黄芪总皂苷提取物、其制备方法和质量标准控制方法
【专利摘要】本发明公开了一种黄芪总皂苷提取物，其特征在于参照中国药典2010版附录IX水分测定法，所述提取物的含水量不超过5％。本发明也公开了制备所述黄芪总皂苷提取物的方法，包括如下步骤：(1)黄芪粉末用乙醇浸泡或回流提取，合并提取液，得到浓缩液；(2)浓缩液上大孔树脂柱，得到粗皂苷；(3)用中极性有机试剂反复洗涤粗皂苷，得到精制总皂苷；(4)将精制总皂苷碱化，再用稀酸中和至中性，水洗除去盐，得到黄芪总皂苷提取物。所述提取物主要从水分、灰分、重金属检查，总皂苷含量、黄芪甲苷含量以及所述提取物指纹图谱等方面进行质量标准控制。
【专利说明】黄芪总皂苷提取物、其制备方法和质量标准控制方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种中药材黄芪的总皂苷提取物、其制备方法以及所述提取物的质量标准控制方法。
【背景技术】
[0002]黄苗(RadixAstragali)是豆科植物蒙古黄苗Astragalus membranaceus (Fisch)Bge.Var.mongholicus (Bge.) Hsiao 或者膜英黄苗 Astragalus membranaceus (Fisch) Bge.的干燥根，为常用的补益药，味甘，性温。传统医学认为其具有补气固表，利尿脱毒，排脓，敛疮生肌，用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛等，药用历史非常悠久。现代研究表明，黄芪具有提高免疫功能，增强抗氧化、抗辐射和抗癌，保护心脑血管、肝脏、肾脏和肺脏，抗菌及抑制病毒等作用。黄芪皂苷作为黄芪的主要活性成分，临床和实验表明，黄芪皂苷具有免疫调节，抗肿瘤、抗病毒、降糖和改善心血管疾病等广泛活性。
【发明内容】
[0003]本发明的第一个目的是提供一种黄芪总皂苷提取物，参照中国药典2010版附录IX水分测定法，所述黄芪总皂苷提取物的含水量不超过5%。
[0004]根据本发明的一个优选的实施方式，参照中国药典2010版附录IX J炽灼残渣检查法，所述黄芪总皂苷提取物的炽灼残渣不超过I %。
[0005]根据本发明的一个优选的实施方式，参照《中国药典》2010版附录IXE重金属检查法，所述黄芪总皂苷提取物的重金属含量不超过lOppm。
[0006]根据本发明的一个 优选的实施方式，用比色法测定所述提取物黄芪总皂苷的含量，所述黄芪总皂苷提取物的黄芪总皂苷含量不低于90%。
[0007]根据本发明的一个优选的实施方式，用HPLC-DAD法测定所述提取物中黄芪甲苷的含量，所述提取物的黄芪甲苷含量不得低于50%。
[0008]根据本发明的一个优选的实施方式，根据所述指纹图谱检测法，所述黄芪总皂苷提取物的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度大于0.90。
[0009]本发明的第二个目的是提供制备所述黄芪总皂苷提取物的方法，包括如下步骤:
[0010](I)将黄芪粉末用乙醇浸泡或回流提取，合并提取液，得到浓缩液；
[0011](2)浓缩液上大孔树脂柱，得到粗皂苷；
[0012](3)用中极性有机试剂反复洗涤粗皂苷，得到精制总皂苷；
[0013](4)将精制总皂苷碱化，再用稀酸中和至中性，水洗除去盐，得到黄芪总皂苷提取物。
[0014]根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(1)中所述黄芪粉末过60目筛。
[0015]根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(1)中所述浸泡提取包括用60-90%乙醇在55°C下浸泡黄芪粉末的步骤。
[0016]根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(1)中所述回流提取包括用60-90%乙醇回流提取黄芪粉末至少两次，其中第一次使用6~8倍黄芪粉末重量的60-90%乙醇回流提取至少I小时，第二次使用3~5倍黄芪粉末重量的60-90%乙醇回流至少30分钟。
[0017]根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(2)中，先用去离子水洗脱，从而除去糖类和酚酸类；再用浓度20%~40%乙醇洗脱3~5个柱体积从而除杂,最后用浓度70%~90%洗脱3~5个柱体积，收集，浓缩蒸干得到粗皂苷。
[0018]根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(2)中所述大孔树脂柱选自非极性或弱极性大孔树脂柱。所述非极性大孔树脂柱可以选自AB-8、D101或D104，所述弱极性大孔树脂柱可以选自HP20或HPD300。
