硫化氢及其供体硫氢化钠在制备治疗糖尿病药物中的用途
【专利摘要】本发明属药物制药领域，涉及硫化氢及其供体硫氢化钠在制药中新的药用用途，尤其涉及硫化氢及其供体硫氢化钠在制备治疗糖尿病药物中的用途。本发明采用外源性硫化氢及其供体硫氢化钠NaHS用于胰岛素增敏和对II型糖尿病降血糖及增高胰岛素水平的试验，经骨骼肌和脂肪细胞与胰岛素抵抗的相关性试验，糖尿病胰岛素抵抗的动物模型进行胰岛素耐量实验，葡萄糖消耗实验，糖尿病胰岛素抵抗的动物模型试验以及给予NaHS干预动物实验等，结果显示：NaHS可以在胰岛素存在的情况下起到促进葡萄糖摄取的作用，显示了增强胰岛素的作用。本发明的硫化氢及其供体硫氢化钠可作为胰岛素增敏剂和对Ⅱ型糖尿病降血糖及增高胰岛素水平的药物。
【专利说明】硫化氢及其供体硫氢化钠在制备治疗糖尿病药物中的用途
【技术领域】
[0001]本发明属药物制药领域，涉及硫化氢及其供体硫氢化钠在制药中新的药用用途，尤其涉及硫化氢及其供体硫氢化钠在制备治疗糖尿病药物中的用途。本发明的硫化氢及其供体硫氢化钠可作为胰岛素增敏剂和对II型糖尿病降血糖及增高胰岛素水平的药物。
【背景技术】
[0002]现有技术公开了硫化氢(H2S)是人体内半胱氨酸的代谢产物，其在人体内的含量很低约为20~50 μ mol/L,且不易人为控制，文献还报道H2S是一种参与调控心血管活动的新型内源性气体分子，具有促进心血管疾病血管新生的用途。
[0003]统计报道，目前，糖尿病在我国人群发病率为1_2%，老年人中可高达12%。根据国际糖尿病专家委员会修改的糖尿病诊断标准，空腹血糖诊断标准为> 126mg/ml,糖尿病的发病率呈逐年上升趋势，2型糖尿病(大多数为老年糖尿病)的病人显著增加，对人类健康的危害也将更大。
[0004]目前，临床对2型糖尿病的治疗，一般采用饮食结合降糖药物治疗作为基本方法。口服降血糖药物主要用西药治疗，但是，实践显示，西药对糖尿病病人的心血管及肝、肾等均有不良副作用，并且对于多种并发症者不宜使用。多年来，国内外内分泌、糖尿病专家、学者从诸多方面探讨治疗糖尿病的各种方法和药物。人们期盼有更安全、有效、且无副作用的新的治疗药物早日问世。
【发明内容】
[0005]本发明的的目的是提供硫化氢(H2S)及其供体硫氢化钠(NaHS)在制药中的新用途。尤其涉及硫化氢及其供体硫氢化钠在制备治疗糖尿病药物中的用途。本发明的硫化氢及其供体硫氢化钠可作为胰岛素增敏剂和对II型糖尿病降血糖及增高胰岛素水平的药物。
[0006]本发明采用外源性硫化氢及其供体硫氢化钠NaHS用于胰岛素增敏和对II型糖尿病降血糖及增高胰岛素水平的试验，包括:骨骼肌和脂肪细胞与胰岛素抵抗的相关性试验，糖尿病胰岛素抵抗的动物模型进行胰岛素耐量实验，葡萄糖消耗实验，糖尿病胰岛素抵抗的动物模型试验以及给予NaHS干预动物实验等，结果显示=NaHS可以在胰岛素存在的情况下起到促进葡萄糖摄取的作用，提示NaHS可以增强胰岛素的作用，硫化氢及其供体硫氢化钠可作为胰岛素增敏剂；
[0007]通过骨骼肌和脂肪细胞与胰岛素抵抗的相关性试验，结果证实，NaHS在对培养细胞基本无毒的安全浓度范围内显著增加胰岛素刺激下的骨骼肌和脂肪细胞葡萄糖的代谢；
[0008]通过糖尿病胰岛素抵抗的动物模型进行胰岛素耐量实验，结果显示小剂量的H2S可以增加GK大鼠的胰岛素敏感性；
