专利名称：温经通络方在制备防治奥沙利铂致周围神经毒性副作用药物中的应用的制作方法
温经通络方在制备防治奥沙利铂致周围神经毒性副作用药物中的应用技术领域：
本发明属于运用传统中药经方来治疗和减轻西药尤其是抗肿瘤化疗药物的毒副作用，具体为预防和减轻胃肠道肿瘤常用化疗药物奥沙利钼神经毒性。背景技术：
奥沙利钼(oxaliplatin, 0ΧΑ)是第3代钼类抗肿瘤药物,继顺钼、卡钼之后，目前作为胃肠道肿瘤化疗方案的基础用药之一。奥沙利钼有着高效、低毒的特性，受到临床医生的青睐。但该药有一定的副作用，主要靶器官在骨髓、外周神经及胃肠道。其治疗中所产生的外周感觉神经毒(Chemotherapy-induced peripheral neuropathy, CIPN)较为明显，可累及感觉神经末梢，故限制了奥沙利钼临床疗效的进一步发挥。初始时主要表现为肢体感觉障碍持续不退，随后可出现震荡感受降低、本体感受迟钝、精细分辨力减退、书写及扣钮扣等精细动作有困难等表现。但其与急性神经毒性不同，症状在冷刺激后不会加重。累积用药剂量越多，感觉障碍持续时间越长，故严重的神经毒性反应常常使患者面临减低化疗药物剂量甚至停药的困境，同时对患者的心理、生理和生活质量都可能产生损害。因此如何预防和减轻OXA的神经毒性已引起广泛关注。
发明内容
本发明通过观察CIPN大鼠疼痛行为学变化、脊髓背角与背根神经节NR2B和pNF-H的表达，探讨温经通络方对奥沙利钼致CIPN的防治作用。本发明采用的技术方案为采用温经通络方来防治奥沙利钼致周围神经毒性副作用，温经通络方的原料药组成按重量比为当归1200份、桂枝1000份、细辛500份、芍药900份、地龙1500份、甘草600份。选用52只成年WISTAR雌性大鼠随机分为五组，空白组、模型组、对照组、温经通络方低剂量组和高剂量组。预防性给药7天后，除空白组(n=8)第8天予以腹腔注射5%葡萄糖注射液5ml/kg外,其余4组(n=ll)按照4mg/kg予以腹腔注射奥沙利钼,每周2次。同时空白组、模型组及对照组予0.9%NaCl溶液灌胃(lml/次)，每日I次；温经通络方组予以温经通络方高低剂量煎剂(5ml/kg)灌胃，每日I次；对照组腹腔注射给药甲钴胺104ug/kg，每周两次；持续性给药至d50。每3日称体重，每日观察大鼠给药后反应、饮食、大便；每周MWT测定，热辐射仪对大鼠尾部热痛觉潜伏期的测定。D50解剖每组大鼠，取脊髓、L5背根神经节，用RT-PCR及Western-blot方法检测不同浓度温经通络方对L4-6脊髓NR2B蛋白表达情况的影响；用免疫组化方法观察不同浓度温经通络方对背根神经节(DRG) NF-H蛋白表达情况的影响。
。图2-1体重变化图表。图2-2大鼠机械性缩足阈值变化。图2-3热辐射甩尾反应时间。图2-4大鼠脊髓NR2B mRNA的相对表达量RQ。、
图2-5大鼠DRG pNF-H的表达显微照片(A、B、C、D，100X ) PNF-H的神经元胞体染色(t )，神经节神经纤维(一)。图A :空白组；图B :模型组；图C :低剂量组；图D :高剂量组。图I NR2B/NR1-NMDA受体的拓扑结构和调节位点。
具体实施方式。
实施例I.实验材料
1.I实验动物及分组 雌性WISTAR大鼠52只，体质量(190± 10) g，清洁级，购自上海斯莱克实验动物中心，并饲养于江苏省中医药研究所SPF级实验动物房。以随机数字法均分为空白组、模型组、对照组、温经通络方低剂量组和高剂量组共5组，正常组8只，其余每组11只。动物饲养于安静、通风和空气过滤系统的环境中，保持室温20-25°C，相对湿度40%-60%，自由进食和饮水。为保持动物昼夜生物节律，实验室每日8 00至20 00开灯，20 00至次日8 00熄灯。本实验严格按照国际疼痛学会(IASP)关于应用清醒动物进行疼痛实验研究纲要的要求实施和完成。I. 2实验药物
温经通络方(当归12g、桂枝10g、细辛5g、芍药9g、地龙15g、甘草6g)成人处方生药量为61g (生药低剂量含量5. 59g/ml，高剂量22. 36g/ml),中药均购自江苏省中西医结合医院药房，4°C保存备用；奥沙利钼(艾恒)注射液，50mg,批号11032111，江苏恒瑞医药股份有限公司；甲钴胺(弥可保)注射液，500ug:lml，批号110470A，海南斯达制药有限公司。1.3主要试剂及仪器
