专利名称：胞壁酰二肽-抗cd20免疫偶联物制备方法及应用的制作方法
技术领域：
:本发明涉及ー种具有靶向结合抗原且具有通过刺激免疫活性细胞发挥抗肿瘤作用的胞壁酰ニ肽-抗CD20免疫偶联物(MDP-Rituximab)，本发明公开了其制备方法，及其在淋巴瘤治疗的作用。
背景技术：
:据世界卫生组织统计，淋巴瘤发病率毎年增长7.5%，是目前发病率增长最快的恶心肿瘤之一。我国淋巴瘤的发病率大约为2/10万人ロ，毎年新发病例2.5万人，死亡2万人，儿童占全国人口的30%，因此，毎年大约有近万新例新发患儿。其死亡率占儿童恶性肿瘤的首位。提高儿童淋巴瘤的诊治水平是广大血液工作者急需解决的问题。90%以上为B细胞淋巴瘤中均有⑶20表达，就目前国内外的治疗状况，儿童恶性淋巴瘤(NHL)的治疗首选仍以联合化疗为主，其治疗效果主要取决于治疗反应。尽管儿童恶性淋巴瘤是可治愈性疾病，但是仍有大约50%以上的NHL患儿发生耐药，导致治疗无效或复发。因此，完全缓解后抗复发治疗或停药后清除耐药肿瘤细胞是治疗NHL急需解决的问题。采用单克隆抗体(MAb)的治疗方法具有有效治疗肿瘤的潜力，且已被用于某些肿瘤的治疗。Maloney等首次将抗⑶20抗体(Rituximab,美罗华)单独应用于I期临床试验治疗复发或低度恶性的B细胞淋巴瘤，1997年美国食品药物管理局(FDA)和1998年在欧洲批准美罗华用于⑶20阳性的复发性或难治性低度恶性或滤泡性B细胞NHL。(Maloney DG,Liies TM, Czerw inski DK, Waldichuk C, Rosenberg J, Grillo-Lopez A, Levy R.PhaseI clinical trial using escalating single-dose infusion of chimeric anti_CD20monoclonal antibody (IDEC-C2B8)in patients with recurrent B-cell lymphoma.Blood1994 ；1584 (8):2457-66.Marcus R,Hagenbeek A.The therapeutic use of Rituximab innon-HodgkinJ s lymphoma.Eur J Haematol Supp1.2007 ； (67):5-14)。B细胞NHL表达的膜抗原有⑶19、⑶20、⑶22、⑶33、⑶37、⑶52等，其中⑶20抗原的表达率达90%以上。⑶20是非糖基化的III型跨膜蛋白，分子量35KD具有高度的保守性，人与鼠的⑶20同源性可达73%，其功能类似于钙离子通道，參与调解B淋巴细胞的生长与分化，是常用于诊断B细胞淋巴瘤的ー种指标。抗体导向治疗具有高效、低毒和靶向性等特点，在恶性血液疾病的治疗中越来越受到关注，Rituximab (美罗华)是第一个被FDA批准用于治疗肿瘤的单克隆抗体，该抗体为人鼠嵌合型IgG抗体。能特异性识别表达⑶20的恶性B淋巴细胞和正常成熟B淋巴细胞，对其它正常细胞并无杀伤作用，因此由最早用于治疗复发及难治性B细胞淋巴瘤，逐渐作为一线药物用于治疗分化差的淋巴瘤和淋巴细胞白血病。其主要通过诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、诱导补体介导的溶细胞作用(CDC)、诱导细胞凋亡等机制发挥抗肿瘤作用，目前Rituximab已治疗了 30多万例病人,单药治疗总反应率约50%,联合化疗有效率高达80%以上。尽管Rituximab治疗B细胞淋巴瘤有明显的疗效，但经过长期治疗后发现，约半数以上病人产生耐药，耐药出现的原因除了肿瘤细胞自身产生耐药性外，还可能存在肿瘤细胞周围免疫环境改变等因素(Rezvani AR, Maloney DG.Rituximab resistance.Best Pract Res Clin Haematol.2011 ;24 (2):203-16.),其中可能涉及:(I)月中瘤本身细胞中⑶20抗原分子減少、集体的FcyRIII受体基因效应细胞的多态性(Cartron G，Dacheux L, balles