专利名称：Tf抗原及其类似物、和其化学酶法合成方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于糖类药物领域，涉及糖类物质的化学酶合成方法，尤其涉及肿瘤相关糖抗原及其类似物的化学酶法合成方法，还涉及所合成TF抗原和sT抗原及其类似物在药物研发领域的应用。
背景技术：
目前研究表明，在不同肿瘤组织的产生和发展过程中存在一种共有现象，即在肿瘤细胞表面会过度表达异常的糖链结构，这些糖链结构被称为肿瘤相关糖抗原(TACAs)。同一肿瘤组织会表达不同肿瘤相关糖抗原，同一肿瘤相关糖抗原也会分布于不同肿瘤组织。这些肿瘤相关糖抗原与肿瘤发生、发展和预后都存在密切关联(D.H.Dube and C.R. Bertozzi, Nat. Rev. Drug Discov.，2005，4，477-488. ;M. M. Fuster and J. D. Eskoj Nat.Rev. Cancer.，2005, 5，526-542)。以下是一些常见肿瘤相关糖抗原的结构。
H°V^H( H/0H C0HHOvA9H °f /°H/NHAc HO .OHOH H C0o
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Polysialic acid (PSA) HO 广OH HO^OH OH.OH
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HO^ OHLewis Y |sLeY)常见肿瘤相关糖抗原鉴于上述情况，肿瘤相关糖抗原被广泛的应用于抗肿瘤疫苗的研发并取得了长足的进展。目前已有多个药物进入临床研究阶段并表现出了较好的药效活性(Astixmomo，R.
D., Burton, D. R. , Nat. Rev. Drug Discov.，2010，9，308-324)。但是，目前应用的多数是天然结构的肿瘤相关糖抗原。由于正常组织本身也会少量表达这些异常糖链结构，致使抗肿瘤疫苗的研发存在以下两方面的挑战一，机体免疫系统不能够对其产生足够强的免疫应答；二，天然糖抗原会在生理条件下降解使得不能产生特异性的免疫反应(Z.W. Guo andQ. L. Wang, Curr. Opin. Chem. Biol. , 2009, 13, 608-617)。面临上述两个挑战，科学家们将目光聚焦在了对糖链结构进行非天然修饰上。如对肿瘤相关糖抗原进行氟代，生成硫苷、碳苷来替换天然的氧苷键等一系列方法被用于抗肿瘤疫苗的研发(Y. Cheng, A. L. Guo and D. S. Guo, Curr. Org. Chem. , 2010, 14, 977-999; X.J. Yuan and R. J. Linhardt, Cur. Top. Med. Chem. , 2005, 5, 1393-1430 ; K. Pachamuthu andR. R. Schmidt, Chem. Rev.，2006, 106，160-187)。这一解决途径虽然取得成效，但是同时也带来了合成上的挑战。由上述肿瘤相关糖抗原的常见结构及近年来的研究可知肿瘤相关糖抗原末端往往有唾液酸化修饰，并且过度唾液酸化也是肿瘤发生发展过程中细胞表面糖链结构异常的特征之一(Ajit. Varki, Glycobiology, 1993，3，2，97-130),而化学唾液酸化目前仍然是糖化学合成中的一个难点。T-抗原不仅是表达量最高的肿瘤相关糖抗原之一，也在多种肿瘤相关糖蛋白共有成分中表现出极高的过量表达，比如在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌过度表达量近乎 90% (ff. M. Lin, U. Karsten, S. Goletz, R. C. Cheng and Y. Cao, Int. J Exp.Pathol. , 2011, 92, 97-105 ；S. E. Baldus, K. Engelmann and F. G. Hanisch, Crit. Rev.Cl. Lab. Sci., 2004, 41, 189-231)。近来，含有单氟代和双氟代取代的T-抗原的MUCI糖蛋白类似物得以合成并在动物试验中表现出了强的免疫原性(M. Johannes, T.Oberbillig and A. Hoffmann-Roder, Org. Biomol. Chem. , 2011, 9, 5541-5546;S.Wagner,
C.Mersch and A.Hoffmann-Roder, Chem-Eur. J. , 2010, 16, 7319-7330;C. Mersch, S. Wagner and A.Hoffmann-Roder,Synlet.t, 2009, 2167-2171;A. Hoffmann-Roder andM. Johannesy, Chem. Comm. , 2011, 47, 9903-9905 ；T. Oberbi 11 ig, C. Mersch, S. Wagner andA. Hoffmann-Roder, Chem. Comm. , 2012, 48, 1487-1489)。且有研究表明化合物的氟代会增强药物的稳定性和生物利用度(J. Xue, V. Kumar, S. D. Khaja, E. V. Chandrasekaran, R.