上下流引物RatNR2B-F、RatNR2B-R (购自上海英骏生物技术有限公司)；抗NMDAR2B(D15B3)Rabbit mAb 抗体(购自 Cell Signaling Technology 公司)；抗p-NF-H(RT97)Mouse IgG抗体(购自 Santa Cruz 公司);Von frey hairs疼痛触觉测试套件(购自美国 Stoelting 公司)；Tail_Flick Analgesia Meter(购自 Harvard 公司，0MIC433,USA)。2.实验方法
2.I动物分组及奥沙利钼致CIPN模型建立
将52只健康雌性Wistar大鼠适应性喂养5天后称重，随机分为空白组(n=8)、模型组(n=ll)、对照组(n=ll)、温经通络方低剂量组(n=ll)、高剂量组(n=ll)。预防性给药7天后，参照Yuki Mihara[[i]]等的造模方法，除空白组第8天予以腹腔注射5%葡萄糖注射液5ml/kg外，其余4组按照4mg/kg予以腹腔注射奥沙利钼。将奥沙利钼200mg溶于50ml的5%葡萄糖溶液中，终浓度为4g/L，现配现用。腹腔注射给药奥沙利钼4mg/kgd8/9/15/16/22/23/29/30 (根据实验动物与人的药物剂量换算方法，20 mg/kg的大鼠应用剂量近似于的120mg/m2的人体应用剂量，与130mg/m2的奥沙利钼临床单药推荐剂量接近；实验组腹腔注射奥沙利钼30mg/kg，大于临床单药推荐剂量，近似180mg/m2的人体应用剂量)。2. 2 给药空白组、模型组及对照组予0.9%NaCl溶液灌胃(lml/次)，每日I次；温经通络方组予以温经通络方高低剂量煎剂(5ml/kg)灌胃，每日I次；对照组腹腔注射给药甲钴胺104ug/kg，每周两次；持续性给药至d50。大鼠每3日称体重，每日观察大鼠给药后反应、饮食、大便；每周MWT测定，热辐射仪对大鼠尾部热痛觉潜伏期的测定。2.3痛觉行为测试
机械性痛觉超敏参照Chaplan等的方法，以机械性缩足阈值(mechanicalwithdrawal threshold,MWT)来评估小鼠的机械性痛觉超敏。方法是用von Frey纤维细丝(折力梯度分别为I. O、I. 4,2. 0,4. 0,6. 0,8. 0,10. 0,15. Og)以up — down法推算缩足阈值将一有机玻璃箱(22X 12X22)cm。置于金属筛网上，待大鼠在有机玻璃箱中适应15 min后处于静止时，用von Frey纤维细丝垂直刺激大鼠一侧后肢足底中部,持续时间< 4S，大鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。测定时首先从折力2. Og开始，当该 力度的刺激不能引起阳性反应时，则给予相邻大一级力度的刺激；若出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激，如此连续进行，直至出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，每个折力的von Frey纤维细丝均连续测定5次，每次刺激间隔30S，5次当中有3次或3次以上的阳性反应视为有机械痛敏，最大力度为15g，大于此值时记为15g。折合成(4.08、4. 17,4.31,
4.56,4. 74,4. 93,5. 07,5. 18)计算统计。福射热测痛仪(tail-flickanalgesia meter, Harvard 公司，0MIC433, USA):由24V、250W聚光灯泡制成，光线经外罩上的聚光漏斗集中照射于鼠尾，漏斗外口直径为3mm，测痛时外口紧贴鼠尾，当鼠尾产生突然抽搐时，即为甩尾反应阳性，借助秒表记录甩尾反应潜伏时间(以下简称痛阈)，秒表记录最低限度为0.1 S。因各测痛部位之间痛阈无显著差异(P>0. 05)，我们取尾尖部起始的2cm处测痛，反复测痛3次，取平均值。2.4免疫组织化学检测
2.4. I脊根神经节取材和切片制备
D50天后，各组老鼠各取5只，心脏灌注200ml 4°C无菌生理盐水，然后用4%多聚甲醛IOOmL先快后慢灌注固定。取出L4-5背根神经节(dorsal root ganglia,DRG,因为L4-5DRG是支配后肢初级感觉传入神经元聚集地之一)并剥膜。L4-OTRG置于4%多聚甲醛中，4°C过夜后行脱水、浸蜡、包埋。DRG取横切面，厚度4um，37°C过夜，第2天60°C烘烤Ih后，行免疫组织化学步骤。2. 4. 2 DRG pNF-Η的免疫组织化学