G, Solal—Celigny P, Bardos P, Colombat P, ffatier H.Therapeuticactivity of numanized anti_CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgbFe receptor FcgammaRIIIa gene.Blood.2002 ;99 (3):754-8) ; (2) ADCC 作用的效应细胞耗竭:Rituximab通过其Fe段招募效应细胞集介导ADCC效应，其中主要起作用的是NK细胞，目前研究显示Rituximab的ADCC作用主要限制因素是NK细胞的耗竭(Bhat R，Watzlし.beriai killing of tumor cells by human natural killer cells-ennancement bytherapeutic antibodies.PLoS One.2007 ；2 (3):e326) ； (3)有关补体调节蛋白异常；(4)抗细胞凋亡基因表达增强有关=Rituximab可与⑶20交叉偶联促进caspases的激活而引起B细胞系死亡，但Bcl-2的过表达倾向于阻碍单抗导致的细胞死亡。虽然⑶20单抗在治疗上还存在这些局限性，且单独应用Rituximab治疗肿瘤的抗体需要量极大，生产价格非常昂贵，半衰期较短决定需反复用药，会増加了患者及其家庭痛苦，但它的高度特异性与低免疫源性决定了其在肿瘤生物靶向治疗中的重要地位，并且随着深入的临床研究，结果表明其在自身免疫疾病的治疗中也发挥着重要作用，因此，目前越来越多的学者致力于探索完善其效能的方法，目前倾向于通过蛋白重组构建结合型抗体(如抗⑶20 与抗 0)22 抗体的重组)(Gupta P, Goldenberg DM, Rossi EA, ChangCH.Multiple signaling pathways induced by hexavalent, monospecmc, ant1-CD20and hexavalent, bispecific, anti_CD20/CD22 humanized antibodies correlatewith enhanced toxicity to B_ce丄丄 lymphomas and leukemias.Blood.2010 ;丄Ib(17):3258-67.)及通过将放免制剂与抗体偶联而增强疗效(如131I/90Y-Rituximab) (Illidge T，Morschnauser F.Radioimmunotherapy in follicular lympnoma.Best Pract Res ClinHaematol.2011 ；24 (2):279-93.)。
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抗肿瘤免疫主要以细胞免疫为主。由于肿瘤细胞缺乏特异性抗原或因特异性抗原的免疫源性差，因此肿瘤的非特异性免疫治疗被广泛地应用于临床。同时，淋巴瘤患儿随着化疗时间的延长，机体的免疫功能进ー步损伤，难以识别或清除残留的肿瘤细胞。因此对长期完全缓解的患儿提高机体的免疫功能是争取治愈的关键。国内外已有大量研究 BRM 如卡介苗(BCG) (Ludwig AT, Moore JM, Luo Y, et al.Tumor necrosislactor-related apoptosis-1nduemg ligand:a novel mechanism for Baci丄IusCalmette-Guerin(BCG)-1nduced antitumor activity.Cancer Res,2004,64 (10):3386-3390.)、细胞因子、胸腺肽、转移因子、寡脱氧核酸(Lee Kff, Jung J，Lce Y，etal.1mmunostimulatory oligodeoxynucleotide isolated from genome wide screeningof Mycobacterium bovis chromosomal DNA.Mol Immunol,2006,43(13):2107-2118)等可改善肿瘤患者机体的免疫状态。