一种治疗脑缺血性痴呆的药物及其制备方法

专利名称：一种治疗脑缺血性痴呆的药物及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种治疗脑缺血性痴呆的药物及其制备方法。
背景技术：
近年来，在我国自然灾害、突发事件频繁发生，在这些意外的事件中由于脑外伤引起的伤残占有很高的比例，而其后遗的缺血性痴呆，给人们造成极大痛苦，给社会造成极大负担，给部队造成战斗减员。脑缺血后，因脑组织缺血缺氧，缺血中心区神经细胞发生急性坏死，而在缺血半暗带区，神经细胞则发生以凋亡为主的迟发性死亡，且凋亡在重新恢复血流供应后不会終止，这与缺血后脑组织损伤面积发展扩大有夫。因此，抑制凋亡、挽救濒死 细胞、减少神经元死亡是脑缺血神经细胞保护治疗重点。大脑是人体中枢神经活动的中心，机体通过长期进化对大脑形成了有效的保护，如血脑屏障(blood-brain barrier,BBB不仅可以十分严谨和“挑易U”地吸收大脑所必需的成分，同时还可以排出有害或过剩的物质，从而保持脑的内环境稳定BBB的这ー特征对大脑起到了有效的保护作用，但也给跨BBB给药带来了困难。银杏Ginkgo biloba L.在地球上存在约2亿年，素有裸子植物“活化石”之称。自20世纪70年代发现银杏叶提取物(Extract of Ginkgo biloba, EGb)对心血管疾病有良好的疗效，其药用价值才受到广泛关注。萜类内酯类化合物银杏内酯(ginkgolides)是银杏提取物中的ー种活性成分，包括银杏内酷A、B、C、M、J等，均为血小板活化因子(plateletacti-vating factor,PAF)受体拮抗剂。银杏提取物中仅含有微量银杏内酯B (ginkgolideB，BN52021)，近年来国内外的研究显示该化合物可以抑制血小板聚集、抗炎、抗体克，以及保护心脑血管、治疗急性胰腺炎等。蛇足石杉Huperzia serrata (Thunb. ) Trev,又名千层塔,石松目(Lycopodiales)石杉科(Huperziaceae)石杉属(Huperzia Bemh.)植物(Holub分类系统)，为多年生蕨类植物，生于林荫下湿地或沟谷，分布于东北至长江流域及华南、西南各地，有退热、止血、续筋、除湿消瘀、止血功效，民间用于治疗肺炎、肺痈、劳伤吐血、痔疮便血、跌打损伤、肿毒等症。在20世纪80年代，上海药物研究所的刘嘉森等从该植物中分离出了具有抗こ酰胆碱酯酶活性的石松类生物碱有效单体石杉碱甲(huperzine A,Hup A)(质量分数为O. 0216%,又名福定碱fordine)和石杉碱こ(活性约为石杉碱甲A的I / 10，质量分数为O. 0093% )，二者均有很强的抑制胆碱酯酶活性，特别是Hup A，引起了国际、国内药物科学家们的浓厚兴趣。石杉碱甲和银杏内酯B这两种物质作的治疗机理多年研究和临床试验已经非常明确，已经被广泛应用于痴呆和脑缺血的治疗当中。但石杉碱甲和银杏内酯B这两种物质大多都是单独用来制备药物，但石杉碱甲和银杏内酯B単独应用于治疗缺血性脑痴呆的时候存在以下弊端石杉碱甲片治疗痴呆的公开文献检索，并对其结果进行分析，发现目前研究中尚存在以下问题1.试验疗程偏短，样本数偏少；2.阳性对照药选择代表性不强；3.缺乏大规模的安慰剂对照临床研究；4.诊断和疗效判断均缺乏客观的实验室证据。银杏内酯B能明显改善缺血状态，对缺血引起的脑水肿、电解质紊乱、炎性细胞浸润、血小板聚集均有显著抑制作用。银杏内酯B (g i n k g ο I i d e B，G B )混合制剂主要用于心血管疾病、脑缺血、脑老化、老年痴呆症及哮喘病的治疗。但有关其对大鼠胚胎中脑神经细胞影响的研究很少，而中脑神经细胞损伤与帕金森病等疾病关系密切。本实验通过MT T、形态学观察等方法探讨银杏内酯B对胚胎大鼠中脑神经细胞存活、生长的影响，为银杏内酯B治疗中脑神经细胞损伤相关疾病提供理论依据。而目前为止，我们还没有发现用石杉碱甲和银杏内酯B结合起来制成的药物来治疗缺血性脑痴呆的先例和报道。

发明内容
发明目的本发明提供了ー种治疗缺血性脑痴呆的药物及其制备方法，其目的是解决以下问题I、单纯使用石杉碱甲多用于治疗老年痴呆,对缺血性痴呆的报道未见。石杉碱甲片药物的ロ服生物利用度很低，且不易通过血脑屏障，影响药物的吸收。2、单纯使用银杏叶提取物片剂和注射剂中，存在操作简单，病人每天所需的药量很大，长期使用会给病人带来很多副作用。3.以往治疗缺血性脑痴呆的药物中，大多是利用石杉碱甲与某些中药联合应用，成分复杂，作用机理不清楚、重复性不好，大多针对老年痴呆的患者。为了克服以上石杉碱甲和银杏叶提取物制剂在治疗缺血性脑痴呆上的弊端，我们研发了ー种主要利用石杉碱甲和银杏内酯B制备的新药。