连续切片中每隔5张取I张，每个标本取5张，严格按照试剂盒说明行非生物素二步法免疫组织化学检测pNF-H，滴加适当比例(I :100)稀释的抗p-NF-H Mouse IgG抗体，4°C过夜。加入0. OIMKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。2. 4. 3 pNF-H受体表达观察和分析
每只大鼠随机取5张切片，用Olympus显微系统观察，以胞浆内出现黄色或褐色颗粒为阳性细胞，可间接反映细胞NR2B蛋白表达水平。2. 5 RT-PCR
D50天后，各组老鼠各取6只，行脱椎处死，解剖，取出腰段脊髓(L2-4)并剥除硬脊膜，分离后迅速移至-80°C冰箱保存。取100 mg组织样本采用Trizol (Invitrogen US)法抽提RNA, I UgRNA用于cDNA第一链的合成，第一链合成用maxima First strand cDNAsynthesis 试剂盒(Fermentas, us)。按照 Maxima SYBR Green qPCR 试剂盒(FermentasUS)配制20ul反应体系，PCR引物序列如下上流引物RatNR2B-F :TACGGGAGGGATAGGGC，下流引物 RatNR2B-R :GCGAGGGAGGAGAAATG。PCR 在 ABI 7500 PCR 仪上进行，反应程序如下50 V预处理(2min)，95 V预变性(IOmin)，95 V变性(15s)和60°C退火(60s)共40循环。扩增结果采用Λ Λ CT法进行分析。2. 6 WESTERN BLOT 分析
取腰段脊髓(L2-4)并剥除硬脊膜，冷RIPA裂解液冰上研磨5分钟，IOOOprm 4°C离心5分钟，吸取上清液。测每组蛋白样品浓度，加入上样缓冲液，将蛋白浓度调整相等，100°C煮5分钟，使蛋白完全变性。分别灌制分离胶和浓缩胶，根据待测蛋白分子量大小选择分离胶的浓度。样品在浓缩胶中用80V电压，然后改用100V电压在分离胶中分离，卸胶。PVDF膜在甲醇中浸泡15秒，在双蒸水中浸泡2分钟，并和滤纸一起在转膜缓冲液中浸泡5分钟；胶在转膜缓冲液中浸泡半小时后，按滤纸(两层)一胶一PVDF膜一滤纸(两层)的顺序放入转膜装置，排除气泡。100V转膜，根据蛋白分子量调整转膜时间，一般I. 5小时。将膜放入含1% BSA的TBST中室温封闭2小时，用TBST洗去封闭液。一抗室温孵育2小时，TBST洗3次，每次5分钟。用和一抗对应的二抗室温孵育I小时，TBST洗3次，每次5分钟。将膜置于暗示曝光显影，对照Marker记录实验结果。2. 7统计学方法
采用SPSS16. O统计软件包进行数据统计学分析，多组间比较采用One-Way ANOVA方差分析，两组间比较用t检验，以P〈0. 05表示具有统计学意义，P〈0. 01表示具有显著性统计学意义。3.实验结果 3. I体重变化测定
空白组体重随时间平稳上升，开始造模D8后其余各组与空白组相比差异有统计学意义(P〈0. 01)，模型组与用药组差别有显著意义(P〈0. 05)，D35之后，温经通络方组高低剂量组均体重上升，而模型组继续下降，有显著差别(P〈0. 01)。随药物浓度变化，各用药组之间有差异(P〈0. 01)。见表2-1，图2-1。表2-1大鼠体重变化表(g) ( X 土 s)
权利要求
1.温经通络方在制备防治奥沙利钼致周围神经毒性副作用药物中的应用，其特征为该组合物原料药组成按重量比为当归1200份、桂枝1000份、细辛500份、芍药900份、地龙 1500份、甘草600份。
全文摘要
奥沙利铂是第3代铂类抗肿瘤药物，目前为胃肠道肿瘤化疗方案的基础用药。奥沙利铂有着高效、低毒的特性，受到临床医生青睐。但该药有一定的副作用，其治疗中所产生的外周感觉神经毒较为明显，可累及感觉神经末梢，故限制了奥沙利铂临床疗效的进一步发挥。累积用药剂量越多，感觉障碍持续时间越长，故严重的神经毒性反应常常使患者面临减低化疗药物剂量甚至停药的困境，同时对患者的心理、生理和生活质量都可能产生损害。因此如何预防和减轻OXA的神经毒性已引起广泛关注。本发明将温经通络方用于治疗奥沙利铂致周围神经毒性副作用，本发明温经通络方的原料药组成按重量比为当归1200份、桂枝1000份、细辛500份、芍药900份、地龙1500份、甘草600份。
文档编号A61K35/64GK102716206SQ20121022821
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月30日 优先权日2012年6月30日
发明者曹鹏, 王小宁, 胡莹, 蔡雪婷, 霍介格 申请人:江苏省中医药研究院