3β,20(S),21-三羟基达玛烷-24-烯在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的用途
【专利摘要】本发明属医药领域，涉及3β,20(S),21-三羟基达玛烷-24-烯在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是3β,20(S),21-三羟基达玛烷-24-烯在制备肿瘤药物耐药逆转剂中的用途。本发明3β,20(S),21-三羟基达玛烷-24-烯是天然产物，经试验证实具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用，可以作为多药耐药逆转剂；也具有增加多药耐药细胞对抗肿瘤药物敏感性的作用，可以作为增敏剂。本发明还提供了抗肿瘤药物和3β,20(S),21-三羟基达玛烷-24-烯联合使用的药物组合物。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。
【专利说明】3后，20 (S), 21-三羟基达玛烷-24-烯在制备肿瘤多药耐药
逆转剂中的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于增敏抗肿瘤药物和逆转肿瘤多药耐药的医药学领域，具体涉及绞股蓝皂苷元3 P，20 (S)，21-三羟基达玛烷-24-烯的新用途，即在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤严重危害人类的生命健康，已成为当今疾病死亡的主要原因之一。恶性肿瘤的主要治疗手段有手术，放疗和化疗。大量的研究表明，恶性肿瘤是一种全身性的疾病而非局部性的病变，因此，相比手术和放疗的局部治疗手段，肿瘤药物治疗即化疗的方法成为治疗肿瘤，延长患者生存时间和提高预后生活质量的重要手段。据统计，肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药性是化疗失败的主要原因，占化疗失败的90%以上。因此寻找能够逆转肿瘤多药耐药性的化合物成为肿瘤治疗亟需解决的严重问题。肿瘤对化疗药物的耐药按照其耐药表型可分为原药耐药(primary drug resistance, PDR)和多药耐药(multidrug resistance, MDR)两大类。前者只对诱导药物产生耐药性；后者则是指肿瘤细胞在接触一种化疗药物以后，不但对该药产生耐药性，而且对其它结构和作用机制不同的化疗药物也产生交叉耐药性。而根据耐药产生的时间和机制不同，又可分为原发耐药(innate resistance)和继发耐药(acquired resistance)【R.Perez-Tomas, Curr MedChem，13(2006) 1859.】。肿瘤的MDR现象产生具有复杂的分子 生物学机制，主要包括药物摄入减少，药物外排增加(主要由P-gp糖蛋白及MRP蛋白介导)，药物作用的靶分子改变，药物灭活酶表达的增加，药物代谢障碍，DNA修复机制障碍或DNA多聚酶活性改变等。在MDR的形成中，这些耐药机制可能单独或联合起作用【T.0zben, FEBS Lett, 580 (2006) 2903.】。近几年来，如何克服MDR成为国内外研究热点。针对不同的耐药机制，药物学家已经研发出一系列肿瘤多药耐药的逆转剂和增敏剂。第一代肿瘤多药耐药增敏剂包括维拉帕米、环孢素、右旋维拉帕米等，它们能够与化疗药物载体竞争结合，从而增强抗癌药物的抗癌活性。但在所需增敏剂量下，这些增敏剂通常具有很强的毒性，能够产生明显的毒副作用，因此并不适宜在临床上使用。尝试去降低他们的毒性也没有得到预期效果。第二代的增敏剂虽然没有发现明显的毒性，但它们能显著影响抗癌药物的药代动力学。目前第三代基于直接抑制载体的多药耐药逆转剂(tariquidar, eye1propyIdibenzosuberane, zosuquidar)已经开发。这些化合物不表现出毒性，不和细胞色素P540反应，也不影响药物的药代动力学。这些逆转剂目前已在临床试验，有望解决部分肿瘤的多药耐药问题。然而这些逆转剂大都存在毒性大，活性低的问题，严重制约了其应用范围【M.Susa, E.Choy, C.Yang, J.Schwab, H.Mankin, F.Hornicek and Z.Duan, J Biomol Screen, 15287.S.S.Winter, D.M.Lovato, H.M.Khawaja, B.S.Edwards, 1.D.Steele, S.M.Young, T.1.0prea, L.A.Sklar andR.S.Larson, J Biomol Screen, 13(2008) 185.A.Katsman, K.Umezawa and B.Bonavida, DrugResist Updat，10(2007) 1.】。因此，寻找新的高效低毒的肿瘤多药耐药逆转剂仍然是肿瘤治疗的难题之一。
[0003]中医药治疗肿瘤的历史源远流长，而且作为现代肿瘤综合治疗的一个重要方面，近年来越来越受到关注【W.C.Cho, Zhongguo Fei Ai Za Zhi, 13190.】。很多研究表明，天然产物中具有很多活性较高毒性较低的抗肿瘤多药耐药的成分。【W.Xu，A.D.Towers, P.Li andj.P.Collet, Eur J Cancer Care (Engl)，15 (2006) 397.】。葫芦科绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)为多年生草本植物,主要分布在日本、韩国、中国和东南亚地区。在日本曾被用来作为甜味剂，在中国也被作为民间医药一直使用。从该植物中提取得到多种与人参皂甙结构相似的达玛烷型甙(绞股蓝皂甙)，至今已经从绞股蓝的各个部分中分离得到超过100种绞股蓝皂甙。药理学研究发现，绞股蓝以及分离的绞股蓝皂甙具有抗肿瘤，降低胆固醇，促进免疫，抗氧化，降血糖和治疗溃疡等多种活性，而对绞股蓝总皂苷的急性、亚急性和慢性毒性研究显示该类化合物的毒性很低。所以绞股蓝皂苷类化合物很适合作为药物研发的先导化合物进行新药开发研究。