[0009]通过葡萄糖消耗实验结果证实,NaHS在对培养细胞基本无毒的安全浓度范围内显著增加胰岛素刺激下的骨骼肌和脂肪细胞葡萄糖的代谢；硫化氢对于脂肪细胞正常和模型细胞基础状态的葡萄糖摄取都有促进作用，但对于骨骼肌细胞基础状态的葡萄糖摄取没有影响；
[0010]通过糖尿病胰岛素抵抗的动物模型试验，结果显示，硫化氢及其供体硫氢化钠对II型糖尿病具有降血糖及胰岛素增敏作用，可以增高胰岛素水平；
[0011]通过慢性给予NaHS动物实验，结果显示，慢性给予NaHS可减少GK大鼠肾脏中ROS的表达以及可减少GK大鼠肾脏中发生新月体病变的肾小球数量，表明硫化氢及其供体硫氢化钠对糖尿病引起的肾脏损伤具有保护作用，即具有防治糖尿病肾脏病发征的作用，还可以减少肾脏的氧化应激。
[0012]实验结果证明，本发明所述的硫化氢及其供体硫氢化钠NaHS可作为胰岛素增敏剂，和通过降血糖及胰岛素增敏作用，可以增高胰岛素水平，作为治疗II型糖尿病药物，所述的硫化氢及其供体硫氢化钠对糖尿病引起的肾脏损伤具有保护作用，可防治糖尿病肾脏病发征的作用，还可以减少肾脏的氧化应激。
[0013]本发明的H2S及其供体NaHS的优点有:
[0014]1、硫化氢及其供体硫氢化钠可作为胰岛素增敏剂；
[0015]2、硫化氢及其供体硫氢化钠对II型糖尿病具有降血糖及胰岛素增敏作用，可以增高胰岛素水平；
[0016]3、硫化氢及其供体硫氢化钠对糖尿病引起的肾脏损伤具有保护作用，即具有防治糖尿病肾脏病发征的作用，还可以减少肾脏的氧化应激。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1.不同浓度的NaHS (0_200 μ mol/L)孵育骨骼肌细胞24小时后，对胰岛素刺激状态下葡萄糖摄取的影响。
[0018]图2.不同浓度的NaHS (0_200 μ mol/L)孵育脂肪细胞24小时后，对胰岛素刺激状态下葡萄糖摄取的影响。
[0019]图3.不同浓度的NaHS(0_200 μ mol/L)孵育胰岛素抵抗的骨骼肌细胞24小时后，对胰岛素刺激状态下葡萄糖摄取的影响。
[0020]图4.不同浓度的NaHS (0_200 μ mol/L)孵育胰岛素抵抗的脂肪细胞24小时后，对胰岛素刺激状态下葡萄糖摄取的影响。
[0021]图5.对照组和NaHS (50 μ mol/L)低糖(5.5mmol/L)孵育胰岛素抵抗的骨骼肌细胞24小时后,对不同浓度胰岛素(0-100nmol/L)刺激状态下葡萄糖摄取的影响。
[0022]图6.对照组和NaHS (50 μ mol/L)低糖(5.5mmol/L)孵育胰岛素抵抗的脂肪细胞24小时后,对不同浓度胰岛素(0-100nmol/L)刺激状态下葡萄糖摄取的影响。
[0023]图7.对照组和NaHS (50 μ mol/L)高糖(25mmol/L)孵育胰岛素抵抗的骨骼肌细胞24小时后,对不同浓度胰岛素(0-100nmol/L)刺激状态下葡萄糖摄取的影响。
[0024]图8.对照组和NaHS (50 μ mol/L)高糖(25mmol/L)孵育胰岛素抵抗的脂肪细胞24小时后,对不同浓度胰岛素(0-100nmol/L)刺激状态下葡萄糖摄取的影响。
[0025]图9.腹腔注射胰岛素后(0.75U/kg)，G`K大鼠血糖的时间变化曲线。
[0026]图10.腹腔注射胰岛素后(0.75U/kg)，Wistar大鼠血糖的时间变化曲线。