Torisu等人对实体瘤患者采用BCG免疫治疗，进行了长达18年的随访观察，发现BCG能明显提高晚期肿瘤患者的免疫功能和生存时间。瘤内注射治疗黑色素瘤，可使50%的瘤体縮小，減少肿瘤转移、延长缓解期，提高生存率。成人粒细胞性白血病经化疗缓解后，加用BCG可維持疗效，可延长生存期。膀胱内注射BCG可降低膀胱癌手术后复发率，延长生存期。1974年Ellouz等发现，结核杆菌细胞壁骨架中的N-こ酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(胞壁酰ニ肽，muramyl dipeptide, MDP)是小分子强效免疫佐剂的最小结构。研究结果表明，MDP及其类似物对免疫系统具有广泛的生理功能，它能激活T细胞、B细胞和巨噬细胞，促进白细胞介素-1的产生，増加体液和细胞的免疫功能，是ー种强有力的免疫佐剂，对抗体、补体的生成和激活都有促进作用。同吋，它还具有抗细菌、真菌、抑制肿瘤等活性(Tanabe T, Chamaillard M, Ogura Y, Zhu L, QiuS, Masumoto J, Ghosh P, Moran A, Predergast MM, Tromp G, Williams CJ, Inohara N,Nunez G.Regulatory regions and critical residues of N0D2 involved in muramy丄dipeptide recognition.EMBO J 2004 ；23 (7):1587-97.)
发明内容
:基于以上研究状况，如对肿瘤细胞的免疫治疗如能像BCG预防結核菌感染一祥，使机体产生特异性的T细胞免疫应答，是免疫治疗最可靠的方法。要实现此方法，本研究以疫苗接种所产生的特异性细胞免疫和单克隆抗体的免疫导向作用为理论依据，将BCG的有效成分MDP与抗淋巴瘤细胞的单克隆抗体Rituximab结合制备成MDP-Rituximab偶联物，了解经BCG免疫后的免疫活性细胞，在MDP-Rituximab偶联物的介导下的体内外的抗肿瘤效果。MDP-Rituximab偶联物并不是通过Rituximab发挥ADCC或Q)C发挥抗肿瘤作用，而是该偶联物保持了 MDP的免疫原性，能刺激机体产生特异性的T细胞免疫应答，借助Rituximab抗体与淋巴瘤细胞膜表面CD20分子结合的免疫导向作用，将MDP带到残留的淋巴瘤细胞周围，通过MDP诱导的T细胞介导的免疫应答达到清除残存肿瘤的最終目的，这样该方法不仅克服了单用Rituximab药物抗性，而且減少了抗体用量，预示其在恶性淋巴瘤中的应用前景。
图1、化合物结构式及制备路线图(nl = 3 ；n2 = 5 ；n3 = 3 ；n4 = 2)图2、各组裸鼠肿瘤大体形态学变化图3、各组裸鼠病理组织变化，1.肝脏(*400) ；2.脾脏(*200) ；3.肿瘤组织(*200) ；4.MDP-Rituximab组；5.LPS组肿瘤组织；(组织内可见散在核固缩、碎裂及溶解，胞衆内有空泡)；6.MDP-Rituximab+LPS组肿瘤组织(组织内可见大量核固缩、碎裂及溶解，胞浆内有空泡)
具体实施方式
:实施例1化合物I 5的制备化合物I的制备以含三个碳原子的连接臂为例。氩气保护下，在IOml烧瓶中，加入Boc保护的连接臂 N-Boc-1，3-丙ニ胺盐酸盐(20mg，0. 12mmol, CAS 号:127346-48-9，Sigma-Aldrich 公司)，用3ml ニ甲基甲酰胺溶解，加入过量的三こ胺，然后加入N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶硫基)丙酸酉旨(SPDP，74mg，0.24mmol, CAS 号:68181-17-9，Sigma-Aldrich 公司)，室温搅拌反应lh，点板检测反应结束，后经过硅胶柱(こ酸こ酯:石油醚=I: I)分离，真空蒸干，得产物化合物 I (19.8mg)。ES1-MS m/z 372.1 [M+H]+.