[0004]3 ￠,20 (S), 21-三羟基达玛烷-24-烯，亦称为绞股蓝皂苷元3 P，20 (S)，21-三羟基达玛烧-24-烯，英文名3 0，20 (S)，21-trihydroxydammar-24-ene,在本发明中简称为H6，是由绞股蓝皂苷XLIX在碱性条件下水解得到的【Lin JJ, Hsu HY, Yang JS, Lu Kff1WuRS,ffu KC,LaiTY, Chen PY, Ma CY,Wood WG, Chung JG.Phytomedicine;18:1075-1085.D.R.Cao SYX, P.H.Yu, and Y.M.Deng.CN200510100735.】，其分子量为 460.73，分子式为C3tlH52O3, CAS号为17939-12-7.其化学结构见图1。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种小分子化合物H6在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的新用途。
[0006]本发明的另一目的在于提供包含H6和VCR等抗肿瘤药物的抗肿瘤药物组合物在制备用于治疗多药耐药肿瘤药物中`的应用。
[0007]H6的细胞毒作用很微弱，对多种肿瘤细胞的IC5tl均大于50 y M，目前关于其研究相对少。本发明通过随机筛选，发现该天然产物具有逆转MDR的作用。由于其低毒高效，具有很好的应用前景。实验表明，H6能够增强化疗药物对耐药细胞株增殖的抑制效果，逆转耐药作用。例如实施例中显示的，H6能够逆转KB/VCR细胞对VCR的耐药作用，增强VCR对KB/VCR细胞的促凋亡作用，使VCR重新发挥促凋亡作用。H6能够明显克服多药耐药细胞KB/VCR和MCF-7/ADR的耐药性，能够通过影响P-gp糖蛋白的功能，逆转肿瘤多药耐药细胞的耐药特性，增强化疗药物对耐药肿瘤细胞的治疗效果。
[0008]本发明提供了 H6在制备抗肿瘤药物的耐药逆转剂(Reversal agent)中的应用。
[0009]所述的肿瘤可以是对化疗药物产生耐药性的口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌或胰腺癌等各种肿瘤。所述的肿瘤细胞可以是对化疗药物产生耐药性的口腔癌、乳腺癌、肝癌或者宫颈癌的肿瘤细胞。例如，实施例中所采用的多药耐药细胞KB/VCR和MCF-7/ADR。H6对于由于药物代谢加速导致的耐药性有显著效果，尤其适用于通过P-gp糖蛋白进行药物代谢的肿瘤细胞。
[0010]所述的抗肿瘤药物可以是抗肝癌药物、抗口腔癌药物或者抗肺腺癌药物，可以是细胞周期特异性药物(CCSA)，如长春新碱、紫杉醇等，也可以是柔红霉素、5-氟尿嘧啶等细胞周期非特异性药物(CCNSA)。
[0011]所述的抗肿瘤药物耐药逆转剂可以被制成任何一种药学上可接受的剂型，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂等。
[0012]本发明还提供了 H6在制备抗肿瘤药物的增敏剂(sensitizer)中的应用。
[0013]H6能够克服耐药细胞株的耐药性，增加肿瘤细胞株对药物的敏感性，增强VCR对KB/VCR细胞的促凋亡作用。H6可以增加罗丹明123在KB/VCR细胞内的蓄积，刺激P_gp蛋白的ATP酶活性。
[0014]本发明中所述的抗肿瘤药物的耐药逆转剂或增敏剂的活性成分是H6。
[0015]本发明还提供了一种抗肿瘤药物组合物，该组合物包括H6和抗肿瘤药物。所述的抗肿瘤药物可以是长春新碱、紫杉醇等细胞周期特异性药物(CCSA)，也可以是柔红霉素、5-氟尿嘧啶等细胞周期非特异性药物(CCNSA)。H6也可以与外科手术联合使用，与一种或多种西药联合使用，与中草药联合使用，与放射性治疗联合使用。
[0016]本发明的一个实施例中，H6能够增强VCR对KB/VCR细胞的促凋亡作用，能够逆转KB/VCR细胞对VCR的耐药作 用，使VCR重新发挥促凋亡作用。由于VCR本身是一个微管抑制剂，可以引起微管的解聚，引起细胞发生凋亡，使处于sub-Gl期的细胞增多。为此，本发明用流式细胞术检测了 H6对VCR诱导的耐药株细胞的凋亡的影响。如图3所示，KB/VCR细胞经过10 u MH6或者IOOnM VCR单独处理48h后，处于sub_Gl其的细胞即发生凋亡的细胞所占的比例约为1%。当KB/VCR细胞经过10 ii M或者20 ii M的H6与IOOnM的VCR —起共同处理后，发生调亡的细胞比例分别为9.8%和15.1%，是IOOnM VCR单独处理时的10倍和15倍。因此，H6可以显著增强VCR诱导的KB/VCR细胞的凋亡，并且这种作用随着H6浓度的增加而增强。在对KB细胞的试验中，未发现相似的现象。
[0017]另一方面，本发明提供了一种增加体外培养的多药耐药肿瘤细胞对化疗药物敏感性的方法，即在多药耐药肿瘤细胞的培养基中加入H6。