[0027]图11.腹腔注射胰岛素后(0.40U/kg), Wistar大鼠血糖的时间变化曲线。[0028]图12.NaHS给药10周期间GK大鼠和Wistar大鼠慢性空腹血糖变化。
[0029]图13.GK大鼠慢性给药8周后糖耐量实验
[0030]图14.Wistar大鼠慢性给药8周后糖耐量实验
[0031]图15.GK大鼠慢性给药8周后胰岛素水平变化
[0032]图16.慢性给药10周后，GK大鼠的肾脏内ROS表达和发生新月体病变的肾小球数量。
【具体实施方式】
[0033]实施例1硫化氢及其供体硫氢化钠作为胰岛素增敏剂试验
[0034]不同浓度的NaHS (1_200 μ mol/L)孵育24小时后，对于正常的骨骼肌细胞基础状态下的葡萄糖摄取没有影响，检测了在胰岛素存在的情况下NaHS对于骨骼肌细胞葡萄糖摄取有没有作用，检测不同浓度的NaHS (0-200 μ mol/L)孵育葡萄糖(5.5 μ mol/L)和胰岛素(lOOnmol/L)抵抗的骨骼肌细胞24小时后，对胰岛素刺激状态下葡萄糖摄取的影响，结果显示(如图1所示)，NaHS在25、50和100 μ mol/L的浓度均显著增加3H-脱氧葡萄糖摄取，NaHS促进葡萄糖摄取的最佳浓度为100 μ mol/L,与对照组相比增加超过I倍，为
2.06±0.29(P < 0.01)，25和50 μ mol/L的NaHS分别增加葡萄糖摄取率到1.54±0.08和
1.72±0.32 ;结果表明NaHS可以在胰岛素存在的情况下起到促进葡萄糖摄取的作用，提示NaHS可以增强胰岛素的作用，即胰岛素增敏作用；
[0035]不同浓度的NaHSjW(OjOOymoVL)孵育24小时后，对于正常的脂肪细胞胰岛素刺激状态下的葡萄糖摄取没有影响，提示NaHS对于脂肪细胞的葡萄糖摄取起作用可能不通过胰岛素；不同浓度的NaHS，从(0-200 μ mo I /L )孵育24小时后，进行葡萄糖摄取实验，结果显示(如图2所示)，硫化氢对于正常的脂肪细胞胰岛素存在状态下的葡萄糖摄取有明显促进作用，NaHS在25、50和100 μ mol/L的浓度均显著增加3H-脱氧葡萄糖摄取，与骨骼肌细胞不同，NaHS促进脂肪细胞葡萄糖摄取的最佳浓度为50 μ mol/L,为对照组的1.54倍；
[0036]结果表明，脂肪组织在葡萄糖转运中的起的作用远小于骨骼肌组织，骨骼肌组织参与全身葡萄糖摄取的75%，NaHS有效浓度所引起的脂肪细胞3H-脱氧葡萄糖摄取的增加的幅度远小于骨骼肌细胞。
[0037]胰岛素敏感性在II型糖尿病中严重受损，我们在正常的骨骼肌成肌细胞上观察到硫化氢能增加胰岛素存在时的葡萄糖摄取，但对基础状态的葡萄糖摄取没有影响。这种结果提示我们硫化氢可能有一定的胰岛素增敏作用。
[0038]依据糖尿病时胰岛素抵抗患者体内普遍存在高胰岛素或/和高血糖的病理特点，本实施例中根据相关文献报道，在正常培养骨骼肌细胞的基础上，用高浓度胰岛素高糖的环境诱导培养骨骼肌细胞，建立胰岛素抵抗的细胞模型(IR模型)，并通过3H-脱氧葡萄糖摄取试验进行鉴定，检测基础状态和胰岛素刺激状态下硫化氢对胰岛素抵抗的细胞的葡萄糖摄取的作用。
[0039]其中包括，
[0040]建立胰岛素抵抗的细胞模型，以模型组(IR)的葡萄糖摄取量作为摄取基值，各组分别与之相比作为各自葡萄糖摄取率，结果显示，NaHS孵育24小时后对于IR模型骨骼肌细胞的基础葡萄糖摄取没有影响，这与正常细胞基础状态的结果一致，提示NaHS起作用依赖于胰岛素的存在；
