专利名称：一种具有减少泡沫细胞脂质积累的杏鲍菇多糖及其制备方法
技术领域：
本发明涉及杏鲍菇多糖的分离纯化，具体是ー种具有減少泡沫细胞脂质积累的杏鲍菇多糖的制备方法。
背景技术：
近年来，随着经济的发展和生活质量的提高，不合理的饮食习惯而带来的疾病例如肥胖症、高血脂、动脉粥样硬化等呈现逐年上升的趋势，而有大量研究结果表明若能有效地控制血脂水平，则能有效地预防疾病的发生。食用药用菌杏鲍菇具有很高的营养价值，其多糖等活性组分因其出色的保健和治疗功能越来越受到人们的重视，但是目前绝大多数的研究限于多糖提取エ艺的优化，大量地徘徊在低水平的重复研究上，对其和活性成分的分离和代谢调控机制的研究还相对较少，因此很难有创新性的突破。通过体外生化试验研究·证明了杏鲍菇水溶性的多糖(PEPE)具有较强的清除自由基的能力，且在四氯化碳诱导的肝损伤小鼠模型上证实了 PEPE通过提高抗氧化物酶的活性从而保护肝；同时在高血脂动物模型研究结果表明其具有降血脂的作用，但是目前在活性多糖的分离纯化及结构鉴定上仍然是难题。本发明发现两种杏鲍菇中具有潜在降血脂的単一的多糖组分，提供了一种有效地制备和鉴定单ー组分的方法。
发明内容
本发明的目的是提供了ー种可以从杏鲍菇水溶性多糖中分离纯化得到具有減少泡沫细胞内脂质积累的単一多糖的方法，本发明制备得到了两种水溶性的，产量较高的，エ艺简单的，具有清除自由基、減少泡沫细胞内脂质积累的两种单一的杏鲍菇多糖，并对这两种单ー组分进行了结构鉴定。在此基础上进行单ー组分的结构检测，得到了多糖的分子量，构型，单糖构成和比例，以及单糖间连接键等相关结构信息。该两种组分经过在细胞学水平上的检测结果表明均具有显著減少泡沫细胞脂质积累的作用，并且具有较好地清除自由基作用
本发明所述的具有減少泡沫细胞脂质积累活性的杏鲍菇多糖的制备方法，其步骤如
下
(O首先进行杏鲍菇活性多糖的分离纯化，将烘干的杏鲍菇子实体菇粉用90°c热水浸提3 h，四倍体积こ醇沉淀得到的粗多糖；
(2)粗多糖经过分子截留量为3.5 kDa的透析膜，去离子水透析过夜，去除小分子量的杂质，干燥沉淀后复溶于去离子水，加入胰蛋白酶去除去蛋白质，加入双氧水去除色素，最后加入四倍体积的无水こ醇沉淀多糖，离心干燥后得到水溶性的杏鲍菇多糖(PEPE)；
(3)将步骤(2)中所获得的PEPE通过DEAE-52阴离子交换柱，采用浓度为O.05M磷酸缓冲液(PBS)洗脱ー个柱床体积，接着用浓度分别为O. 05 M、0，1 M、0，2 M、0，4 M、0，8 MUM的氯化钠溶液逐级进行进行浓度梯度洗脱，流速lml/min，每管收集8 ml，收集第一洗脱峰的洗脱液，命名为PEPE-A ；
(4)将步骤(3)得到的PEPE-A经过凝胶柱S印hadex G-IOO进行进一歩洗脱，洗脱液为O. 05 M氯化钠溶液，流速O. 5 ml/min,每管收集2 ml，分别收集第一和第二洗脱峰的洗脱液得到两种杏鲍菇多糖，命名为PEPE-I和PEPE-2。对PEPE-I和PEPE-2进行单ー组分的结构检测，得到了多糖的分子量，构型，单糖构成和比例，以及单糖间连接键等相关结构信息。PEPE-I平均分子量37. 50 kDa，单糖组成主要为葡萄糖，含有少量的甘露糖和半乳糖，其中PEPE-I中甘露糖葡萄糖半乳糖的比例为I. 42 96. 26 :2. 32，高碘酸氧化实验和核磁结果检测显示，主要为β (I — 3)连接键构型，同时含有α (I —4，1 —6)连接。PEPE-2平均分子量30.00 kDa，单糖组成主要为葡萄糖，含有少量的甘露糖和半乳 糖，PEPE-2中甘露糖葡萄糖半乳糖的比例为I. 18 95. 54 :3. 28，高碘酸氧化实验和核磁结果检测显示，主要为β (I — 3)连接键构型，同时含有α (I —4，I —6)连接。本发明与现有技术相比具有的优点为(I) PEPE-I和ΡΕΡΕ-2两种多糖组分单一，得率较高，制备简单，且溶于水；(2)ΡΕΡΕ-1和PEPE-2两种单一多糖组分具有显著地抗氧化和减少泡沫细胞内脂质积累的作用；(3)该方法制备的PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分安全无毒，可以作为食品添加剂使用。