[0018]所述的肿瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、肺腺癌或胰腺癌。所述的肿瘤细胞可以是对化疗药物产生耐药性的口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌或胰腺癌等各种肿瘤细胞。例如，实施例中所采用的多药耐药细胞KB/VCR和MCF-7/ADR。
[0019]对肿瘤细胞加药后，培养基中H6的浓度可以大于20 PM，甚至大于50 PM。但是，即使培养基中H6的浓度较低，例如5-20 u M，甚至接近于但不包含0 ii M的时候，H6依然能够起到抗肿瘤药物的多药耐药逆转剂或者增敏剂的作用。
[0020]本发明的小分子化合物H6可以采用各种常规的制备方法制备。例如，可从植物(例如，绞股蓝)中分离纯化或者人工化学合成的方法。
[0021]利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与H6发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。
[0022]本发明及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于):肌内、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。
[0023]以本发明的H6为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的H6可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约I微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的H6还可与其他治疗剂一起使用。
[0024]当本发明的H6被用作药物时，可将治疗有效剂量的H6施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地剂量是约10微克/千克体重毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0025]本发明提供了 H6在制备抗肿瘤药物中的应用。H6是天然产物，在高剂量时能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。实验表明，H6能够明显克服多药耐药细胞KB/VCR和MCF-7/ADR的耐药性，能够通过影响P-gp糖蛋白的功能，逆转肿瘤多药耐药细胞的耐药特性，增强化疗药物对耐药肿瘤细胞的治疗效果。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是H6的化学结构。
[0027]图2显示H6可以使KB/VCR细胞重新恢复对VCR的敏感性，
[0028]其中，A图和C图表示当10 ii M的H6或者10 ii M VPL和不同浓度的VCR联合使用对KB/VCR细胞增殖的影响，B图和D图表示10 ii M的H6或者10 y M VPL和不同浓度的VCR联合使用对KB细胞增殖的影响。图中横坐标表示VCR的浓度，纵坐标显示的是细胞的存活率。
[0029]图3显示H6能够增强VCR诱导的KB/VCR细胞的凋亡，
[0030]其中，图A和B显示的是流式细胞仪检测H6对VCR诱导的KB/VCR细胞和KB细胞凋亡的影响。C图和D图分别是对A图和B图的统计结果。
[0031]图4显示H6能够增加罗丹明123在细胞内的蓄积，
[0032]其中，图A和图B显示的是H6对罗丹明123在KB和KB/VCR细胞内蓄积的影响的流式检测结果，图中VPL为阳性对照。图C是对图A和图B的统计结果。D图是在荧光显微镜下观察到的H6对罗丹明123在KB和KB/VCR细胞内蓄积的影响。a和b分别为未经任何处理的KB和KB/VCR细胞，c和d分别为经过10 ii M的VPL和H6处理3h之后的KB/VCR细胞。
[0033]图5显示H6能够促进P-gp蛋白的ATP酶活性，
[0034]横坐标表示H6的浓度，纵坐标为重组人类P-gp蛋白膜组分经H6处理后测得的冷光值与Na3VO4处理后的冷光值的差值，即该样品冷光值的相对变化值(ARLU)，通过计算A RLU可以显示反应体系中ATP的消耗情况，从而反映H6对P-gp蛋白的ATP酶活性的影响。【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不
再一一累述。
[0036]实施例1:CCK_8试剂盒检测H6的细胞毒性
[0037]实验材料:
[0038]H6提取自葫芦科植物绞股蓝，纯度不低于95%。人肝癌细胞株H印G2、人肝癌细胞株SMMC-7721、人肝癌细胞株H印3B、人白血病细胞株THP-1、人白血病细胞株K562、未分化的人胃癌细胞株HGC-27、人卵巢癌细胞株SK0V3、人胰腺癌细胞株PANC-1、人结肠癌细胞株SW480、人宫颈癌细胞株HeLa、人肺腺癌细胞株A549、人乳腺癌细胞株MDA-MB-453均购自中科院上海生化细胞所 细胞库。人脐静脉上皮细胞(HUVEC-2C)细胞株购自CascadeBiologies生物技术公司。
[0039]实验方法:
[0040]细胞复苏
[0041]I)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37°C温水中，并不时摇动令其尽快融化。
[0042]2)从37°C水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。