[0041]进一步研究在胰岛素存在情况下NaHS对于IR模型的细胞葡萄糖摄取的作用，结果显不，
[0042]在胰岛素刺激(100nmol/L)的情况下，NaHS在25、50和100 μ mol/L的浓度均显著增加IR模型L6细胞的3H-脱氧葡萄糖摄取(如图3所示)，其中50和100 μ mol/L的NaHS对于IR细胞的作用相近，而且在IR模型细胞中NaHS有效浓度引起的葡萄糖摄取的增加程度明显小于正常细胞，25、50和100 μ mol/L的NaHS分别增加葡萄糖摄取到1.61 ±0.57、
1.72±0.53和1.56±0.36倍，说明NaHS在病理状态下可以起到促进葡萄糖摄取的作用；
[0043]不同浓度的NaHS，从0_200 μ mol/L孵育24小时后，对于正常的脂肪细胞胰岛素刺激状态下的葡萄糖摄取没有影响，25 μ mol/L的NaHS与对照相比，葡萄糖摄取率有增加，提示NaHS对于脂肪细胞的葡萄糖摄取起作用可能不通过胰岛素；
[0044]不同浓度的NaHS，从0_200 μ mol/L孵育24小时后，进行葡萄糖摄取实验，硫化氢对于正常的脂肪细胞胰岛素存在状态下的葡萄糖摄取有明显促进作用，NaHS在25、50和100 μ mol/L的浓度均显著增加3H-脱氧葡萄糖摄取，与骨骼肌细胞不同，NaHS促进脂肪细胞葡萄糖摄取的最佳浓度为50 μ mol/L,为对照组的1.54倍；
[0045]不同浓度的NaHS，从0-200 μ mol/L孵育24小时后，对于IR模型脂肪细胞胰岛素刺激状态下的葡萄糖摄取没有影响，50 μ mol/L的NaHS与对照相比，葡萄糖摄取率略有增加；
[0046]细胞经高糖高胰岛素联合诱导培养建立胰岛素抵抗的细胞模型，以模型组(IR)的葡萄糖摄取量作为摄取基值，各组分别与之相比作为各自葡萄糖摄取率(如图4所示)，NaHS孵育24小时后对于IR模型的脂肪细胞胰岛素刺激下的葡萄糖摄取有促进作用，与正常的脂肪细胞的结果一致，NaHS促进IR模型脂肪细胞葡萄糖摄取的最佳浓度是50 μ mol/L,为对照组的 2.02±0.86 倍，25 和 100 μ mol/L 的 NaHS 增加到 1.75±0.68 和 1.56±0.44 倍。
[0047]本实施例中检测了硫化氢对不同浓度胰岛素(O-lOOnmol/L)刺激状态下葡萄糖摄取的影响，结果显示，
[0048]对照组和NaHS (50 μ mol/L)处理组低糖(5.5mmol/L)孵育胰岛素抵抗的骨骼肌细胞(如图5所示)和脂肪细胞(如图6所示)24小时后，胰岛素浓度为10和lOOnmol/L时，NaHS处理组与对照相比，葡萄糖摄取有明显增加，其中0、1和5nmol/L时无显著差异；
[0049]对照组和NaHS (50 μ mol/L)处理组高糖(25mmol/L)孵育胰岛素抵抗的骨骼肌细胞(如图7所示)和脂肪细胞(如图8所示)24小时后，胰岛素浓度为10和lOOnmol/L时，NaHS处理组与对照相比，葡萄糖摄取有明显增加，其中0、1和5nmol/L时无显著差异；
[0050]实施例2骨骼肌和脂肪细胞与胰岛素抵抗的相关性试验
