺乳动物细胞内条件下可被切割的键。优选的不稳定键包含pH不稳定键。优选的PH不稳定键包含马来酰胺酸键。另一优选的不稳定键包含二硫键。膜不透性分子包括但不限于多核苷酸、蛋白质、抗体和膜不透性药物。在优选实施方案中，在过量聚合物存在下将多核苷酸连接到聚合物。过量聚合物可以有助于多核苷酸-聚合物缀合物的配制。过量聚合物可以在缀合物配制期间减少缀合物的聚集。可以在将缀合物施用于细胞或生物前将多核苷酸-聚合物缀合物与过量聚合物分离。备选地，多核苷酸-聚合物缀合物可以与过量聚合物共同施用于细胞或生物。过量聚合物可以与所述聚合物是相同的或者它可以是不同的。在优选实施方案中，本发明的聚合物缀合物可以用于体外递送多核苷酸或其他膜不透性分子。对于体外递送，聚合物的可逆掩蔽增强了一些否则无效的多胺如聚赖氨酸的转染活性。可逆掩蔽也可以通过减小其他膜活性聚合物的毒性或将它们的膜破坏性特征限制于内体而增强所述其他膜活性聚合物的效用。在优选实施方案中，我们描述了用于在体内将多核苷酸递送到细胞的系统，其包含将寻靶基团共价连接到多核苷酸，将第二种寻靶基团共价连接到膜活性聚合物，并将多核苷酸和膜活性聚合物注射到生物中。当结合附图考虑时，本发明的其他目的、特征和优点根据下面的详细描述将是显而易见的。附图简述图I.聚乙烯醚聚合物聚合的反应方案。图2.阐明本发明的掩蔽剂的几种实施方案的附图。图3.简图，图解了多核苷酸-聚合物可逆缀合物和通过马来酰胺酸对缀合物的可逆掩蔽。图4.显微照片，显示了用A) CDM-PEG (左)或B) CDM-PEG加CDM-Pip-LBA掩蔽的PBAVE聚合物的肝脏肝细胞的定向递送。图5.显微照片，显示了在体内掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物向肝细胞的递送。图6.曲线图，图解了 ppara siRNA的多缀合物介导的递送后体内靶基因降低(knockdown)。图7.显微照片，显示了 用(A)DNA-DWl360-CDM-PEG/NAG，(B)DNA+DW1360-CDM-PEG/NAG(未缀合到聚合物的多核苷酸)，(C)DNA-DWl360-CDM-PEG/ 葡萄糖，和(D) DNA-DWl360-CDM-PEG/甘露糖在体内将ds DNA向肝脏的递送。Cy3_标记的DNA =每个小图中的左上象限，AIEXA -488鬼笔环肽染色的肌动蛋白=右上象限，细胞核=左下象限，复合图=右下象限。图8.图和印迹，图解了静脉内注射siRNA多缀合物后小鼠的肝脏中靶基因表达的降低。(A)用apoB siRNA多缀合物处理后肝脏中apoBmRNA水平的降低。(B)apoB siRNA多缀合物处理的小鼠中apoB-100蛋白的血清水平。(C)静脉内注射ppara siRNA多缀合物后肝脏中ppara mRNA水平的降低。 图9.图表，图解了 apoB-lsiRNA多缀合物剂量反应。(A)注射apoB-lsiRNA多缀合物的连续稀释液后apoB mRNA的降低。(B)注射不同量的siRNA后apoB mRNA的降低。


图10.图表，图解了 apoB-lsiRNA多缀合物处理的小鼠中胆固醇水平。图11.显微照片，显示了(A)ApoB siRNA或(B)GL3阴性对照siRNA，或(C)仅盐水的多缀合物递送后小鼠肝脏中的脂类积累。图12.图表，图解了在第O天在小鼠 中施用apoB-lsiRNA缀合物后第2_15天，基因表达的抑制(A)和引起的血清胆固醇的降低(B)。图13.显微照片，显示了通过施用可逆地缀合到DW1360并用CDM-PEG和CDM-NAG掩蔽的抗体，体内递送抗体到肝细胞。左上象限显示了经标记的抗体，右上象限显示了肌动蛋白，左下象限显示了细胞核，右下象限显示了复合图。图14.图表，其图解了在用商业体外转染试剂或用不同量的ApoBsiRNA多缀合物递送的ApoB siRNA转染的原代肝细胞中的基因降低。图15.图表，图解了在体外siRNA-缀合物对H印a_lclc7细胞的转染仅仅缀合物=掩蔽的 siRNA-PLL。图16.图表，图解了 PBAVE存在下DPH的荧光。图17.图表，图解了 A)在Shodex SB-803柱上PEG标准品的洗脱图，B) ShodexSB-803柱的校准图，和OPBAVE聚合物的分子量计算。图18.