化合物2的制备
氩气保护下，在10ml反应瓶中，加入化合物l(10mg，0.02mmol)加入1.5ml ニ氯甲烷，冰浴下搅拌lOmin，缓慢加入1.5ml三氟こ酸，冰浴条件下搅拌反应20min，点板检测反应结束，减压浓缩蒸干，并加入适量纯甲醇，再次蒸干，得到化合物2(8.4mg)。ESI/MS m/z271.1[M+H] +化合物3的制备氩气保护下，在IOml反应瓶中，加入胞壁酰ニ肽(MDP，5mg，0.0lmmol，CAS号:53678-77-6, Sigma-Aldrich 公司)、化合物 2 (3mg, CL Ollmmol),用 2ml ニ 甲基甲酸胺和四氢呋喃溶解，冰浴条件下加入1-轻基-7-偶氮苯并三氮唑(1.66mg,0.012mmol, CAS号:39968_33_7)及 N- (3_ _.甲基氣基丙基)_N’ 乙基-碳 二亚胺(2.34mg, 0.012mmoI，CAS号:25952-53-8)搅拌15min，恢复至室温，继续反应2 3h，点板检测反应完全，经硅胶柱(ニ氯甲烧:甲醇=3: I)分离得化合物3,真空蒸干,得化合物3(7.5mg)。ES1-MS m/z746.4[M+H]+.
化合物4的制备IS气保护下，在25ml反应瓶中，加入鼠抗人⑶20单克隆抗体(Rituximab, IOOmg,
0.0Olmmol，Roche/Genetech,美国)，用含有 EDTA(2mmol/l)的 PBS 液(0.lmol/L, PH =8)溶解调整浓度为8mg/ml，然后加入2-亚氨基四氢噻吩(2_IT，1.38mg，0.0lmmol，CAS号:78853-38-0, Sigma-Aldrich公司)，2-1T约对CD20抗体10倍过量，搅拌且室温反应lh，经S^hacryl S-100丙烯葡聚糖凝胶柱分离纯化(水:甲醇=1: 1)，得到化合物4(67.lmg) o ES1-MSm/z 144KD[M+H] +。采用 El Iman ’ s 试剂(IOmM DTNB，CAS 号:69-78-3，Sigma-Aldrich公司)，參照Sigma公司的相关操作说明，25 °C条件下，用Tris缓冲液稀释半胱氨酸标准液配成梯度的稀释液(5.0ml)，其浓度分别为:0.00mM、0.025mM、0.05mM、
0.lmM、0.15mM、0.2mM，于波长 412nm 处测定吸光度值(A)，分别为:0.152,0.172,0.186、
0.224,0.304,0.392,0.42,0.517，绘制半胱氨酸标准曲线。同样条件下测定化合物4 (0.1g/ml)的吸光度为0.36，进而了解化合物4中巯基(-SH)数量，分析得化合物4中巯基数量为5。化合物5的制备氩气条件下，在IOml反应瓶中，加入化合物4(67mg，0.0007mmol)，用2mlPBS (0.lmmol/L, PH = 8)溶液溶解，然后加入化合物3 (1.5mg，0.0021mmol)搅拌，4°C下反应18_24h,点板检测反应完全,经Sephacryl S-100丙烯葡聚糖凝胶柱分离纯化(水:甲醇=I: I)，得到化合物5 (57.lmg)。采用电喷雾电离质谱(ES1-MS)与紫外线吸光度分析MDP-Rituximab偶联物的分子量及其分子比。根据MDP、Rituximab抗体分别在200nm、280nm有最大特征吸收，采用PBS稀释成一定比例，分别测定两者于200nm与280nm的吸收，绘制标准曲线，求出吸光系数e值。