图I为PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分的分离纯化图和高效液相图谱。图2为PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分的气相色谱图。图3为PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分的红外光谱。图4为PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分的核磁共振谱。图5为在oxLDL诱导的泡沫细胞模型上检测PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分的減少脂质积累的效果及其量化数据图。图6为PEPE-I和PEPE-2清除DPPH自由基結果。
具体实施例方式下面结合数据和图对本发明做进ー步描述。实施例一、多糖的制备
(O首先进行杏鲍菇活性多糖的分离纯化，将烘干的杏鲍菇子实体菇粉用90°c热水浸提3 h，四倍体积こ醇沉淀得到的粗多糖PE ；
(2)粗多糖PE经过分子截留量为3.5 kDa的透析膜，去离子水透析过夜，去除小分子量的杂质，干燥沉淀后复溶于去离子水，加入胰蛋白酶去除去蛋白质，加入双氧水去除色素，最后加入四倍体积的无水こ醇沉淀多糖，离心干燥后得到水溶性的杏鲍菇多糖(PEPE)；
(3)对PEPE进行DEAE-52阴离子交换柱分离纯化，采用浓度为O.05 M磷酸缓冲液(I3BS)洗脱ー个柱床体积，接着用浓度分别为O. 05 Μ、0· I Μ、0·2 Μ、0· 4 Μ、0· 8 M、1 M的氯化钠溶液逐级进行进行浓度梯度洗脱，流速I mL/min，每管收集8 ml，苯酚-硫酸法跟踪检测每管多糖含量，合并洗脱峰的各管溶液，旋转蒸发仪蒸干浓缩干燥后得到两种主要组分，分别按出峰时间先后顺序命名为PEPE-A和PEPE-B，如图I中A图所示。在oxLDL诱导的泡沫细胞RAW264. 7的检测结果表明PEPE-A能有效地减少泡沫细胞内的脂质积累，而PEPE-B不具有相关减少泡沫细胞脂质积累作用；
(4)对PEPE-A经过凝胶柱S印hadex G-IOO进行进一步的洗脱，洗脱液为O. 05 M氯化钠溶液，流速O. 5 mL/min,每管收集2 ml,苯酚硫酸法跟踪检测每管多糖含量，合并洗脱峰的各管溶液，得到两种主要组分，按苯酚硫酸法跟踪监测得到的出峰先后顺序分别命名为PEPE-I和PEPE-2 ;如图I中B图所示，对得到的两种单一多糖组分PEPE-I和PEPE-2进行高效液相检测，结果表明均为单ー对称峰，可以证明PEPE-I和PEPE-2均为单ー纯品，如图I中C图所示；根据标准分子量葡萄糖在在色谱柱Aminex HPX-87H对应的保留时间制作的标准曲线，计算出两种多糖PEPE-I和PEPE-2的平均分子量分别为37. 50 kDa和30. 00 kDa
O实施例ニ 对PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分进行衍生化后进行气相色谱检测，对于PEPE-I和PEPE-2的单糖组成分析采用完全酸水解的方法(TFA水解)后气相色谱 分析的方法。在110°C下用2 mol/L的TFA 4 mL水解样品4 h，水解后的样品溶液减压蒸干后再向样品中加入O. 5 mL左右的甲醇使样品完全溶解，反复减压低温(30°C)蒸干三次得到完全水解的的单糖组分。将得到的样品酸水解产物及标准单糖进行こ酰化后进行气相检测，最后根据标准单糖的保留时间及峰面积从而估算出样品的单糖组成及比例，得到结果如表I所示。表I样品单糖组成气相分析结果
标准品Iレ鼠李糖|D-阿拉伯糖|D-木糖|D-甘露糖|D-葡萄糖|D-半乳糖|D-岩藻糖
滞留时间5.794 6.1396.27 8.588 8. 707 9.039 11.863
PEPE-1 滞留时间一一一 8.59 8. 708 9.018 —
PEPE-2 滞留时间 I—J-I— ]8.601 [8. 723 19.042 [―
表2样品中单糖含量
Wuj甘露糖(%)j葡萄糖(%)j半乳糖(%)—