D.Locke and K. L. Matta, Tetrahedron, 2009, 65, 8325-8335; J. Xia, J. Xue, R. D. Locke, E.V. Chandrasekaran, T. Srikrishnan and K. L. Matta, J. Org. Chem. , 2006, 71, 3696-3706)。而目前限制T-抗原及其类似物和sT-抗原及其类似物的研究与应用的最大屏障是高效快捷的化合物获取。虽然近年来，化学糖苷化获得了快速的进展；但依然没有一个统一有效地普适性方法。由于T-抗原中含有1-3半乳糖苷键，化学法合成需要进行反复的保护与脱保护操作并且收率较低、立体选择性不高(H. Yu, V. Thon, K. Lau, L. Cai, Y. Chen, S. Mu, Y. Li, P. G. Wangand X. Chen, Chem. Comm.，2010，46，7507-7509)。而非天然的修饰又进一步加大了化学法合成上的难度。而目前通过糖基转移酶来催化的酶法合却又面临以下几方面的困难一是反应往往需要价格昂贵的活性糖为中间体，二是反应的催化往往需要多酶体系，而相应酶的获得又比较困难；三是该系列酶往往有较强的底物专一性，底物适用性窄难以耐受非天然的修饰。sT-抗原中含有末端唾液酸化修饰。而九碳糖唾液酸由于其自身独特结构，不仅容易形成分子内氢键，且在Cl位的羧基、C3位的脱氧、C7位的氮杂原子取代均降低了糖环上的电子密度，使得唾液酸糖苷键的生成成为糖合成领域的经典挑战(Xi Chen. ,AjitVarki.，ACS Chem. Biol.，2010，5，2，163 - 176)。因此，寻找一种快速、高效合成肿瘤相关糖抗原的合成方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种TF抗原及其类似物，它它们的化学酶法合成方法。为实现上述目的，本发明采用下述技术方案
通式III所示的TF抗原及其类似物或通式IV所示的唾液酸化TF抗原及其类似物通式11权利要求
1.通式III所示的TF抗原及其类似物或通式IV所示的唾液酸化TF抗原及其类似物 其中 R1，选自氢原子、a-或￠-构型丝氨酸残基、a-或￠-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、块基取代烧基、疏基取代烧基、Ct -或|3 -构型取代烧基； R2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基； R3，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基； R4，选自氟原子、羟基； R5，选自氟原子、羟基； R6，选自氟原子、羟基； R7，选自氟原子、氮乙酰氨基、氮羟基乙酰氨基、氮叠氮乙酰氨基、羟基、叠氮； R8，选自氟原子、羟基、叠氮。
2.—种权利要求I所述的TF抗原及其类似物的化学酶法合成方法，其特征是，包括以下步骤 (1)选用通式I所示的氟代半乳糖胺类似物或半乳糖胺类似物； 其中 R1，选自氢原子、a-或￠-构型丝氨酸残基、a-或￠-构型苏氨酸残基、叠氮取代烷基、块基取代烧基、疏基取代烧基、Ct -或-构型取代烧基； R2，选自氟原子、氢原子、叠氮、羟基； R3，选自氮乙酰氨基、氮丙酰氨基、氮三氟乙酰胺基、氮叠氮乙酰氨基； 和选用通式II所示的氟代半乳糖或半乳糖其中 R4，选自氟原子、羟基； R5，选自氟原子、羟基； R6，选自氟原子、羟基； (2)利用一锅双酶法将通式I和通式II所示的化合物立体选择性偶联合成TF抗原及其类似物，所述一锅双酶法中先后用到的酶分别为半乳糖激酶和己糖磷酸化酶；通式III所示的TF抗原及其类似物
