治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法

专利名称：治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法
技术领域：
本发明涉及中药领域，具体而言，本发明涉及治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法，具体涉及一种寥科植物及其提取物用于治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法，特别涉及中草药头花寥或其提取物用于治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法。
背景技术：
头花寥(Polygonumcapitatum Buch. -Ham. ex D. Don)是一种寥科寥属植物，为多年生草本，别名四季红、石莽草、石辣寥、水绣球、红花地丁、满地红等。在中国贵州、云南、广西、四川、西藏、湖北、湖南和江西等地区均有分布，主要生长在山坡、山谷及富含煤层的沙页岩地带。全草具有清热解毒、散瘀、利尿通淋之功效。据1963年《广西中药志》第二册记载，头花寥主要用于治疗风湿痛；1977年《中药大辞典》上册记载，头花寥主要用于治疗痢疾、肾炎、膀胱炎和尿路结石等。民间一般将头花寥用水煎服，治疗效果比较明显，但是服用不方便。中国专利申请公开说明书CN1054899A (中国专利申请号90107810. 7，
公开日1991 年10月2日)中公开了一种泌感灵冲剂、糖浆生产工艺。该生产工艺是以四季草为原料用水煎煮30-60分钟，提取液过滤浓缩，，将其上清液减压浓缩成膏，再用60-70%乙醇提取，将乙醇提取液真空干燥，得四季红浸膏，进一步配制成冲剂或糖浆剂，据信该具有解毒、散瘀、利尿、通淋的功效。中华人民共和国卫生部药典委员会1998年编的中华人民共和国卫生部《药品标准一中药成方制剂》(第十七册)中收载了名为“热淋清颗粒”的中成药制剂，其是通过将头花寥加水煎煮两次后过滤浓缩制成的。CN 1481832A(中国专利申请号02129686. 3，
公开日2004年3月17日)和CN1483466A(中国专利申请号03146381. 9，
公开日2004年3月24日)公开了头花寥提取物，其基本上是由以下步骤制备的a.由头花寥全草的鲜品或干品用水分两次煎煮或者用醇水混合物分二至三次回流提取，每次1-2小时，合并煎煮液，过滤浓缩至20° C时的相对密度为I. 2，喷雾干燥或减压干燥得到；或者，b.由头花寥全草及其水提药渣经二氧化碳超临界萃取得到。据信此提取物可用于抗菌、抗炎、镇痛、利尿、治疗泌尿系统结石、治疗肾盂肾炎以及前列腺炎。幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,在本文中可简称为Hp或HP)是普遍存在于人胃黏膜中的一种微需氧的革兰氏阴性菌。幽门螺旋杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，长2. 5 4. O μ m，宽0. 5 L O μ m，在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形，在固体培养基上生长时，除典型的形态外，有时可出现杆状或圆球状。幽门螺旋杆菌在全球自然人群的感染率超过50%，世界上几乎没有一种慢性传染病会使全球超过半数的人口受到感染，且发展中国家高于发达国家。我国属发展中国家，幽门螺旋杆菌感染率高。由中华医学会消化病分会幽门螺旋杆菌学组所作的一个涉及全国20个省市、40个中心的自然人群的幽门螺旋杆菌感染流行病学调查显示我国幽门螺旋杆菌感染率为40-90%，平均为59%;现症感染率为42-64%，平均55%。据信Hp感染与多种上胃肠道疾病如消化性溃疡、胃炎、胃粘膜相关性淋巴瘤(MALT)及胃癌等的主要致病因素。已知例如下列疾病或病症直接或间接地与Hp感染有关胃粘膜相关性淋巴瘤、消化性溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急慢性胃炎、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌、心血管疾病、冠心病、动脉硬化、脑梗塞、高血压、贫血、缺铁性贫血、消化性溃疡复发、胃黏膜萎缩、肠上皮化生、以及血小板减少性紫癒(百度百科http://baike. baidu. com/view/36784, htm, 2011-09-15),还可以包括伴随这些疾病或病症的并发症，抑制幽门螺旋杆菌有利于降低消化性溃疡的复发率、阻断或延缓胃黏膜萎缩和肠上皮化生的进一步发展。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺旋杆菌定为I类致癌原。Hp抗感染治疗主要是以抗生素为基础的三联或四联疗法，但随着多种抗生素联合广泛用于抗Hp治疗，Hp对抗生素的耐药问题日益严重，已成为根除治疗失败的主要原因。本领域期待有用于幽门螺旋杆菌相关疾病的新治疗方法
发明内容