PEPE-1I. 4296. 262. 32
PEPE-2]l.18]95. 54]3· 28
表2为气相色谱中检测得到样品的组成情况和含量比，同一组分在同一位置出峰表I为其中混合单糖衍生化后经过气相检测得到的出峰时间，其中各组分分别为(I)L-rhamnose, (2) D-araoinose, (3) D-xylose,⑷ D-mannose, (5) D-glucose, (6)D-galactose, (7) D-fucose ;出峰时间如表格所示。对PEPE-1和PEPE-2通过同样的方法进行衍生化并记录出峰时间，与标准单糖出峰时间对比得到单糖组成，并通过峰面积法计算得出PEPE-I和PEPE-2的各单ー组成成分的含量比，如表2所示。由气相色谱结果可以看出两种多糖的单糖组成主要为葡萄糖，含有少量的甘露糖和半乳糖，其中PEPE-I中甘露糖葡萄糖半乳糖的比例为I. 42 96. 26 :2. 32 ;PEPE_2中甘露糖葡萄糖半乳糖的比例为 I. 18 95. 54 3. 28。实施例三对PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分的傅里叶红外光谱检测，显示结果如图3所示，PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分的红外图谱显示，该组高聚物无衍生基团的存在其为多羟基化合物，且多糖是吡喃糖构型。高碘酸可以选择性地氧化和断裂糖分子中连ニ羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量地进行，每开裂ー个C-C键消耗一分子高碘酸。以I — 2位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放；以I — 4位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放；以I — 3位键和的糖基不被高碘酸氧化；以I — 6位键和的糖基或非还原末端基(I —)经高碘酸氧化，消耗二分子高碘酸，同时释放一分子甲酸。称取多糖样品25 mg，用少量水溶解，加入30 mmol/L高碘酸钠溶液，定容至25 ml,置于暗处，室温下进行反应，于0,6,12, 24, 36,48…小时间隔取样O. I ml,蒸懼水稀释250倍后，使用紫外分光光度计在223 nm处测定光密度。至光密度值达ー稳定值时，加こニ醇破坏过量的高碘酸以終止反应。由此光密度值根据标准曲线计算出高碘酸的消耗量。取2ml上述反应溶液，加一滴溴甲酚蓝作指示剂，用O. 01 mol/L氢氧化钠溶液滴定甲酸的释放量。PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分通过高碘酸氧化检测平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，溴甲酚蓝作指示剂，用O. 01 mol/L氢氧化钠溶液滴定甲酸的释放量，经检测无甲酸释放，证明PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分可能含有I — 4和I — 2位键合的糖基，有部分糖不被高碘酸氧化，对高碘酸氧化后产物进行高效液相色谱法检测含有葡萄糖，说明含有I — 3连接键，也可能含有I — 4，I — 6连接。实施例四JiPEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分的核磁共振谱多糖的核磁共振谱见图6。在IH-NMR中有两个信号，表明多糖结构中存在α构象(δ 5.1-5. 3 ppm)和β 构象(δ 4. 1-4. 8 ppm) ;13C_NMR 核磁谱中高场 98. 91 ppm (97-101 ppm)表证了 Cl 的 α构象，而低场 103. 64 ；103. 77 ；104. 04 ；104. 33 ；104. 79 ；105. 11 ；105. 32 (103-105 ppm)表证的为Cl的β构象。