图表，图解了 A)Cy3标记的核酸标准品和掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物的洗脱图，B) Sephacryl S-500大小排阻层析的校准图，和C)掩蔽的多核苷酸-聚合物缀合物的分子量计算。图19.显微照片，显示了使用寡核苷酸-聚合物-CDM/PEG/NAG缀合物(A，C)或寡核苷酸-聚合物-CDM/PEG/葡萄糖缀合物(B，D)，体内多核苷酸递送到小鼠半乳糖受体阳性肿瘤(A-B)或半乳糖受体阴性肿瘤(C-D)。发明详述本发明涉及可用于将多核苷酸或其他细胞不透性分子递送到哺乳动物细胞的化合物、组合物和方法。本文描述了用于在体内将多核苷酸或其他膜不透性分子递送到细胞的多缀合物(polyconjugate)系统。多缀合物系统将寻靶、抗调理作用、抗聚集和转染活性掺入到小的50纳米以下的递送载体。该系统的关键组分是连接组分部分的键的可逆性。所述的体内多核苷酸递送缀合物的第一个组分包含该多核苷酸与膜活性聚合物的生理学上可逆的共价连接。多核苷酸与膜活性聚合物的共价连接确保了在血清存在下体内或离体(ex vivo)施用时，多核苷酸不容易与聚合物解离，从而提供了多核苷酸与膜活性聚合物向靶细胞的共同递送。然而，多核苷酸与聚合物的共价连接可以使得多核苷酸无活性。因此，通过生理学上可逆的连接或者键完成多核苷酸与膜活性聚合物的连接或键。通过使用生理学可逆的连接，多核苷酸可以从聚合物被切除，释放多核苷酸参与和细胞组分的功能性相互作用。通过选择合适的可逆连接，可能形成缀合物，其仅在其被递送到希望的位置，如细胞质后释放所述多核苷酸。所述的体内多核苷酸递送缀合物的第二种组分包含膜活性聚合物的可逆修饰。膜活性聚合物的可逆修饰减小了非生产性血清和非靶细胞相互作用并且减小了毒性。掩蔽剂也可以为缀合物增加希望的功能，如增强靶细胞相互作用或增强缀合物的胞吞作用。通过掩蔽剂与聚合物经由生理学可逆的共价连接进行共价连接掩蔽聚合物。掩蔽剂可以是无菌的稳定剂、寻靶基团或电荷修饰剂。掩蔽剂可以掩蔽聚合物防止非特异性相互作用，延长循环时间，增强特异性相互作用，抑制毒性，或改变聚合物的电荷。这些修饰的每一种可以改变聚合物的膜活性，使得经修饰的聚合物不能促进多核苷酸的递送。因此，通过生理学可逆的连接完成掩蔽剂与膜活性聚合物的连接。通过使用生理学可逆的连接，掩蔽剂可以从聚合物被切除，从而暴露聚合物并恢复被暴露的聚合物的活性。通过选择合适的可逆连接，可能形成缀合物，其在已经被递送或靶向希望的细胞类型或细胞位置后恢复膜活性聚合物的活性。本发明包括如下一般结构的缀合物递送系统N-L1-P- (L2-M)y,其中N是多核苷酸或其他细胞不透性分子，L1是可逆连接，P是聚合物，L2是第二 种可逆连接，M是掩蔽剂。掩蔽剂M掩蔽或修饰P的性质或相互作用。y是大于O的整数。优选的聚合物是膜活性聚合物。另一优选的聚合物是转染聚合物。许多掩蔽剂可以连接到单个聚合物。所述许多掩蔽剂可以通过多个可逆连接连接到所述聚合物。当可逆连接L2切割时，聚合物P恢复被掩蔽的性质或相互作用。掩蔽剂M可以为聚合物P增加活性，如细胞受体结合。L1的可逆键可以与L2的可逆键是相同或不同的(正交的)。选择可逆连接L1或L2的可逆键使得在希望的生理条件下，如存在于希望的组织、器官和亚细胞位置中的生理条件下或应答药学上可接受的外源试剂的加入下发生切割。多核苷酸N和掩蔽剂M可以在沿着聚合物P的长度的任何位置处连接到聚合物P。聚合物聚合物是通过称作单体的较小单位重复键合形成的分子。聚合物可以是线性的、分枝网络状的、星形的、鸡冠状或梯形的。聚合物的主链由原子组成，所述原子的键是聚合物长度增长所需的。例如，在聚-L-赖氨酸中，羰基碳、α-碳和α-胺基是聚合物长度所需的并且因此是主链原子。聚合物的侧链由这样的原子组成，所述原子的键不是聚合物长度的增长所需的。聚合物可以是均聚物，其中使用一种单体或者聚合物可以是共聚物，其中使用两种或多种不同的单体。共聚物可以是交替的、随机的(统计学的)、嵌段或接枝的(鸡冠状)。交替聚合物含有确定的重复顺序的单体，如-[Α-Β]η_。交替聚合物的单体通常不均聚化，而是一起反应产生交替共聚物。随机共聚物中的单体沿着任何给定链没有确定顺序或排列，如-AnBm_。此类聚合物的一般组成反映了输入单体的比例。然而，一种单体与另一种单体的精确比例可以在链之间不同。单体的分布可以沿着单一聚合物的长度不同。