[0019]根据本发明的一个优选的实施方式，所述大孔树脂的用量不低于20倍黄芪粉末重量。
[0020]根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(3)中，用体积为I~3倍粗皂苷重量的中极性有机试剂反复洗涤，洗涤次数> 2次，优选2~3次。所述中极性有机试剂选自丙酮、乙醚或乙酸乙酯，优选丙酮。每次洗涤试剂的体积为粗皂苷重量的3~6倍。 [0021]根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(4)中，用体积为3~5倍总皂苷重量的碱溶液，加热磁搅拌水解总阜苷。其中所述加热温度为40~60°C,磁搅拌转速为1000~2000rpm，时间为4~6h。所述碱溶液选自0.5%~I %的NaOH，Ca (OH)2或KOH溶液。
[0022]根据本发明的一个优选的实施方式，步骤(4)中所述稀酸为稀盐酸或醋酸或稀磷酸，稀酸浓度约为0.1~0.5mol/L。
[0023]根据一个特别优选的实施方式，本发明制备黄芪总皂苷提取物的方法具体包括如下步骤:将黄芪根粉碎，打粉，过60目筛，用乙醇回流提取多次；合并醇提液，浓缩至无醇味，加水混悬加入大孔吸附树脂柱，去离子水洗脱3~5个柱体积，除去糖、酚酸等杂质；再用20%~40%乙醇洗脱3~6个柱体积，优选40%乙醇，洗脱4个柱体积；再用70%~90%乙醇洗脱3~6个柱体积，优选70 %的乙醇，洗脱5个柱体积，浓缩得到粗皂苷，粗皂苷用中极性有机试剂多次洗涤除杂，洗涤液弃去，得到白色的黄芪总皂苷。黄芪总皂苷中加入适量碱溶液，水解3~6小时，加稀酸中和至中性，水洗去盐，得到黄芪总皂苷提取物。通过中极性有机试剂的洗涤除杂，本发明方法得到的黄芪总皂苷提取物色泽更白、更美观，黄芪总皂苷的含量更高。
[0024]本发明的第三个目的是提供黄芪总皂苷提取物的质量标准控制方法。
[0025]黄芪总皂苷提取物的质量标准控制方法包括水分、炽灼残渣、重金属检查，黄芪总皂苷的含量测定，黄芪甲苷的含量测定和所述提取物指纹图谱检测。
[0026](I)上述水分检查办法参照中国药典2010版附录IX水分测定法，具体方法如下:取黄芪总皂苷提取物2g，转移至干燥至恒重的称量瓶中，精密称定，打开瓶盖在105°C下干燥5小时，将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30分钟，再精密称定，在上述温度下干燥lh，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算含水量。经测定三批提取物样品含水量均不超过5%。
[0027](2)上述炽灼残渣检查方法参照中国药典2010版附录IX J炽灼残渣检查，具体方法如下:取黄芪总皂苷提取物lg，置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓慢炽灼至炭化，放冷至室温；加硫酸0.5~Iml使湿润,低温加热至硫酸蒸汽除尽,在500~600°C炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500~60(TC炽灼至恒重，放冷，称重。经测定，3批提取物炽灼残渣均不超过1.0%。
[0028](3)上述重金属含量检查方法参照《中国药典》2010版附录IX E重金属检查法，具体方法如下:规定所述提取物重金属含量不得超过lOppm。取炽灼残渣项所得残渣，加硝酸0.5mL，蒸干后放冷，加盐酸2mL，置水浴上蒸干后加水15mL，滴加氨试液至对酚酞指示液显微粉红色，再加醋酸盐缓冲液(PH 3.5)2mL，微热溶解后，置纳氏比色管中，加水稀释成25mL作为甲管。另取配制供试品溶液的试剂，置瓷皿中蒸干后，加醋酸盐缓冲液(PH3.5) 2mL与水15mL，作为乙管，再在两管中分别加入硫代乙酰胺试液各2mL，摇匀，放置2分钟，同置白纸上，自下向上透视，乙管中显出的颜色与甲管比，不得更深。经测定，3批提取物的重金属含量均小于lOPPm。
[0029](4)上述的提取物中黄芪总皂苷含量测定方法，用比色法测定黄芪总皂苷含量，具体步骤如下:
[0030]a.对照品溶液的制备:精密称取在105°C减压干燥至恒重的黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解，配置每Iml成含黄芪甲苷0.604mg的标准对照品溶液。
[0031]b.线性关系的考察:精密吸取上述标准对照溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5ml分别置于具塞试管中，置水浴中加热，挥干溶剂，再分别精密加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，密塞，置于70°C水浴恒温加热20分钟，取出，立即用冰水冷却，加冰醋酸
