专利名称：p-p38抑制剂SB203580的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及p-p38抑制剂SB203580的应用。
背景技术：
东亚甜蝎(Scorpion Buthus martensi Karsch, BmK)蜜;伤时释放的毒液可引起剧烈疼痛、皮肤水肿和灼热感。作为东亚钳蝎毒液的主要神经毒性多肽成分，BmK I被认为是BmK毒液诱发炎症痛行为的主要因素。足底注射BmK I可诱发大鼠后足水肿、持续两小时的自发痛、维持7天的双侧机械痛敏以及注射足维持3天的热痛 敏。胶质细胞最初被认为在中枢神经系统的起支持作用，但越来越多的证据暗示胶质细胞与神经元之间的交流对话在不同类型的神经系统疾病的发展以及疼痛的发生过程中扮演重要角色。最近研究表明某些疼痛强化状态的发生和维持涉及到脊髓内非神经元细胞(小胶质细胞和星形胶质细胞)的激活。再者，研究显示胶质细胞的抑制剂和调制剂可改善某些异常痛觉敏化。在神经病理性和炎症性动物疼痛模型中激活的脊髓小胶质细胞表现出细胞形态的变化(分支变粗)、胞内基因的表达的变化、吞噬功能、细胞增殖等。激活的胶质细胞可释放多种炎症、信号分子，其中某些信号分子在调制慢性痛的发展过程中发挥了重要的作用。然而，关于小胶质细胞是如何在疼痛状态下激活的还不得而知。丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activatedprotein kinases, MAPKs)作为一类丝/苏氨酸蛋白激酶家族，包括胞外信号调节激酶1/2 (extracellularsignal-regulated kinasel/2, ERK 1/2)、p38、c_Jun N-末端激酶和 ERK5,是 G 蛋白偶联受体下游的信号分子，可将多种胞外刺激转化为多样的胞内应答。脊髓内MAPK信号通路的激活出现在很多种疼痛强化状态中。P38作为MAPK家族的一员，多种胞外信号通过该信号通路整合传递到胞质和核内。不论是在炎症还是神经损伤条件下，越来越多的证据显示脊髓胶质细胞内P38的调制在疼痛的发展和维持中起作用。此外，也有研究表明P38/MAPK信号通路介导炎性细胞因子(如IL-I和TNF)的产生。然而在蝎蛰痛病理条件下，p38信号通路和小胶质细胞激活有着怎样的联系还不甚明了。结合已有的研究，不禁猜想小胶质细胞内P38的激活在中枢敏化中是否发挥作用。为了验证这样的猜想，需要回答以下问题脊髓胶质细胞是否在BmK I诱发的痛相关行为中发挥作用；足底注射BmK I是否可引起p38的激活，其细胞定位情况如何；p38的激活是怎样导致由BmK I诱发的持续机械痛敏和热痛敏的。p38特异性的抑制剂SB203580是吡啶咪唑类的化合物，作为一种可靠的药理学研究工具，其被广泛的应用于P38信号通路在各种病理进程(炎症痛等)中作用的分析研究中。
发明内容
本发明目的之一在于通过分析疼痛病理条件下脊髓内细胞水平和分子水平的时程变化，对比P-P38抑制剂SB203580给药前后的组织形态学和行为药理学的实验结果，在研究P38介导的伤害性感受中枢机制基础上，提供一种p-p38抑制剂SB203580在制备治疗蝎蛰痛药物中的应用。本发明的目的之二在于提供p_p38抑制剂SB203580在缓解蝎蛰诱导的脊髓小胶质细胞敏化中的应用。本发明首先在构建模拟临床的蝎蛰痛模型。研究结果显示p38在脊髓内显示出与小胶质细胞激活时程同步的磷酸化时程，荧光双标实验结果显示P-P38几乎全部与标记小胶质细胞的0X-42共标，提示了小胶质细胞的激活是由p38的磷酸化介导的。进一步运用P-P38特异性抑制剂SB203580药理学干预的手段进行后续研究发现，小胶质细胞的时程激活被显著性抑制。与此同时，行为学测定结果显示表征BmK I疼痛模型建模指标的机械痛敏和热痛敏被鞘内注射SB203580剂量依赖性的抑制。综上所述，p38磷酸化介导的小胶质细胞的激活贡献于BmK I这一疼痛模型的痛相关反应，p_p38特异性的抑制剂SB203580可抑制小胶质细胞的从而缓解BmK I疼痛模型中的痛相关反应。
本发明为由外周伤害所诱发的痛觉中枢敏化提供了理论基础，为研究伤害性感受的细胞分子机制以及治疗策略提供了研究载体，为临床上缓解疼痛的新型药物研究提供了实验依据。SB203580具有成为一种工具药在p38信号通路相关疼痛机制研究中的前景，继而具有开发研制临床上治疗缓解病理性疼痛发生和维持相应药物的潜在前景。