技术方案一种治疗脑缺血性痴呆的药物，其特征在于所述药物应用在治疗缺血性脑痴呆上；该药物主要由石杉碱甲和银杏内酯B制备而成，其中石杉碱甲与银杏内酯B的质量比例为0· 05 O. 5 :5 50。所述药物为石杉碱甲和银杏内酯B结合的固体脂质纳米粒，其中石杉碱甲与银杏内酷B的质量比例为0. 05 O. 5 :5 50 ;固体脂质纳米粒含有非药性成分的药用辅料，药用辅料包括固体脂质和乳化剤，药用辅料与石杉碱甲和银杏内酯B的质量比例为50 200:0. 05 O. 5 :5 50。所述的固体脂质主要包括甘油三酷，部分甘油，脂肪酸，类固醇和蜡类中的ー种或多种混合物。所述的乳化剂包括磷脂类、维生素E聚こニ醇琥珀酸酷、泊洛沙姆188、胆酸盐类、吐温类、短链醇类、司盘类中的ー种或多种混合物。所制固体脂质纳米粒的粒径范围是IOnm 5 μ m。ー种如上所述治疗脑缺血性痴呆药物的制备方法，其特征在干该方法按如下步骤进行(I)在配制罐中，将处方量乳化剂在70 90°C下搅拌分散均匀制成水相；(2)在配制罐中，在60 80°C下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酯B加入，搅拌均匀，形成脂质相；(3)把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌6000 28000rpm搅拌10分钟，制成初乳；(4)过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至400 1200bar，将溶液反复匀化，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。优点效果本发明更加充分的利用了石杉碱甲和银杏内酯B在治疗脑痴呆和脑缺血方面的药效作用，其中石杉碱甲是こ酰胆碱酯酶抑制剂，具有改善脑痴呆的作用；银杏内酷B是血小板活化因子受体拮抗剂，可营养脑细胞，对脑缺血有很好的保护作用。近年来，随着分离方法、测试技术、检测手段等改进和研究的深入，石杉碱甲、银杏内酯B在临床医疗和诊断治疗等方面，得到了越来越多的广泛应用。石杉碱甲的具体的效果为
( I)是通过与こ酰胆碱酯酶结合为复合物起到抑制こ酰胆碱酯酶作用，提高脑内胆碱能的功能作用。(2)石杉碱甲改善老年痴呆患者的记忆、认知功能及生活能力。(3)石杉碱甲可以增加神经突触间隙的こ酰胆碱含量，改善痴呆和脑器质性病变患者的记忆障碍。(4)石杉碱甲能对抗多种毒剂诱发的神经细胞毒性作用而银杏内酯B，是血小板活化因子受体拮抗剂，可以抑制血小板聚集、能明显改善缺血状态，对缺血引起的脑水肿、电解质紊乱、炎性细胞浸润、血小板聚集均有显著抑制作用。银杏内酯B的具体效果为( I)抑制血小板聚集，改善脑缺血状态；(2)提供脑细胞所需的营养；(3)抑制脑缺血引起的水肿、电解质紊乱等(4)改善血脑屏障的通透性；(5)能修复脑缺血引起的兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸动态平衡失调，达到脑保护的治疗效果。(6)能降低脑脂质过氧化速率，加快对组织超氧阴离子自由基的清除。通过以上石杉碱甲和银杏内酯B在治疗缺血性脑痴呆上的效果和弊端，本发明通过实验后将两者有机结合起来，制备了且发明了治疗缺血性脑痴呆的复方制剂，在克服以往的单独使用石杉碱甲或银杏内酯B过程中存在弊端的同时，也更加充分的发挥了石杉碱甲与银杏内酯B在治疗缺血性脑痴呆上的效果，例如I.预防和治疗老年痴呆；2.提供脑细胞所需的营养，预防脑缺血；3.治疗脑外伤缺血后引起的痴呆。另外，本发明中石杉碱甲和银杏内酯B复合物对缺血性脑痴呆有很大的改善作用，同时与单独服用石杉碱甲与银杏内酯B的ロ服制剂相比，可促进药物更好的吸收，提高生物利用度。


图I 3为Hup-A与GB在Caco_2模型上累计吸收的经时变化(f 土 S，n=3)图。实施方式下面结合实施例及实验方法对本发明做进ー步的说明
一种用于治疗缺血性脑痴呆的药物，其特点在于所述药物为固体脂质纳米粒制齐U，应用在治疗缺血性脑痴呆上；该药物主要由石杉碱甲和银杏内酯B制备而成；其中石杉碱甲与银杏内酯B的质量比例为0. 05 O. 5 :5 50 (mg)。所述的固体脂质纳米粒，为ー种石杉碱甲和银杏内酯B结合的固体脂质纳米粒，含有效剂量的石杉碱甲和银杏内酯B作为药物，并含有药用辅料，其特征是药用辅料包括药物、固体脂质、乳化剤、助乳化剤，药脂=5 :1 I :50。所述的固体脂质主要包括甘油三酯(豆蘧酸甘油酷、三棕榈酸甘油酷、三硬脂酸甘油酯等中、长链脂肪酸的甘油醋、Compritol888 ATO等),部分甘油(Imwitor、单硬脂酸甘油酷，含有单、ニ、三酞甘油酷)，脂肪酸(硬脂酸、棕榈酸、癸酸、二十ニ酸)，类固醇(胆固醇)和蜡类(鲸蜡醇十六酸酷、微晶石蜡、鲸醋蜡)等(1% 10%)。