3.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，步骤(I)中的氟代半乳糖胺类似物采用以下方法合成将半乳糖氨基盐酸盐与醋酐进行反应后，将其C-3，C-4位用2，2- 二甲氧基丙烷在樟脑磺酸催化下进行丙酮叉保护；将仅裸露6-位羟基的氮取代氨基半乳糖苷在微波条件下进行氟代，脱保护后即得。
4.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，步骤(I)中的氟代半乳糖采用以下方法合成先将半乳糖的1，2-和3，4-位在丙酮中用浓硫酸催化进行丙酮叉保护，再在微波条件下进行氟代，脱保护后即得。
5.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，步骤(2)中的TF抗原及其类似物合成方法是:将0. 5-20当量的化合物I、l. 0-10. 0当量化合物II、0. 5-20当量ATP、5_100mMMgCl2、10-500mM, pH 5. 0-10. 0的Tris-HCl缓冲液配制水溶液，然后添加半乳糖激酶；反应完成后，将反应体系的PH值调节至4. 5-8. 5并加入己糖磷酸化酶；待反应完成后，纯化即可直接获得TF抗原及其类似物。
6.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，步骤(3)中的唾液酸化TF抗原及其类似物的合成方法将I. 0-10. 0当量的化合物III、0. 5-20. 0当量的唾液酸及其类似物、0.5-20. 0 当量的 CTP,5. O-IOOmM 的 MgCl2 和 10-500mM, pH 5. 0-10. 5 的 Tris-HCl 缓冲液配制水溶液，加入唾液酸CMP-合成酶和唾液酸转移酶，实现一锅双酶法唾液酸化；反应完成后，纯化即可直接获得唾液酸化TF抗原及其类似物。
7.如权利要求5所述的合成方法，其特征是，所述一锅双酶法中先后用到的酶分别是E. coli K-12 galactokinase (GalK)和 Bifidobacterium infantis D-galactosyl-旦 1-3-N-acetyl-D-hexosamine phosphorylase (BiGalHexNAcP),反应时间为 25 分钟-35 小时。
8.如权利要求6所述的合成方法，其特征是，所述一锅双酶法唾液酸化中用到的酶是 Neisseria meningitidis CMP-sialic acid synthetase (NmCSS)和 Pasteurellamultocida sialyl transferase I (PmSTl)，反应时间为 5 分钟-30 小时。
9.如权利要求2所述的合成方法，其特征是，所述的酶法合成中反应温度为0-37°C，转速为0-240rpm ;所述酶反应的停止方法是向反应中加入等体积的4°C无水乙醇并在4°C下培育0-30分钟。
10.权利要求I所述的通式III或通式IV在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种TF抗原及其类似物、和其化学酶法合成方法及其应用，方法包含下列步骤(1)化学合成氟代半乳糖及氟代半乳糖胺类似物；(2)酶法合成氟代TF抗原；(3)酶法合成唾液酸化Thomsen-Friedenreich抗原。本发明将化学合成法的灵活性和酶合成法的高区域选择性和高效性结合到一起，首次实现了氟代TF-抗原的酶法合成，解决了目前化学合成氟代TF抗原中所面临的底物反应活性低、合成步骤繁多、收率低等不足。由于氟代肿瘤相关糖抗原具有比天然糖抗原更优越的药代性质，因而，本发明的在发展新型抗肿瘤疫苗具有广泛的应用前景。
文档编号A61K39/385GK102796144SQ201210300710
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月22日 优先权日2012年8月22日
发明者曹鸿志, 王凤山, 闫俊 申请人:山东大学