而且，单体的化学性质可以影响其掺入随机共聚物中的速率和它在聚合物内的分布。从而，尽管随机聚合物中单体的比例取决于单体的输入比例，但是输入比例可以不精确地匹配掺入的单体的比例。嵌段聚合物具有一种聚合物(聚合物A)的一段或嵌段接着是第二种聚合物(聚合物B)的一段或嵌段即-聚A-聚B-。结果是不同的聚合物链以从头至尾的构型连接。从而，嵌段聚合物是不同单体成分的嵌段的线性排列。通常(尽管不是必需的)，聚合物嵌段是均聚物，聚合物A由不同于聚合物B的单体组成。二嵌段共聚物是聚A-聚B，三嵌段共聚物是聚A-聚B-聚A。如果A是亲水基团并且B是疏水基团，那么所得的嵌段共聚物可以被认为是聚合的表面活性剂。接枝聚合物是一种类型的嵌段共聚物，其中一个单体的链被接枝到另一单体的侧链上，如(其中n、m、X、y和ζ是整数):
权利要求
1.用于将RNA干扰多核苷酸体内递送到肝细胞的缀合物递送系统，其包含 其中， P是膜活性多胺， L2是二取代的马来酰胺酸生理学不稳定的键， M1是含有靶向基团的掩蔽剂， M2是含有位阻稳定剂的掩蔽剂， N是RNA干扰多核苷酸， L1是与L2正交的生理学不稳定的共价键， y和ζ是大于或等于O的整数,其中y和ζ的值一起大于P的胺数目的50%, P的膜活性通过经生理学不稳定的键L2连接M1和M2修饰大于50%的P胺而被可逆抑制，并且L2的切割恢复P的膜活性。
2.权利要求I的缀合物，其中所述多核苷酸包含siRNA或者微RNA。
3.权利要求I的缀合物，其中所述多胺大于5kDa。
4.权利要求I的缀合物,其中所述缀合物直径小于20nM。
5.权利要求I的缀合物，其中所述缀合物在pH9下具有O到-20mV的ζ电位。
6.权利要求I的缀合物，其中L2是马来酰胺酸。
7.权利要求6的缀合物，其中靶向基团是半乳糖衍生物。
8.权利要求7的缀合物，其中P-L2-M1具有结构 其中η是I到500的整数。
9.权利要求6的缀合物，其中所述位阻稳定剂是聚乙二醇。
10.权利要求9的缀合物，其中P-L2-M1具有结构其中η是I到500的整数。
11.权利要求I的缀合物，其中所述膜活性聚合物含有两种或更多种不同的单体。
12.权利要求11的缀合物，其中所述膜活性聚合物含有三种或更多种不同的单体。
13.权利要求12的缀合物，其中所述单体选自含有胺的单体、低级烷基单体、丁基单体、高级烷基单体、十二烷基单体和十八烷基单体。
14.权利要求I的缀合物，其中y+z的值大于或等于所述多胺上胺数目的70%。
15.权利要求I的缀合物递送系统，其中所述缀合物递送系统还包含通过生理学不稳定键可逆地共价连接到多种掩蔽剂的过量膜活性多胺，其中所述过量聚合物不共价连接到所述RNA干扰多核苷酸。
16.权利要求I的缀合物递送系统，其中所述缀合物在可药用载体或稀释剂中提供。
17.用于将RNA干扰多核苷酸体内递送到肝细胞的缀合物递送系统，其通过包含如下步骤的方法形成 a)形成膜活性多胺； b)形成第一种掩蔽剂，其包含含有寻靶基团的二取代的马来酐； c)形成第二种掩蔽剂，其包含含有位阻稳定剂的二取代的马来酐； d)通过与马来酰胺酸键正交的生理学不稳定的共价键将所述RNA干扰多核苷酸连接到所述多胺； e)可逆地抑制膜活性多胺的膜活性，其中抑制由通过将所述多胺与所述第一种和第二种掩蔽剂反应修饰所述多胺上50%或以上的胺组成。
18.权利要求17的缀合物递送系统，其中所述寻靶基团是半乳糖衍生物并且所述位阻稳定剂是聚乙二醇。
19.权利要求18的缀合物递送系统，其中所述半乳糖衍生物是N-乙酰半乳糖胺。
全文摘要
本发明涉及用于向哺乳动物细胞递送多核苷酸或其他细胞不透性分子的化合物、组合物和方法。描述了多缀合物系统，其向小的生物相容的体内递送载体中掺入寻靶、抗调理作用、抗聚集和转染活性。连接组分部分的多个可逆连接的使用提供了生理学应答活性调节。
文档编号A61P35/00GK102614528SQ20121011107
公开日2012年8月1日 申请日期2007年8月17日 优先权日2006年8月18日
发明者A·布洛欣, D·B·罗森玛, D·H·韦克菲尔德, D·L·刘易斯, H·赫维耶, J·A·沃尔夫, J·E·哈格斯特伦, J·克莱因, S·翁, V·特鲁别茨科伊 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司