图I为BmK I疼痛模型大鼠L4-L5脊髓内小胶质细胞激活时程。A_H :L4_L5脊髓同侧；a_h L4-L5脊髓对侧。图2为BmK I疼痛模型大鼠L4-L5脊髓内小胶质细胞激活时程柱状统计。图3为BmK I疼痛模型中大鼠L4-L5脊髓内p38的磷酸化时程。A-H :L4_L5脊髓同侧；a_h L4-L5脊髓对侧。图4为BmK I疼痛模型中大鼠L4-L5脊髓内p38的磷酸化时程柱状统计
图5为p-p38的三种类型的细胞定位.B图为星形胶质细胞标记物GFAP，E图为小胶质细胞标记物0X-42,H图为神经元标记物NeuN ;C、F和I共标结果显示p-p38几乎全部表达于小胶质细胞，其他两种细胞类型未见显著共定位。图6为SB203580预处理后L4-L5脊髓内小胶质细胞的激活时程。A-H :L4_L5脊髓同侧；a_h L4-L5脊髓对侧。图7为SB203580预处理后L4-L5脊髓内小胶质细胞的激活时程柱状统计。图8为SB203580预处理后L4-L5脊髓内小胶质细胞的激活时程左右两侧抑制情况的对比。其中A为左侧小胶质细胞激活对比；B为右侧小胶质细胞激活的对比。图9为SB203580药理学干预对痛相关反应的剂量依赖性抑制。A图为对同侧机械痛敏，B图为对侧机械痛敏，C图为同侧热痛敏，D图为对侧热痛敏。
具体实施例方式实施例一 BmK I疼痛模型中大鼠L4-L5脊髓内小胶质细胞的激活时程
大鼠足底皮下注射BmK I后，用戊巴比妥钠(60mg/kg)深度麻醉后灌流。首先从升主动脉灌入200ml的生理盐水，然后换做400ml的4%的多聚甲醛(0. IM的PB缓冲液溶解，pH=7. 4)。取相应时间点的腰椎脊髓用以上甲醛溶液继续固定12小时，之后用20%的蔗糖PB溶液组织脱水(组织沉底即可)，最后用30%的蔗糖PB重复组织脱水。随后将组织冰冻切片(厚度14um)，贴于拨片以供实验。免疫单标采用“抗生物素蛋白一生物素一过氧化物酶(ABC)”法，首先切片用PBS缓冲液(0.01M，pH=7. 4)浸润，然后进行一抗孵育(48 h，4°C)、二抗孵育(2 h，室温)和ABC混合液(I :200)孵育(2 h，室温)，最后用葡糖氧化酶一二氨基联苯胺一镍(DAB)法进行显色。以上孵育过程之间需用PBS缓冲液进行漂洗三次，每次10分钟。经脱水、透明化和封片后，切片方可显微观察。免疫活性数据(阳性面积或者细胞数目)用计算机辅助处理软件(Image-Pro Plus 等)进行分析。该实施案例中所用一抗有抗0X-42小鼠源单克隆抗体(O)Ilb,小胶质细胞标记物，1:50, Santa Cruz公司),所用的二抗为生物素化的羊抗鼠二抗(1:200)。参见图1，和图2。以上结果显示，在脊髓中，小胶质细胞在BmK I疼痛模型建立后的8小时达到激活的高峰(包括细胞数目的增多和胞体分枝的加粗)并在I天时出现回落。以上结果提示脊髓中的小胶质细胞贡献于BmK I疼痛模型。实施例二 BmK I疼痛模型中L4-L5脊髓内p-p38的表达时程。切片制备和结果分析方法见实施例一中介绍。注该实施案例中阳性结果所统计的为P-P38阳性细胞的数目。该实施案例中所用一抗为抗p_p38兔多克隆抗体(1:200，CST公司)所用的二抗为生物素化的羊抗兔二抗(1:200)。参见图3和图4。实验结果显示L4-L5节段的脊髓内，p_p38阳性细胞的个数伴随BmK I疼痛模型的建立有时程性激活，在8小时达到高峰。这与小胶质细胞的激活时程显现出高度相关性。以上结果提示P-P38的激活的细胞定位可能与小胶质细胞有联系。实施例三p_p38在脊髓内的细胞定位
参见图5。切片准备参照实施案例一中的方法。荧光双标试验中，首先切片用PBS缓冲液(0. 01M, pH=7. 4)浸润,然后进行第一种一抗孵育(24 h, 4°C )和二抗孵育(2 h,室温)之后进行第二种一抗的孵育和二抗孵育。以上孵育过程之间需用PBS缓冲液进行漂洗三次，每次10分钟。切片用甘油片后方可在显微镜(Leica)下观察。免疫荧光照片用Image J图像处理软件合成。该实施案例中所用一抗有抗0X-42小鼠源单克隆抗体(CDllb，小胶质细胞标记物，1:50, Santa Cruz公司)、抗GFAP小鼠源单克隆抗体(GFAP,星形胶质细胞标记物，1:300，CST公司)、抗NeuN小鼠单克隆抗体(NeuN，神经元标记物，1:500)和抗p-p38兔多克隆抗体(1:200，CST公司)，所用的二抗为荧光素与吲哚碳菁接合的羊抗兔二抗(CY3)和荧光素与异硫氰酸接合的羊抗鼠二抗(FITC)，1:200。结果显示p-p38阳性结果几乎完全与0X-42阳性的小胶质细胞进行共标，而与NeuN阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞没有明显的共定位。结果提示BmK I疼痛模型中P-P38几乎全部表达于小胶质细胞中，即小胶质细胞中p38的磷酸化贡献于该疼痛模型。上述结果提示我们小胶质细胞的激活和P38的磷酸化，二者之间的关系如何。实施例4 SB203580对p-p38表达量的药理学干预