所述的乳化剂包括磷脂类如大豆磷脂(LS75, LS100)、蛋黄磷脂(LE80)、卵磷脂(epikuron200) (O. 5% 5%) (w/v)> HS15 (聚こニ醇 12-轻基硬脂酸酷、polyethyleneglycol 660 hydroxystearate) (0.1% 5%) (w/v)、维生素 E 聚こニ醇玻拍酸酯(TPGS)·(0.1% 5%) (w/v)、泊洛沙姆188 (O. 05% 5%) (w/v)、胆酸盐类如胆酸钠、甘胆酸钠、牛磺胆酸钠、去氧牛磺胆酸钠(O. 1% 5%)、吐温类(O.(w/v)、短链醇类(如丁醇、丁酸等)、司盘类中的ー种或几种混合物。最佳pH范围是4 9 ;所制固体脂质纳米粒的粒径范围是IOnm 5 μ m。固体脂质纳米粒的制备エ艺为在配制罐中，将处方量乳化剂在7(T90°C下搅拌分散均匀制成水相；在配制罐中，在60_80°C下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酷B加入，搅拌均匀，形成脂质相；把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000 28000rpm) IOmin,制成初乳；过均质仪(或微射流仪)，调节匀化压カ至400 1200bar，将溶液反复匀化，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。纳米粒(nanoparticles, NP)作为胶态药物载体有许多独特的优点，已成为国内外医药学的重要研究方向，近年来更是有多种产品获准上市。由于NP所具有的小粒子特征，使其可以穿过生物膜屏障，特别是载药NP经表面修饰后，可避免网状内皮系统(reticuloendothelialsystem, RES)吞曬,提高药物的脑内浓度,是作为脑祀向给药的良好载体。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)又称固体脂质体，是一种室温下为固态的天然或合成的脂质体或类脂纳米粒子。SLN的研究始于20世纪90年代，是ー种以硬脂酸、卵磷脂、三酰甘油等脂类原料为基质，将药物包裹于类脂核中制成50-1000nm粒径的固体脂质粒子给药体系。SLN常温下为固态，具有以下四方面特点①良好的生物兼容性能有效地控制药物释放，并可有效避免药物的降解和泄漏适合于多种给药途径；④稳定性好，能提高不稳定药物的稳定性。SLN主要适于包裹水溶性低的药物，用作静脉注射或局部给药，或作为革巴向定位和控释作用的载体。高压乳匀法是采用高压(10-200MPa)推动液体通过狭缝(IOOMPa时只有几个微米宽)，流体在短距离内加速到非常高的速率(大于1000km / h)，同时在极高的剪切力和空穴力作用下，使颗粒尺度达到纳米级。此方法包括两种技术方法热乳匀法和冷乳匀法。热乳勻法是在高于脂质熔点温度以上制备SLN。将载药熔融脂质、相同温度的水和乳化剂等原辅料用高剪切混合设备混匀，然后在脂质熔点以上温度进行混合物的高压乳匀，最后经过冷凝干燥，获得SLN粉末状固体颗粒。通常较高的温度可制得较小的颗粒尺寸，但同时也增加了药物和载体的降解速率。热乳匀法所制备的SLN的平均粒径，取决于乳匀压カ和循环次数，以及药物自身的硬度等因素。冷乳匀法则是将固体脂质与液氮或干冰混合，研磨产生粒径50-100nm的脂质粉末粒子，将粉末分散在表面活性剂溶液中，在低于脂质熔点5_10°C下高压乳匀，通过高压乳匀机的剪切使固体微粒形成SLN。
具体实施方案实施例I :石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备成分为有效剂量的石杉碱甲O. Img和银杏内酯BlOmg，单硬脂酸甘油酯2. Og，牛磺胆酸钠O. 2g，泊洛沙姆1880. 6g，其余为液相用水，共100ml。
制备方法a、在配制罐中，将处方量乳化剂在75°C下搅拌30min，分散均匀制成水相；b、在配制罐中，在65°C下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酷B加入，搅拌均匀，形成脂质相；C、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm) IOmin,制成初乳；d、过均质仪，调节匀化压力至lOOMPa，将溶液反复匀化5次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为106nm，不含大于5μπι的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以ロ服。