[0051]本实施例中采用现有技术中广泛应用的胰岛素抵抗及糖尿病细胞:其中，骨骼肌成肌细胞株是Yaffe从大鼠大腿肌的原代培养物中分离得到的，在一定的培养条件下可融合形成多核的肌管和横纹肌纤维；脂肪细胞株来源于小鼠胚胎成纤维细胞，经克隆扩增成为前脂肪细胞系，再经特定的分化剂诱导分化为成熟脂肪细胞；
[0052]I)细胞水平胰岛素敏感性的评价
[0053]利用细胞对同位素标记的葡萄糖摄取实验，评价细胞对胰岛素刺激的葡萄糖摄取和利用能力，从而评价胰岛素的敏感性，判断胰岛素抵抗是否存在；[0054]葡萄糖消耗实验:通过测定处理24小时后培养基中的糖浓度计算糖消耗的量，评判细胞摄取糖的能力，以反映细胞的葡萄糖代谢情况，因此，本实施例结合葡萄糖消耗和葡萄糖摄取的结果综合评价硫化氢对骨骼肌细胞和脂肪细胞的胰岛素敏感性的影响，其中，包括生理和病理状态下硫化氢对骨骼肌细胞和脂肪细胞的葡萄糖摄取的作用；
[0055]( 1)建立胰岛素抵抗细胞模型
[0056]用高糖高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗细胞模型，以模拟胰岛素抵抗患者体内高血糖高胰岛素血症的病理环境，其中，分化的脂肪细胞和骨骼肌细胞肌管采用高浓度胰岛素及高糖诱导培养24h，再以3H-脱氧葡萄糖摄取试验进行验证；
[0057]实验中以MTT法监测各药物有效成分在不同浓度时对脂肪细胞和骨骼肌细胞活力的影响，结果显示，NaHS浓度为10到200 μ mol/L时对细胞活力无明显影响，浓度大于500 μ mol/L后对细胞有一定的毒性,本实施例确定之后的葡萄糖消耗和葡萄糖摄取实验所用浓度为10到200 μ mol/L。
[0058]葡萄糖消耗实验结果证实，NaHS在对培养细胞基本无毒的安全浓度范围内显著增加胰岛素刺激下的骨骼肌和脂肪细胞葡萄糖的代谢；
[0059]正常和胰岛素抵抗模型细胞的3H-脱氧葡萄糖摄取试验结果显示，模型细胞葡萄糖摄取能力在基础和胰岛素刺激状态下与正常细胞相比都有明显下降，高浓度葡萄糖高浓度胰岛素能明显抑制葡萄糖的摄取；
[0060]药物干预结果显示，硫化氢对于脂肪细胞正常和模型细胞基础状态的葡萄糖摄取均有促进作用，但对于骨骼肌细胞基础状态的葡萄糖摄取没有影响；在胰岛素存在时，NaHS可显著增加脂肪细胞和骨骼肌细胞的葡萄糖摄取，且这种作用在正常和胰岛素抵抗模型细胞中都存在；结果提示，硫化氢对骨骼肌细胞和脂肪细胞的作用机制可能有所不同。
[0061]实施例3硫化氢及其供体硫氢化钠对II型糖尿病的降血糖及胰岛素增敏作用
[0062]选择2月龄的GK大鼠作为本实施例糖尿病胰岛素抵抗的动物模型；
[0063]常规进行胰岛素耐量试验，实验结果表明，在慢性给药的大鼠腹腔注射一定量胰岛素之后60分钟，GK大鼠NaHS 30 μ mol/kg组的血糖下降的比例明显大于对照组(如图9所示)，Wistar大鼠NaHS 60 μ mol/kg组的血糖下降的比例明显大于对照组(如图10所示)；胰岛素敏感性实验，采用低浓度的胰岛素(0.4U/kg)饥饿4小时Wistar大鼠，NaHS60 μ mol/kg组与对照组比较有明显下降(如图11所示)，结果表明，小剂量的H2S可以增加GK大鼠的胰岛素敏感性；
[0064]在NaHS给药后2、4、6周分别检测GK糖尿病大鼠的空腹血糖含量(如图12所示)，给药4周后小剂量NaHS (30 μ mol/kg)即表现出降血糖效应，与对照组相比有明显差别，表明低浓度H2S能降低GK糖尿病大鼠的空腹血糖。