5.0ml摇匀，在560nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，黄芪甲苷量为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程，R值不低于0.9995。
[0032]c.供试品溶液的制备:精密称取约IOmg黄芪总皂苷样品，加甲醇溶解，定容与20ml的容量瓶中，制得供试品溶液。
[0033]d.供试品中黄芪总皂苷的含量测定:按照c的制备方法和b中的操作方法，测定10批黄芪总皂苷提取物中黄芪总皂苷的含量均高于90%，为91.3%~96.82%，平均含量为 93.12%。
[0034](5)上述的提取物中黄芪甲苷含量测定方法特征在于为HPLC-DAD测定法，具体步骤如下:
[0035]a.色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.5%磷酸为流动相，比例为0.25: 0.75，进行梯度洗脱，O至20分钟，乙腈浓度从25%至35% ;21分钟至50分钟，乙腈浓度从35%至48% ;检测器为DAD，检测波长为201~210nm，最优检测波长为205nm ；流速0.5~1.0ml，最优流速为0.8ml ;柱温20~40°C，最优柱温为35°C;进样量5~50 μ I。
[0036]b.对照品溶液制备方法与标准曲线的绘制:取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解，制得储备对照品溶液，用储备对照品溶液配成5个不同浓度，按照色谱条件进样，测定，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程，R2值不低于0.9995。
[0037]c.供试品溶液制备方法:取黄芪总皂苷提取物适量，加甲醇溶解，制得供试品溶液。
[0038]d.供试品中黄芪甲苷的含量测定:取适量供试品，按照(3)制备方法制得供试品溶液，按照⑴色谱条件进样，依据⑵中的回归方程`求得黄芪甲苷含量。测得，10批黄芪总皂苷提取物中黄芪甲苷的含量均高于50%。
[0039](6)上述黄芪总皂苷提取物的指纹图谱检测，其具体步骤如下:
[0040]a.色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.5%磷酸水溶液比例为0.25: 0.75为流动相，进行梯度洗脱；O至20分钟，乙腈浓度从25%至35%;21分钟至50分钟，乙腈浓度从35%至48% ;流速为0.8ml/min ;检测器为DAD，检测波长为205nm ;进样量为10μ I。
[0041]b.参照品溶液的配置:精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每Iml含
0.50mg的溶液，作为参照品溶液。
[0042]c.供试品溶液的制备:精密称取黄芪总皂苷提取物适量，加甲醇溶解配成每Iml含2.50mg的溶液，摇匀，用0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液作为黄芪总皂苷提取物的指纹图谱检测供试液。
[0043]d.供试液指纹图谱检测:按照(I)中的色谱条件，用高效液相色谱对10批黄芪总皂苷提取物的供试液进行指纹图谱检测，记录50分钟色谱图，得黄芪总皂苷提取物的指纹图谱，黄芪总皂苷提取物的指纹图谱应与标准指纹图谱的相似度均大于0.90 ;黄芪总皂苷提取物的指纹图谱有16个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，16个共有指纹峰的相对保留时间分别为:1号峰0.116±0.002，2号峰0.125±0.001，3号峰0.145±0.003，4号峰 0.177±0.002，5 号峰 0.352±0.002，6 号峰 0.385±0.004，7 号峰 0.413±0.002，8 号峰
0.444±0.003，9 号峰 0.466±0.002，10 号峰 0.505±0.001，11 号峰 0.638±0.002，12 号峰
0.890±0.003，13 号峰 0.944±0.003，14 号峰 1.000 (S 峰)，15 号峰 1.186±0.004 和 16 号峰 1.195±0.004。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1为黄芪甲苷标准曲线图(比色法)；
[0045]图2为以SI为参照生成的对照指纹图谱；