实施例2 :石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备成分为有效剂量的石杉碱甲0. 15mg和银杏内酯B5mg,单硬脂酸甘油酯L Og,卵磷脂0. 5g，泊洛沙姆F681. 6g，其余为液相用水，共100ml。制备方法a、在配制罐中，将处方量乳化剂在80°C下搅拌分散均匀制成水相；b、在配制罐中，在70°C下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酷B加入，搅拌均匀，形成脂质相；C、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm) IOmin,制成初乳；d、过均质仪(或微射流仪)，调节匀化压カ至lOOMPa，将溶液反复匀化4次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为136nm，不含大于5μπι的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以ロ服。实施例3 :石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备成分为有效剂量的石杉碱甲0. 2mg和银杏内酯B15mg，单硬脂酸甘油酯I. 0g，牛磺胆酸钠0. 5g，泊洛沙姆F681. 6g，其余为液相用水，共100ml。制备方法a、在配制罐中，将处方量乳化剂在90°C下搅拌分散均匀制成水相；b、在配制罐中，在80°C下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酷B加入，搅拌均匀，形成脂质相；
C、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm) IOmin,制成初乳；d、将初乳在功率400W下进行探头超声5min，保持70°C，得到均匀的乳剤，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为146nm，不含大于5μπι的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以ロ服。实施例4 :石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备成分为有效剂量的石杉碱甲O. 25mg和银杏内酯B20mg，单硬脂酸甘油酯I. Og，卵磷脂O. 5g，泊洛沙姆F681. 6g，其余为液相用水，共100ml。制备方法 a、在配制罐中，将处方量乳化剂在85°C下搅拌分散均匀制成水相；b、在配制罐中，在75°C下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酷B加入，搅拌均匀，形成脂质相；C、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm) IOmin,制成初乳；d、将初乳在功率400W下进行探头超声5min，保持70°C，得到均匀的乳剤，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为146nm，不含大于5μπι的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以ロ服。实施例5 :石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备成分为有效剂量的石杉碱甲O. 3mg和银杏内酯B 25mg，Compritol888 ΑΤΟ I. Og,卵磷脂O. 5g，泊洛沙姆F68 I. 6g，其余为液相用水，共100ml。制备方法a、在配制罐中，将处方量乳化剂在80°C下搅拌分散均匀制成水相；b、在配制罐中，在70°C下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酷B加入，搅拌均匀，形成脂质相；C、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm) IOmin,制成初乳；d、过均质仪(或微射流仪)，调节匀化压カ至90MPa，将溶液反复匀化15次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为276nm，不含大于5μπι的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以ロ服。