[0065]糖耐量试验示各组GK大鼠在糖负荷后各时间点的血糖均显著高于Wistar组，说明GK大鼠糖耐量降低(如图13所示)，在腹腔注射葡萄糖30分钟和90分钟时，NaHS给药低剂量组的大鼠的血糖浓度明显低于对照组；糖负荷后30和90分钟NaHS 30 μ mol/kg组的血糖值比对照组显著降低，说明NaHS使糖耐量增高；
[0066]在腹腔注射葡萄糖30分钟时NaHS低剂量组(30和60 μ mol/kg)与对照组血糖值具有显著性差异(如图14所示)，在腹腔注射葡萄糖60分钟时NaHS 60 μ mol/kg组与对照组血糖值具有显著性差异，表明H2S对Wistar大鼠糖尿病葡萄糖耐量有影响；[0067]低浓度NaHS (30 μ mol/kg/d)可以改善GK大鼠的胰岛素抵抗，降低空腹血糖(FBG)，增加葡萄糖耐量，而大剂量NaHS (120 μ mol/kg/d)则加重了 GK大鼠的胰岛素抵抗，空腹血糖升高，葡萄糖耐量降低，结果表明H2S对于体内的胰岛素抵抗有双重调节作用。
[0068]实施例4硫化氢及其供体硫氢化钠对糖尿病引起的肾脏损伤的保护作用
[0069]按常规方法慢性给予NaHS不同浓度(30、60和120 μ mol/L) 10周后，观察GK大鼠肾脏内ROS的表达，结果显示(如图16A所示):GK大鼠对照组肾脏内ROS表达明显高于Wistar大鼠；GK大鼠用药组与GK大鼠对照组比较，NaHS不同浓度(30、60和120 μ mol/L)均能明显减少肾脏内ROS的表达，并成一定的浓度依赖性(如图16C4所示)；
[0070]慢性给予NaHS不同浓度(30、60和120 μ mol/L) 10周后，肾脏切片，用PAS染色，结果显示，GK大鼠对照组与Wistar大鼠相比肾小球的系膜基质重度增生，形成结节状硬化，呈同心圆状排列，即 Kimmelstiel-Wilson 结节(Kimmelstie 1-ffilson nodule),给予 NaHS不同浓度(30、60和120 μ mol/L) 10周后(如图16B和D所示)，增生的肾小球数量与GK对照组比较明显减少，表明慢性给予NaHS可减少GK大鼠肾脏中发生新月体病变的肾小球数量，硫化氢及其供体 硫氢化钠对糖尿病引起的肾脏损伤有保护作用。
【权利要求】
1.硫化氢及其供体硫氢化钠在制备治疗糖尿病药物中的用途。
2.按权利要求1所述的用途，其中所述的糖尿病是II型糖尿病。
3.按权利要求1或2所述的用途，其中硫化氢及其供体硫氢化钠用于II型糖尿病降血糖和增闻膜岛素水平。
4.硫化氢及其供体硫氢化钠在制备胰岛素增敏剂中的用途。
5.硫化氢及其供体硫氢化钠在制备防治糖尿病引起的肾脏损伤药物中的用途。
6.按权利要求5所述的用途，其中所述的糖尿病引起的肾脏损伤是II型糖尿病引起的肾脏并发症。
7.按权利要求5所述的用途，其中硫化氢及其供体硫氢化钠用于减少肾脏的氧化应 激。
【文档编号】A61P5/50GK103622992SQ201210307009
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月26日 优先权日:2012年8月26日
【发明者】朱依纯, 薛蓉, 郝丹丹, 孙计萍, 李文文, 赵曼曼, 李杏辉, 陈莹 申请人:复旦大学