[0046]图3为实施例1-3获得的10批样品的叠加图(Sl-SlO)与对照指纹图谱(R)。【具体实施方式】
[0047]为了更好地理解本发明，通过以下实施例来说明，但这些实施例不构成对本发明的限制。
[0048]实施例1
[0049]取黄芪药材500g(产地:甘肃省岷县，2011年10月购自甘肃省岷县中药材出售公司)，粉碎，过60目筛，第一次加药材量8倍量的60%乙醇，第二次加药材量5倍量的60%乙醇，热回流提取，合并药液浓缩至无醇味，加适量水悬浮，上DlOl大孔吸附树脂(陕西蓝深树脂特种树脂有限公司)，用4倍树脂床体积的去离子水冲洗，水冲洗液弃去；再用5倍树脂床体积的40 %乙醇冲洗，冲洗液弃去；用5倍树脂床的90%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸干得粗皂苷4g，用体积为3倍粗皂苷量的丙酮进行洗涤，洗涤液弃去，一共三次，得到精制总皂苷2.5g，加入3倍量的0.5% NaOH溶液，60°C下磁搅拌3h，加入0.lmol/L的稀盐酸中和至中性，减压蒸干，反复水洗除去NaCl，得到淡白色黄芪总皂苷提取物2.0g，总皂苷含量为97%。
[0050]实施例2
[0051]取黄芪药材500g(产地甘肃岷县，2011年10月购自甘肃省岷县中药材出售公司)，粉碎，过60目筛，第一次加药材量8倍量的60%乙醇，第二次加药材量5倍量的60%乙醇，第三次加药材量3倍量的60%乙醇，热回流提取，合并药液浓缩至无醇味，加适量水悬浮，上DlOl大孔吸附树脂(陕西蓝深特种树脂有限公司)，用4倍树脂床体积的去离子水冲洗，水冲洗液弃去；再用5倍树脂床体积的40%乙醇冲洗，冲洗液弃去；用5倍树脂床的90%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸干得粗皂苷5g，用体积为3倍粗皂苷量的乙酸乙酯进行洗涤，洗涤液弃去，一共三次，得到精制总皂苷3g，精制总皂苷加入3倍量的1% NaOH溶液，60°C下磁搅拌6h，加入0.lmol/L稀盐酸中和至中性，减压蒸干，反复水洗除去NaCl，得到灰白色的黄芪总皂苷提取物2.6g，总皂苷含量为90%。
[0052]实施例3
[0053]取黄芪药材500g(产地甘肃岷县，2011年10月购自甘肃省岷县中药材出售公司)，粉碎，过60目筛，第一次加药材量8倍量的60%乙醇，第二次加药材量5倍量的60%乙醇，热回流提取，合并药液浓缩至无醇味，加适量水悬浮，上AB-8大孔吸附树脂(陕西蓝深树脂特种树脂有限公司)，用4倍树脂床体积的去离子水冲洗，水冲洗液弃去；再用5倍树脂床体积的40%乙醇冲洗，冲洗液弃去；用5倍树脂床的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸干得粗皂苷3.Sg，用体积为3倍粗皂苷量的乙醚进行洗涤，洗涤液弃去，一共三次，得到精制总皂苷部位2.3g，精制总皂苷加入3倍量的1% NaOH溶液，60°C下磁搅拌6h，加入
0.5mol/L稀盐酸中和至中性，减压蒸干，反复水洗除去NaCl，得到灰白色的黄芪总皂苷提取物1.9g，总皂苷含量为93%。
[0054]实施例4
[0055]取实施例1-3获得的黄芪总皂苷提取物3批(批号分别为20111205，20111208和20111210)。
[0056]1.水分检查
`[0057]取黄芪总皂苷提取物约2g，转移至干燥至恒重的称量瓶中，精密称定，打开瓶盖在105°C下干燥5小时，将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30分钟，再精密称定，在上述温度下干燥lh，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算含水量(% )?结果见表1。
[0058]2.炽灼残渣检查
[0059]取黄芪总皂苷提取物lg，置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓慢炽灼至炭化，放冷至室温；加硫酸0.5~Iml使湿润,低温加热至硫酸蒸汽除尽,在500~600°C炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500~60(TC炽灼至恒重，放冷，称重，结果见表1。
[0060]3.重金属检查
[0061]取炽灼残渣项所得残渣，加硝酸0.5mL，蒸干后放冷，加盐酸2mL，置水浴上蒸干后加水15mL，滴加氨试液至对酚酞指示液显微粉红色，再加醋酸盐缓冲液(PH 3.5)2mL，微热溶解后，置纳氏比色管中，加水稀释成25mL作为甲管。另取配制供试品溶液的试剂，置瓷皿中蒸干后，加醋酸盐缓冲液(PH3.5)2mL与水15mL，作为乙管，再在两管中分别加入硫代乙酰胺试液各2mL，摇匀，放置2分钟，同置白纸上，自下向上透视，乙管中显出的颜色与甲管t匕，不得更深，结果见表1。