实施例6 :石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备成分为有效剂量的石杉碱甲0. 35mg和银杏内酯B30mg，Compritol 888 AT01. Og,卵磷脂0. 5g，泊洛沙姆F68 I. 6g，其余为注射用水，共100ml。制备方法a、在配制罐中，将处方量乳化剂在80°C下搅拌分散均匀制成水相；b、在配制罐中，在70°C下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酷B加入，搅拌均匀，形成脂质相；C、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm) IOmin,制成初乳；d、将初乳在功率400W下进行探头超声5min，保持70°C，得到均匀的乳剤，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为321nm，不含大于5μπι的乳粒。所得乳剂可以注射也可以ロ服。实施例7 :石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备本发明石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒，该纳米粒成分为有效剂量的石杉碱甲O. 4mg和银杏内酯B35mg，单硬脂酸甘油酯I. Og，牛磺胆酸钠O. 5g，泊洛沙姆F680. 6g，其余为液相用水，共100ml。制备方法a、在配制罐中，将处方量乳化剂和助乳化剂在75°C下搅拌30min，分散均匀制成水相；b、在配制罐中，在70°C下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酷B加入，搅拌均匀，形成脂质相；C、把水相一次性快速加入脂质相，在6000rpm的转速下高速搅拌IOmin,制成初乳；d、过均质仪，调节匀化压力至lOOMPa，将溶液反复匀化5次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为106nm，不含大于5μπι的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以ロ服。 实施例8:本发明石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒，该纳米粒成分为有效剂量的石杉碱甲O. 45mg和银杏内酯B40mg，单硬脂酸甘油酯I. 0g，卵磷脂O. 2g，泊洛沙姆F681. 6g，其余为液相用水，共100ml。制备方法a、在配制罐中，将处方量乳化剂和助乳化剂在80°C下搅拌分散均匀制成水相；b、在配制罐中，在70°C下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酷B加入，搅拌均匀，形成脂质相；C、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm) IOmin,制成初乳；d、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至lOOMPa，将溶液反复匀化10次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为136nm，不含大于5μπι的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以ロ服。实施例9:本发明石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒，该纳米粒成分为有效剂量的石杉碱甲0. 2mg和银杏内酯B25mg，单硬脂酸甘油酯I. Og,牛磺胆酸钠0. 2g，泊洛沙姆F681. 6g，其余为液相用水，共100ml。上述的固体脂质纳米粒制备方法如下a、在配制罐中，将处方量乳化剂和助乳化剂在85°C下搅拌分散均匀制成水相；b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酯B加入，搅拌均匀，形成脂质相；C、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm) IOmin,制成初乳；d、将初乳在功率400W下进行探头超声5min，保持70°C，得到均匀的乳剤，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为176nm，不含大于5μπι的乳粒。实施例10 本发明石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒，该纳米粒成分为有效剂量的石杉碱甲O. 05mg和银杏内酷B50mg,单硬脂酸甘油酯I. Og,卵磷脂O. 5g，泊洛沙姆F681. 6g，其余为液相用水，共100ml。