[0043]3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37°C培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。
[0044]细胞传代培养
[0045]人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株SMMC-7721、人肝癌细胞株Hep3B、人白血病细胞株THP-1、人白血病细胞株K562、未分化的人胃癌细胞株HGC-27、人卵巢癌细胞株SK0V3、人胰腺癌细胞株PANC-1、人结肠癌细胞株SW480、人宫颈癌细胞株HeLa、人肺腺癌细胞株A549、人乳腺癌细胞株MDA-MB-45、人乳腺癌细胞MCF-7均培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液或1640培养基中，于5%C02孵箱中培养。HUVEC-2C细胞培养于含有低血清生长因子成分的培养基200 (Cascade Biologies生物技术公司)中。
[0046]每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中生长至约90%汇合度(贴壁细胞)时，按照1:3到1:5的比例传代，约每隔2-4天传代一次。方法如下:
[0047]I)用IX磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次。
[0048]2)加入f 2ml 0.25%胰蛋白酶消化液消化，置于37°C培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。
[0049]3)用含10%Gibco胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。
[0050]细胞冻存
[0051]I)取培养至对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。
[0052]2)弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液(含10%DMS0，40%DMEM和50%Gibico胎牛血清)，冻存液中细胞的最终浓度为0.5-1 X IOVml0用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1-1.5ml。
[0053]3)将冻存管放入冻存盒中置于_80°C，5小时后移入液氮罐中保存。
[0054]CCK-8 实验
[0055]所有细胞按照上述条件培养，待长至对数生长期时，按照3500个细胞/孔的密度接种到96孔板中，24h后加入H6。设9个浓度梯度，每个浓度设3个复孔。细胞在37°C，5%C02条件下培养48小时后，倒掉培养液，每孔加入90 ii L不含血清的培养基和10 ii L CCK-8试剂。37°C反应2h后，酶标仪读取450nm波长的吸光值(OD45tl)15通过计算得到用药组相对于对照组的细胞增殖比率。空白组为不加细胞只加培养基，对照组为加入与药物同体积的DMS0,细胞存活率=(实验组OD450-空白组OD45tl) / (对照组OD45tl-空白组OD45tlX
[0056]IC50是指细胞增殖被抑制一半时所用抑制剂的浓度。这里即为上述细胞存活率为50%时H6的浓度。IC5tl的计算一般需要测定5个以上的剂量效应，再通过曲线拟合得到函数计算而得。
[0057]每次实验至少重复3次。IC5tl值取平均值，并计算其标准差。
[0058]表1H6对正常细胞和多种肿瘤细胞的细胞毒性
【权利要求】
1.3 20 (S)，21-三羟基达玛烷-24-烯在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、肺腺癌、结肠癌或胰腺癌。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抗肿瘤药是长春新碱、柔红霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的30，20(S)，21-三羟基达玛烷-24-烯是抗肿瘤药物的增敏剂。
5.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物组合物包括抗肿瘤药物和3 (6,20 (S), 21-三羟基达玛烷-24-烯。
6.如权利要求5所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是细胞周期特异性药物或者细胞周期非特异性药物。
7.如权利要求5所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是长春新碱、柔红霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。
8.一种促使体外耐药肿瘤细胞增敏的方法，其特征在于，在耐药肿瘤细胞的培养基中加入3 (6,20 (S), 21-三羟基达玛烷-24-烯。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、肺腺癌或者胰腺癌。
【文档编号】A61K31/575GK103446162SQ201210172318
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年5月29日 优先权日:2012年5月29日
【发明者】余龙, 朱恒锐, 刘祖龙, 胡立宏, 刘军华 申请人:复旦大学