[0062]表1:水分、炽灼残渣、重金属检查结果
[0063]
【权利要求】
1.黄芪总皂苷提取物，其特征在于参照中国药典2010版附录IX水分测定法，所述提取物的含水量不超过5%。
2.根据权利要求1所述的黄芪总皂苷提取物，其特征在于参照中国药典2010版附录IX J炽灼残渣检查法，所述提取物的炽灼残渣不超过I %。
3.根据权利要求1或2所述的黄芪总皂苷提取物，其特征在于参照《中国药典》2010版附录IX E重金属检查法，所述提取物的重金属含量不超过lOppm。
4.根据权利要求1至3任一项所述的黄芪总皂苷提取物，其特征在于用比色法测定所述提取物黄芪总皂苷的含量，所述提取物的黄芪总皂苷含量不低于90%。
5.根据权利要求1至4任一项所述的黄芪总皂苷提取物，其特征在于用HPLC-DAD法测定所述提取物中黄芪甲苷的含量，所述提取物的黄芪甲苷含量不得低于50%。
6.根据权利要求1至5任一项所述的黄芪总皂苷提取物，其特征在于根据所述指纹图谱检测法，所述提取物的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度大于0.90。
7.制备权利要求1-6任一项所述的黄芪总皂苷提取物的方法，包括如下步骤: (1)将黄芪粉末用乙醇浸泡或回流提取，合并提取液，得到浓缩液； (2)浓缩液上大孔树脂柱，得到粗皂苷； (3)用中极性有机试剂反复洗涤粗皂苷，得到精制总皂苷； (4)将精制总皂苷碱化，再用稀酸中和至中性，水洗除去盐，得到黄芪总皂苷提取物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述黄芪粉末过60目筛。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述浸泡提取包括用体积百分数为60-90%的乙醇在55°C下浸泡黄芪粉末的步骤。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述回流提取包括用60-90%乙醇回流提取黄芪粉末至少两次，其中第一次使用6~8倍黄芪粉末重量的60-90%乙醇回流提取至少I小时，第二次使用3~5倍黄芪粉末重量的60-90%乙醇回流至少30分钟。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(2)中，先用去离子水洗脱，再用浓度.20 %~40 %乙醇洗脱3~5个柱体积，最后用体积百分数为70 %~90 %的乙醇洗脱3~5个柱体积，收集，浓缩蒸干得到粗皂苷。
12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述大孔树脂柱选自非极性或弱极性大孔树脂柱。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述非极性大孔树脂柱选自AB-8、DlOl或D104，所述弱极性大孔树脂柱选自HP20或HPD300。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述大孔树脂的用量不低于黄芪粉末重量的20倍。
15.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(3)中，用体积为I~3倍粗皂苷重量的中极性有机试剂反复洗涤，洗涤次数> 2次。
16.根据权利要求15所述的方法，所述中极性有机试剂选自丙酮、乙醚或乙酸乙酯，优选丙酮。
17.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(4)中，用体积为3~5倍精制总皂苷重量的碱溶液，加热磁搅拌水解总皂苷。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于所述加热温度为40~60°C，磁搅拌转速为1000~2000rpm，时间为4~6h。
19.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述碱溶液选自0.5%~1%的 NaOH，Ca (OH) 2 或 KOH 溶液。
20.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述稀酸为稀盐酸或醋酸或稀磷酸，稀酸浓度为0.1~0.5mol/L。
21.根据权利要求7至20任一项所述的方法得到的黄芪总皂苷提取物。
22.黄芪总皂苷提取物的质量标准控制方法，其特征在于测定所述提取物的水分、炽灼残渣、重金属含量、黄芪总皂苷含量、黄芪甲苷含量以及提取物指纹图谱检测。
23.根据权利要求22中所述的质量标准控制方法，其特征在于参照中国药典2010版附录IX水分测定法，规定所述提取物的含水量不得超过5%。