上述的固体脂质纳米粒制备方法如下a、在配制罐中，将处方量乳化剂和助乳化剂在75°C下搅拌分散均匀制成水相；b、在配制罐中，在65°C下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酷B加入，搅拌均匀，形成脂质相；C、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm) IOmin,制成初乳；将初乳在功率400W下进行探头超声5min，保持70°C，得到均匀的乳剤，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为142nm，不含大于5μπι的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以ロ服。实施例11 本发明石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备，该纳米粒成分为有效剂量 的石杉碱甲O. Img和银杏内酉旨B5mg, Compritol888 ΑΤΟ I. 0g，卵磷月旨O. 5g,泊洛沙姆F68
I.6g，其余为液相用水，共100ml。上述的固体脂质纳米粒制备方法如下a、在配制罐中，将处方量乳化剂和助乳化剂在90°C下搅拌分散均匀制成水相；b、在配制罐中，在相同温度下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酯B加入，搅拌均匀，形成脂质相；C、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm) IOmin,制成初乳；d、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至lOOMPa，将溶液反复匀化10次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为276nm，不含大于5μπι的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以ロ服。实施例12 本发明石杉碱甲和银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备，该纳米粒成分为有效剂量的石杉碱甲0. 4mg和银杏内酯B25mg,单硬脂酸甘油酯I. Og,甘胆酸钠0. 5g,泊洛沙姆F680. 8g，其余为液相用水，共100ml。上述的固体脂质纳米粒制备方法如下a、在配制罐中，将处方量乳化剂在80°C下搅拌分散均匀制成水相；b、在配制罐中，在70°C下将处方量固态脂质相熔化，再将处方量石杉碱甲和银杏内酷B加入，搅拌均匀，形成脂质相；C、把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌(6000rpm) IOmin,制成初乳；d、过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至lOOMPa，将溶液反复匀化10次，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。平均粒径为126nm，不含大于5μπι的乳粒。所得固体脂质纳米粒可以ロ服。实施例13 本发明石杉碱甲和银杏内酯B复方片剂的制备，该片剂的主要成分为有效剂量的石杉碱甲0. 2mg和银杏内酯B25mg，辅料为淀粉、糊精、甲基纤维素、硬脂酸镁等，采用湿法制粒压片法制备片剂。參照中国药典2010版二部附录I项下的片剂制剂通则对所得片剂进行检查，溶出度、释放度、含量均匀度、微生物限度均符合要求。所得复方片剂可有用于ロ服。实施例14
本发明石杉碱甲和银杏内酯B复方片剂的制备，该片剂的主要成分为有效剂量的石杉碱甲O. 4mg和银杏内酯B40mg，辅料为淀粉、糊精、甲基纤维素、硬脂酸镁等，采用湿法制粒压片法制备片剂。參照中国药典2010版二部附录I项下的片剂制剂通则对所得片剂进行检查，溶出度、释放度、含量均匀度、微生物限度均符合要求。所得复方片剂可有用于ロ服。实施例15 本发明石杉碱甲和银杏内酯B复方胶囊剂的制备，该胶囊剂主要成分为有效剂量的石杉碱甲O. 2mg和银杏内酯B25mg，辅料为乳糖、淀粉。将所得的纳米粒采用喷雾干燥法制备成干燥的粉末，加入辅料制备成硬胶囊制剂。药物辅料为1:10。采用3号规格的胶囊制备成固体脂质纳米粒胶囊制剂。