同时，将免疫偶联物稀释到一定浓度后检测其吸收，根据光吸收加合性(Hamblett KJ, Senter PD, Chace DF, et al.Effects of loading onthe antItumor activity of a monoclonal antioody drug conjugate[J].Clm LancerRes, 2004，10:7063-7070 ;Dai Y, Liu XJ, Zhen YS.Anti tumor effect of the novelimmunoconjugate compose of pinyangmycin and ant1-type collagenase monoclonalantibody [J].Acta Pharm Sin (药学学报)，2006,41:41-46),偶联物在 200nm 及 280nm 的吸收度分别为「00991 A = p 280r + p 280p^tn)
LV八^1ム」A20O — c CD20(lmg/ml)しCD2〇t c MDP(lmg/ml)しMDP、丄ノ
「00 1 A = p 200C + p 200C("TT、
LV几^o」 八280 — c.CD20(lmg/ml)しCD20丁 じ MDP(lmg/ml)しMDP、丄丄ノ将(II)式除以(I)式，即
权利要求
1.一种胞壁酰ニ肽(MDP)-抗CD20 (Rituximab)免疫偶联物，其特征在于其为式I所示的化合物或其盐，其中
2.按权利要求1所述的MDP-抗⑶20免疫偶联物，其特征在于n3= 3，n4 = 2，叫=3。
3.一种药物组合物，其中包含权利要求1或2所述的MDP-抗⑶20免疫偶联物和可药用的载体。
4.一种药物制剂，其特征包含权利要求1或2所述的MDP-抗CD20免疫偶联物和可药用的载体。
5.按权利要求4所述的药物制剂，其特征在于制剂形式为:片剂、胶囊剂、缓释剂、注射齐U、液体制剂、颗粒剂、丸剤。
6.权利要求1或2中所述的MDP-抗CD20免疫偶联物在制备治疗恶性淋巴瘤中的应用。
7.权利要求1或2中所述的MDP-抗CD20免疫偶联物在制备治疗表达CD20的肿瘤药物中得应用。
8.按权利要求7中所述的应用，其特征在于所述的肿瘤，具体为:白血病及乳腺癌、前列腺癌。
9.权利要求1或2中所述的MDP-抗CD20免疫偶联物在制备治疗由B淋巴细胞活化介导的自身免疫疾病药物中得应用。
10.按权利要求9所述的应用，其特征在于自身免疫性疾病为:系统性红斑狼疮、类风湿关节炎或特发性血小板減少性紫癜。
11.一种制备权利要求1或2中MDP-抗⑶20免疫偶联物的方法，其特征在于: 化合物I的制备 连接臂中碳原子可为I 6，本研究以三个碳原子的连接臂为例，氩气保护下，在烧瓶中，加入Boc保护的连接臂N-Boc-1，3-丙ニ胺盐酸盐20mg，用3ml ニ甲基甲酰胺溶解，加入过量的三こ胺，然后加入N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶硫基)丙酸酷，室温搅拌反应lh，点板检测反应结束，后经过硅胶柱分离，真空蒸干，得产物化合物I ; 化合物2的制备 IS气保护下，在反应瓶中，加入化合物IIOmg,加入1.5ml ニ氯甲烧,冰浴下搅拌IOmin,缓慢加入1.5ml三氟こ酸，冰浴条件下搅拌反应20min，点板检测反应结束，减压浓缩蒸干，并加入适量纯甲醇，再次蒸干，得到化合物2 ； 化合物3的制备 氩气保护下，在IOml反应瓶中，加入胞壁酰ニ肽5mg、化合物23mg，用2ml ニ甲基甲酰胺和四氢呋喃溶解，冰浴条件下加入1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑1.66mg及N-(3- ニ甲基氨基丙基)-N’こ基-碳ニ亚胺2.34mg,搅拌15min，恢复至室温，继续反应2 