切片的制备、结果处理分析以及所用抗体见于实施例一。本案例中所用的SB203580是一类特异性抑制P-P38的吡啶咪唑家族抑制剂。作为一种药理学工具广泛应用于研究p38的功能。SB203580 (Sigma公司)用25%的二甲基亚砜溶解，于足底注射BmK I前30分钟行鞘内注射10 um (2 ug、10ug和50ug)。鞘内注射前大鼠首先用乙醚浅麻，然后用微量注射器将药剂注射于L5-L6之间，注射成功以大鼠瞬时的甩尾或者“S”形摆动作为标志。参见图6、图7和图8。以上结果显示BmK I疼痛模型中的小胶质细胞时程激活可被p_p38特异性抑制及SB203580药理学干预而抑制。对比左右侧均有显著性差异。该结果提示，BmK I疼痛模型中小胶质细胞的 激活是依赖于胞内P38磷酸化的。即p-p38依赖性的小胶质细胞的激活发挥作用于该疼痛模型。实施例5 SB203580对BmK I疼痛模型中痛相关行为的药理学干预
为了验证脊髓内P38的磷酸化是否在BmK I疼痛模型中的痛觉敏化中发挥作用，用鞘内注射SB203580药理学干预后，测试机械痛敏和热痛敏。具体实验中，选取建模后的4小时和8小时行为学测试。机械痛敏测试前先将大鼠置于铁丝网(I cm2网格)上，并用树脂测试盒(20*20*30 cm3)将大鼠隔离，适应测试环境30分钟。机械痛敏的测试用压力从0. 6到26克的10根标准化的von Frey纤维分别对大鼠双足进行2_3秒的刺激，每次刺激间隔10秒。阳性反应为大鼠被测足的快速的缩足和退缩，十次刺激中可引起五次以上阳性反应则记录该测试纤维的压力数值。选取最小的数值作为该时间点大鼠机械痛的阈值。热痛测试前先将大鼠置于玻璃板(2 mm)上，并用树脂测试盒(20*20*30 cm3)将大鼠隔离，适应测试环境30分钟。辐射热光源从玻璃板下照射于大鼠足底，产生直径约3 mm的光斑，阳性反应为大鼠被测足快速的缩足和退缩，每次热辐射间隔5分钟，第一次照射数值不作为记录，取随后的5次缩足时间的平均值记为大鼠在该时间点热痛敏的阈值。注最长热辐射刺激不得大于25秒。在对BmK I疼痛模型大鼠进行行为学测试的前一天对大鼠进行痛觉基线的测定。参见图9。以上结果显示，鞘内注射不同计量的SB203580进行预处理后，BmK I疼痛模痛相关行为可被剂量依赖性地显著抑制。综上所述，P-P38所介导的小胶质细胞激活贡献于BmKI疼痛模型中的痛相关反应。运用P-P38特异性抑制及SB203580可抑制BmK I疼痛模型中小胶质细胞的激活从而缓解该模型中痛相关反应。本发明为由外周伤害所诱发的痛觉中枢敏化提供了理论基础，为研究伤害性感受的细胞分子机制以及治疗策略提供了研究载体，为临床上缓解疼痛的新型药物研究提供了实验依据。
权利要求
1.一种p-p38抑制剂SB203580在制备治疗蝎蛰痛药物中的应用。
2.p-p38抑制剂SB203580在缓解蝎蛰诱导的脊髓小胶质细胞敏化中的作用。
全文摘要
本发明目的p-p38抑制剂SB203580的应用。p38磷酸化介导的小胶质细胞的激活贡献于BmKI这一疼痛模型的痛相关反应，p-p38特异性的抑制剂SB203580可抑制小胶质细胞的从而缓解BmKI疼痛模型中的痛相关反应。本发明为由外周伤害所诱发的痛觉中枢敏化提供了理论基础，为研究伤害性感受的细胞分子机制以及治疗策略提供了研究载体，为临床上缓解疼痛的新型药物研究提供了实验依据。SB203580具有成为一种工具药在p38信号通路相关疼痛机制研究中的前景，继而具有开发研制临床上治疗缓解病理性疼痛发生和维持相应药物的潜在前景。
文档编号A61P39/02GK102657649SQ20121013888
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者傅晋, 华黎明, 吉永华, 姜峰, 牛青山 申请人:上海大学