參照中国药典2010版二部附录I项下的胶囊剂制剂通则对所得胶囊剂进行检测，外观、装量差异、崩解度、溶出度均符合要求。所得复方胶囊可有用于ロ服。实施例16 本发明石杉碱甲和银杏内酯B复方胶囊剂的制备，该胶囊剂主要成分为有效剂量的石杉碱甲O. 3mg和银杏内酯B15mg，辅料为乳糖、淀粉。将所得的纳米粒采用喷雾干燥法制备成干燥的粉末，加入辅料制备成硬胶囊制剂。药物辅料为1:10。采用3号规格的胶囊制备成固体脂质纳米粒胶囊制剂。參照中国药典2010版二部附录I项下的胶囊剂制剂通则对所得胶囊剂进行检测，外观、装量差异、崩解度、溶出度均符合要求。所得复方胶囊可有用于ロ服。下面结合实验来证明本发明的效果本发明的对比试验采用Caco-2细胞模型实验方法I.实验材料和方法实验材料Caco_2细胞模型实验Caco_2细胞株(ATCC)，DMEM培养基(gibco公司)，青霉素和链霉素、非必需氨基酸、新生牛血清、丙酮酸、胰酶(hyclon公司)，EDTA,Hepes (amresco公司),石杉碱甲(99%、西安融升生物科技有限公司、批号RS20110518)、银杏内酯B (98%、西安融升生物科技有限公司、批号RS20110614)。Caco-2细胞模型实验方法I) Caco-2细胞按密度I X 105个细胞/cm2，接种到培养瓶中，置于含5%C02恒温(37°C,相对湿度90%)培养箱中静置培养,姆隔一天换液一次。2)细胞汇合程度达到80%时，进行细胞传代。3)将原细胞培养液倒出，用不含Ca2+和Mg2+的HBss清洗两次，4)加入O. 25%胰蛋白酶-O. 02%EDTA混合消化液，使瓶底细胞都浸入溶液中，37°C消化5min,取出，5)加入适量培养液后倒入离心管中，混合后低速离心，除去上清液，加入适量培养液，用吸管轻轻吹打细胞成单细胞悬液，再加入适量培养液，使细胞的浓度分别为1X105个 /mL06)取Caco-2细胞的浓度为I X 105个细胞/cm2悬液O. 4mL,接种transwellITM膜Apical侧，接种后每隔一天换液一次，一周后每日换液，7) Caco-2 细胞培养至 21d。2.统计方法
本研究的数据以测定值以 ±s表示，采用SPSS 13. O软件包分析，组间比较采用t检验。3.实验方法Hup-A和GB的跨Caco_2细胞模型的转运试验AP — BL 转运(吸收)将符合转运条件且细胞生长形态完好的transwell膜用37°C的HBSS轻柔地清洗细胞单层3次，洗去细胞单分子层表面的杂质，最后一次置于37°C培养箱中培养30min。吸去缓冲溶液，在AP侧(肠腔侧、供给池)分别加入含有Hup-A的浓度为(O. 1,0. 2,0. 4mg/ml WPGB的浓度为(0、12.5、25、5011^/1111)的HBSS O. 4mL，作为供给液，在BL侧(基底侧、接受池)加入O. 6mL空白HBSS作为接收液。将载有transwellTM的24孔板于恒温摇床(37，C，50对min)中温孵，分别在不同时间(0，10，30，60，90，120，150，180min)从接受池吸 取O. ImL接收液，同时补加O. ImL空白HBSS。实验结束后再对细胞进行跨膜电阻測定，以确定细胞有没有被损伤而影响实验結果。根据HupA和GB的标准曲线计算跨过细胞单层的药物浓度，最后再求累积透过量，表观渗透系数。BL —AP 转运(分泌)方法基本同AP —BL转运(吸收)，不同的是在BL侧(供给池)加入含有受试药物的HBSS O. 6mL,作为供给液，在AP侧(接受池)加入O. 4mL空白HBSS作为接收液。Hup-A和GB的跨Caco_2细胞模型的转运试验高效液相紫外检测器測定不同浓度的石杉碱甲的峰面积，以峰面积对浓度做标准曲线，得出 Hup-A 标准曲线在 O. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10mg/mL 内，A=23363C+90310 ；r2=0. 9997高效液相蒸发光检测器測定不同浓度银杏内酯B的峰面积，以峰面积对浓度做标准曲线，得出 GB 标准曲线在 5、10、20、40、60、80、100mg/mL 内，A=786633C+9 X 106 ；r2=0. 9996不同浓度Hup-A和GB在Caco_2细胞单层模型上的吸收实验前进行TEER測定，确定细胞单层生长的完整性。选取符合实验要求的Caco-2单层细胞进行透过实验，将测得的峰面积代入Hup-A及GB标准曲线的透过浓度，计算累计透过量。如图所示。由此可见，在Caco-2细胞模型上石杉碱甲累积透过量随时间延长逐渐增加，不同浓度的石杉碱甲加入不同浓度的银杏内酯B后，统计累积吸收量较比单独加入石杉碱甲时有所升高。当加入50mg/mL的银杏内酯B后，累积吸收量反而减少，提示，银杏内酯B在Caco-2细胞模型上的吸收存在饱和性。