3h，点板检测反应完全，经硅胶柱，分离得化合物3，真空蒸干，得化合物3 ； 化合物4的制备 氩气保护下，在反应瓶中，加入鼠抗人CD20单克隆抗体(Rituximab) lOOmg，用含有2mmol/LEDTA、PH为8、浓度为0.1moI/L的PBS溶液，溶解调整浓度为8mg/ml，然后加入2-亚氨基四氢噻吩1.38mg,搅拌且室温反应Ih,经Sephacryl S-1OO丙烯葡聚糖凝胶柱分离纯化，得到化合物4 ； MDP-抗CD20免疫偶联物的制备 氩气条件下，在反应瓶中，加入化合物467mg，用2ml浓度为0.1mmoI/L,PH = 8的PBS溶液溶解，然后加入化合物31.5mg搅拌，4°C下反应18-24h,点板检测反应完全,经SephacrylS-100丙烯葡聚糖凝胶柱分离纯化，得到MDP-抗CD20免疫偶联物。
12.一种抗CD20单克隆抗体衍生物，其特征在于为式II所示化合物，其中
13.一种胞壁酰ニ肽MDP的衍生物，其特征在于为式III所示化合物，Ii1为1、2、3、4、5或6，
14.一种如权利要求12中所述的ー种抗CD20单克隆抗体衍生物的制备方法，其特征在于:氩气保护下，在反应瓶中，加入鼠抗人⑶20单克隆抗体(Rituximab) lOOmg，用含有2mmol/L EDTA, PH为8、浓度为0.lmol/L的PBS溶液，溶解调整浓度为8mg/ml，然后加入2-亚氨基四氢噻吩1.38mg,搅拌且室温反应Ih,经Sephacryl S-100丙烯葡聚糖凝胶柱分离纯化,得到抗CD20单克隆抗体衍生物。
15.一种如权利要求13中所述的ー种胞壁酰ニ肽MDP的衍生物的制备方法，其特征在于:连接臂中碳原子可为I 6，本研究以三个碳原子的连接臂为例，氩气保护下，在烧瓶中，加入Boc保护的连接臂N-Boc-1，3-丙ニ胺盐酸盐20mg，用3ml ニ甲基甲酰胺溶解，加入过量的三こ胺，然后加入N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶硫基)丙酸酷，室温搅拌反应lh，点板检测反应结束，后经过硅胶柱分离，真空蒸干，得产物化合物I ;氩气保护下，在反应瓶中，加入化合物I IOmg,加入1.5ml ニ氯甲烧,冰浴下搅拌IOmin,缓慢加入1.5ml三氟こ酸，冰浴条件下搅拌反应20min，点板检测反应结束，减压浓缩蒸干，并加入适量纯甲醇，再次蒸干，得到胞壁酰ニ肽MDP的衍生物。
全文摘要
本研究以疫苗接种所产生的特异性细胞免疫和单克隆抗体的免疫导向作用为理论依据，将卡介苗(BCG)的有效成分胞壁酰二肽(MDP)与抗淋巴瘤细胞膜抗原CD20的单克隆抗体Rituximab结合制备成胞壁酰二肽-抗CD20免疫偶联物，即MDP-Rituximab，了解经BCG免疫后的免疫活性细胞，在MDP-Rituximab的介导下的体内外抗肿瘤效果。该偶联物保持了MDP的免疫原性，刺激机体产生特异性的T细胞免疫应答，借助Rituximab抗体与淋巴瘤细胞膜CD20分子结合的免疫导向作用，将MDP带到残留的淋巴瘤细胞周围，通过MDP诱导T细胞介导的免疫应答达到清除残存肿瘤的最终目的，这样该方法不仅克服了单用Rituximab药物抗性，而且减少了抗体用量，预示其在恶性淋巴瘤中的应用前景。
文档编号A61P29/00GK103087196SQ201210227888
公开日2013年5月8日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者孙立荣, 王玲珍 申请人:孙立荣, 王玲珍