实施例五图5为在oxLDL诱导的泡沫细胞模型上检测PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分的减少脂质积累的效果。通过oxLDL诱导巨噬细胞RAW264. 7形成的泡沫细胞模型，检测分离纯化得到的PEPE-I和PEPE-2两种单一多糖组分的減少脂质积累的效果，并通过油红ο染脂滴和对脂质含量的定量结果表明在杏鲍菇子实体中分离纯化的到的两种単一多糖组分具有显著地減少脂质积累的效果。体外的生化试验结果如图6所示，PEPE-I和PEPE-2具有较强的清除DPPH自由基的能力，对DPPH自由基清除率分别达到84. 6%和83. 07%,结果表明从杏鲍菇子实体多糖中分离纯化得到的两种单ー组分PEPE-I和PEPE-2具有很强的抗氧化性。
权利要求
1.ー种具有减少泡沫细胞脂质积累的杏鲍菇多糖，是平均分子量为37. 50 kDa的杏鲍菇多糖PEPE-I，或者是平均分子量为30. 00 kDa杏鲍菇多糖PEPE-2 ;单糖组成主要为葡萄糖，含有少量的甘露糖和半乳糖；所述杏鲍菇多糖PEPE-I、PEPE-2是通过下述方法制得(1)将杏鲍菇干粉热水浸提后，加入四倍体积的无水こ醇于4°C下静置过夜，离心沉淀并干燥得到粗多糖；(2)将粗多糖复溶于去离子水，加入胰蛋白酶去除去蛋白质，加入双氧水去除色素，最后加入四倍体积的无水こ醇沉淀多糖，离心干燥后得到水溶性的杏鲍菇多糖；(3)将步骤(2)中所获得的PEPE通过DEAE-52阴离子交换柱，采用浓度为O.05 M磷酸缓冲液洗脱ー个柱床体积，接着用浓度分别为O. 05 M、0. I M、0. 2 M、0. 4 M、0. 8 M、1 M的氯化钠溶液逐级进行浓度梯度洗脱，流速I ml/min，每管收集8 ml，收集第一洗脱峰的洗脱液，命名为PEPE-A ；(4)将步骤(3)得到的PEPE-A经过凝胶柱S印hadexG-100进行进一歩洗脱，洗脱液为O.05 M氯化钠溶液，流速O. 5 ml/min,每管收集2 ml,分别收集第一和第二洗脱峰的洗脱液得到杏鲍菇多糖PEPE-I和PEPE-2。
2.ー种制备权利要求I所述杏鲍菇多糖的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将杏鲍菇干粉热水浸提后，加入四倍体积的无水こ醇于4°C下静置过夜，离心沉淀并干燥得到粗多糖；(2)将粗多糖复溶于去离子水，加入胰蛋白酶去除去蛋白质，加入双氧水去除色素，最后加入四倍体积的无水こ醇沉淀多糖，离心干燥后得到水溶性的杏鲍菇多糖；(3)将步骤(2)中所获得的PEPE通过DEAE-52阴离子交换柱，采用浓度为O.05 M磷酸缓冲液洗脱ー个柱床体积，接着用浓度分别为O. 05 M、0. I M、0. 2 M、0. 4 M、0. 8 M、1 M的氯化钠溶液逐级进行进行浓度梯度洗脱，流速I ml/min，每管收集8 ml，收集第一洗脱峰的洗脱液，命名为PEPE-A ；(4)将步骤(3)得到的PEPE-A经过凝胶柱S印hadexG-100进行进一歩洗脱，洗脱液为O.05 M氯化钠溶液，流速O. 5 ml/min,每管收集2 ml，分别收集第一和第二洗脱峰的洗脱液得到杏鲍菇多糖PEPE-I和PEPE-2。
全文摘要
本发明公开了一种具有减少泡沫细胞脂质积累的杏鲍菇多糖及其制备方法。所述杏鲍菇多糖是平均分子量为37.50kDa的杏鲍菇多糖PEPE-1，或者是平均分子量为30.00kDa杏鲍菇多糖PEPE-2；单糖组成主要为葡萄糖，含有少量的甘露糖和半乳糖；它们是通过将杏鲍菇子实体干粉经热水浸提、透析后，进一步通过阴离子交换柱DEAE-52同时采用盐浓度梯度洗脱分离纯化得到PEPE-A；采用SephadexG-100对PEPE-A进行进一步分离纯化，得到组分PEPE-1和PEPE-2。PEPE-1和PEPE-2均为单一峰，具有很好的预防泡沫细胞脂质积累作用、抗氧化作用；可以作为食品添加剂使用。
文档编号A61P39/06GK102827305SQ20121034815
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者陆玲, 雍阳阳, 陈晶晶, 邢美春 申请人:南京师范大学