通过比较累积吸收量，得出0. 2mg/mL的石杉碱甲和25mg/mL的银杏内酯B联合用药时，透过Caco-2细胞模型的累积吸收量最大。本发明的药效学采用大鼠缺血性痴呆模型进行研究采用双侧颈总动脉缩窄法制备大鼠缺血性痴呆的模型，选取术后存活7d的有显著学习记忆障碍的大鼠50只为血管性痴呆大鼠模型，随即分为5组，即模型组、固体脂质纳米粒组低高剂量组、固体脂质纳米粒中剂量组、固体脂质纳米粒高剂量组、阳性对照组I (市售石杉碱甲片)；另选取术后7d假手术组的大鼠10只为正常组。各给药组均采用灌胃方法给药。高剂量组给予复方石杉碱甲固体脂质纳米粒毎日40mg/kg，中剂量组给予药量为毎日20mg/kg，低剂量组给药量为每日10mg/kg，阳性对照组给予石杉碱甲片的悬浮液毎日O. 4mg/kg，连续给药21天，正常组合模型组均给予等容量生理盐水灌胃，次数及疗程同上。检测指标如下こ酰胆碱酯酶活性的測定及5-羟色胺含量測定①取脑组织上清液为样品，严格按胆碱酯酶试剂盒说明书程序測定脑组织胆碱酯酶活性。②将大鼠迅速处死，取脑，迅速放入冰冷的生理盐水中，去除脑膜和血管，分离海马，称重，放入预先冰冷的玻璃匀浆器中，加入正丁醇5ml和HCl (O. Olmol) O. 7ml，匀浆2min，倾出匀浆至离心管中，1500rpm离心lOmin，吸上清液2ml加入O. Imol磷酸盐缓冲液(pH6. 5)1. 5ml的带塞离心管中，振摇IOmin0吸2ml上清液到含有5ml正庚烷和O. 5mlHCl (O. Imol)的带塞离心管中，振摇lOmin, 5-HT被抽提到HCl溶液中，分别离心(300rpm/min,lOmin)，分开有机相和水相。O. 3mlHCl溶液用邻苯ニ甲醛缩合法測定5-羟色胺的含量。结果如表各组大鼠脑组织こ酰胆碱酯酶及海马5-羟色胺含量的变化(I ±6う
权利要求
1.一种治疗脑缺血性痴呆的药物，其特征在于所述药物应用在治疗缺血性脑痴呆上；该药物主要由石杉碱甲和银杏内酯B制备而成，其中石杉碱甲与银杏内酯B的质量比例为0· 05 O. 5 :5 50。
2.根据权利要求I所述的治疗脑缺血性痴呆的药物，其特征在于所述药物为石杉碱甲和银杏内酯B结合的固体脂质纳米粒，其中石杉碱甲与银杏内酯B的质量比例为O.05 O. 5 :5 50 ;固体脂质纳米粒含有非药性成分的药用辅料，药用辅料包括固体脂质和乳化剂，药用辅料与石杉碱甲和银杏内酯B的质量比例为50 200: O. 05 O. 5 :5 50。
3.根据权利要求I所述的治疗脑缺血性痴呆的药物，其特征在于所述的固体脂质主要包括甘油三酯，部分甘油，脂肪酸，类固醇和蜡类中的一种或多种混合物。
4.根据权利要求I所述的治疗脑缺血性痴呆的药物，其特征在于所述的乳化剂包括磷脂类、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、泊洛沙姆188、胆酸盐类、吐温类、短链醇类、司盘类中的一种或多种混合物。
5.根据权利要求I所述的治疗脑缺血性痴呆的药物，其特征在于所制固体脂质纳米粒的粒径范围是IOnm 5 μ m。
6.一种如权利要求I所述治疗脑缺血性痴呆药物的制备方法，其特征在于该方法按如下步骤进行 (I )在配制罐中，将处方量乳化剂在70 90°C下搅拌分散均匀制成水相； (2 )在配制罐中，在60 80°C下将处方量固态脂质相熔化,再将处方量石杉碱甲和银杏内酯B加入，搅拌均匀，形成脂质相； (3 )把水相一次性快速加入脂质相，高速搅拌6000 28000rpm搅拌10分钟，制成初乳； (4 )过均质仪或微射流仪，调节匀化压力至400 1200bar，将溶液反复匀化，得到均匀的乳剂，过微孔滤膜，降至室温，即得本品。
全文摘要
本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种治疗脑缺血性痴呆的药物及其制备方法。该药物主要由石杉碱甲和银杏内酯B制备而成，或为石杉碱甲和银杏内酯B结合的固体脂质纳米粒，其中石杉碱甲与银杏内酯B的质量比例为0.05～0.55～50。本发明的目的是石杉碱甲片药物的口服生物利用度很低，且不易通过血脑屏障，影响药物的吸收；单纯使用银杏叶提取物片剂和注射剂中，存在操作简单，病人每天所需的药量很大，长期使用会给病人带来很多副作用；以往治疗缺血性脑痴呆的药物中，大多是利用石杉碱甲与某些中药联合应用，成分复杂，作用机理不清楚、重复性不好。
文档编号A61K9/107GK102813653SQ20121030123
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月22日 优先权日2012年8月22日
发明者郭涛, 张琦, 孙学惠, 刘丛丛 申请人:郭涛, 张琦