24.根据权利要求22中所述的质量标准控制方法，其特征在于参照中国药典2010版附录IX J炽灼残渣检查法，规定所述提取物的炽灼残渣不得超过1%。
25.根据权利要求22中所述的质量标准控制方法，其特征在于参照《中国药典》2010版附录IX E重金属检查法，规定所述提取物的重金属含量不得超过lOppm。
26.根据权利要求22中所述的质量标准控制方法，其特征在于用比色法测定所述提取物黄芪总皂苷的含量，规定所述提取物的黄芪总皂苷含量不得低于90%。
27.根据权利要求22中所述的质量标准控制方法，其特征在于用HPLC-DAD法测定所述提取物中黄芪甲苷的含量，规定所述提取物的黄芪甲苷含量不得低于50 %。
28.根据权利要求27中所述的质量标准控制方法，其特征在于所述HPLC-DAD法测定包括如下步骤: (1).色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.5%磷酸为流动相，进行梯度洗脱；检测器为DAD，检测波长为201~210nm ;流速0.5~1.0ml，柱温20~40°C，进样量5~50 μl ; (2).对照品溶液制备方法与标准曲线的绘制:取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解，制得储备对照品溶液，用储备对照品溶液配成3~6个不同浓度，按照色谱条件进样，测定，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程，R2值不低于0.9995 ； (3).供试品溶液制备方法:取黄芪总皂苷提取物适量，加甲醇溶解，制得供试品溶液； (4).供试品中黄芪甲苷的含量测定:取适量供试品，按照(3)制备方法制得供试品溶液，按照(1)色谱条件进样，依据(2)中的回归方程求得黄芪甲苷含量。
29.根据权利要求22中所述的质量标准控制方法，其特征在于根据所述指纹图谱检测法，规定黄芪总皂苷提取物的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度应大于0.90。
30.根据权利要求29中所述的质量标准控制方法，其特征在于所述指纹图谱检测法包括如下步骤: (1).色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.5%磷酸水溶液比例为.0.25: 0.75为流动相，进行梯度洗脱；O至20分钟，乙腈浓度从25%至35%;21分钟至50分钟，乙腈浓度从35%至48% ;流速为0.5~lml/min ;检测器为DAD，检测波长为201~210nm，最优波长为205nm ;进样量为5~50 μ l ; (2).参照品溶液的配置:精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含.0.50mg的溶液，作为参照品溶液；(3).供试品溶液的制备:精密称取黄芪总皂苷提取物适量，加甲醇溶解配成每Iml含.2.50mg的溶液，摇匀，用0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液作为黄芪总皂苷提取物的指纹图谱检测供试液； (4).供试液指纹图谱检测:按照(I)中的色谱条件，用高效液相色谱对黄芪总皂苷提取物的供试液进行指纹图谱检测，记录50分钟色谱图，得黄芪总皂苷提取物的指纹图谱，黄芪总皂苷提取物的指纹图谱应与标准指纹图谱的相似度大于0.90 ;所述黄芪总皂苷提取物的指纹图谱共有16个共有指纹峰，参照峰S为黄芪甲苷色谱峰，16个共有指纹峰的相对保留时间分别为:1号峰0.116±0.002，2号峰0.125±0.001，3号峰0.145±0.003，4号峰 0.177±0.002，5 号峰 0.352±0.002，6 号峰 0.385±0.004，7 号峰 0.413±0.002，8 号峰.0.444±0.003，9 号峰 0.466±0.002，10 号峰0.505±0.001，11 号峰 0.638±0.002，12 号峰.0.890±0.003，13 号峰 0.944±0.003，14 号峰 1.000 (S 峰)，15 号峰 1.186±0.004 和 16 号峰 1.195±0.004。
【文档编号】A61P9/14GK103623039SQ201210296882
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月20日 优先权日:2012年8月20日
【发明者】杨义芳, 胡晓, 杨悦文, 屈晓晟 申请人:上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院