本发明的目的在于为临床上提供一种治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的方法。本发明人令人惊奇地发现，头花寥或其提取物在抑制幽门螺旋杆菌以及治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症具有令人期待的效果。本发明基于此而得以完成。为此，本发明第一方面提供了头花寥或其提取物在制备用于治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的药物中的用途。根据本发明第一方面的用途，其中所述的头花寥是头花寥的鲜品或干品。根据本发明第一方面的用途，其中所述的头花寥是选自头花寥的全草、地上部分、叶、花、茎、种子或其组合。根据本发明第一方面的用途，其中所述的头花寥是选自头花寥的地上部分。根据本发明第一方面的用途，其中所述的头花寥是选自头花寥的叶、花、茎、种子或其组合。根据本发明第一方面的用途，其中所述提取物是头花寥用水、乙醇、乙醇水溶液或其组合作为溶剂，经提取获得的提取物；或者是头花寥经二氧化碳超临界提取方法获得的提取物。根据本发明第一方面的用途，其中所述提取物是头花寥的乙醇水溶液的提取物。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是3(Γ99%乙醇水溶液。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是5(Γ98%乙醇水溶液。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是6(Γ98%乙醇水溶液。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是7(Γ95%乙醇水溶液。根据本发明第一方面的用途，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物由头花寥药材用水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取，浓缩提取液，干燥。根据本发明第一方面的用途，其中所述提取物是用二氧化碳超临界萃取头花寥得到的。在一个实施方案中，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物用二氧化碳超临界萃取头花寥药材，和/或用二氧化碳超临界萃取头花寥药材经水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取得到的药渣。根据本发明第一方面的用途，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物取头花寥药材，加5 20倍(例如5 15倍，例如8 12倍)的水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取I飞次(例如2 3次)，每次O. 5飞小时(例如O. 5^3小时，例如f 3小时)，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为I. Γ ·5(25° C)(例如I. 2 I. 4)的稠
膏，干燥，即得。根据本发明第一方面的用途，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物取头花寥药材，加5 20倍(例如5 15倍，例如8 12倍)的水，在8(Tl00° C左右煎煮提取O. 5飞小时(例如0.5 3小时，例如广3小时)；过滤，滤液减压浓缩成膏状；用2-5倍量5(Γ90%的乙醇回流提取2-3次，将乙醇提取液于70-90° C除乙醇，真空干燥，即得。根据本发明第一方面的用途，其中所述与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症包括但不限于，胃粘膜相关性淋巴瘤、消化性溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急慢性胃炎、浅表 性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌、心血管疾病、冠心病、动脉硬化、脑梗塞、高血压、贫血、缺铁性贫血、消化性溃疡复发、胃黏膜萎缩、肠上皮化生、以及血小板减少性紫癜，以及它们的并发症。已知与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症可采用联合用药治疗方案，例如三联或四联药物治疗方案，例如，阿莫西林+克拉霉素+甲硝唑的联合治疗方案，或者质子泵抑制剂(奥美拉唑、兰索拉唑和/或泮托拉唑)+阿莫西林+克拉霉素的联合治疗方案，或者奥美拉唑+克拉霉素+阿莫西林+雷尼替丁的联合治疗方案，或者在它们的基础上辅以胃粘膜保护剂例如但不限于硫糖铝、思密达等的联合治疗方案。而本发明发现头花寥提取物具有优良的抑菌活性，特别是令人惊奇的是发现头花寥提取物对某些耐阿莫西林、克拉霉素和/或甲硝唑的病原体亦是有效的，因此可以预期，本发明头花寥提取物可以与这些抗病原体的药物组合使用或者替代它们使用。因此，根据本发明第一方面的用途，其中所述的药物中还包含一种或多种其它的药物，该其它的药物选自抗微生物药、质子泵抑制剂、胃粘膜保护剂等。所述的抗微生物药例如但不限于青霉素类例如阿莫西林，大环内酯类例如克拉霉素，硝咪唑类例如甲硝唑。所述的质子泵抑制剂例如但不限于奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑。所述的胃粘膜保护剂例如但不限于硫糖铝、思密达等。本领域技术人员根据已有知识知晓如何对本发明所述头花寥或其提取物与所述其它的药物进行组合。本发明第二方面提供了用于治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的药物组合物，其中包含头花寥或其提取物，以及任选的药学可接受的载体或赋形剂。根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述的头花寥是头花寥的鲜品或干品。根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述的头花寥是选自头花寥的全草、地上部分、叶、花、茎、种子或其组合。根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述的头花寥是选自头花寥的地上部分。根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述的头花寥是选自头花寥的叶、花、茎、种子或其组合。根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述提取物是头花寥用水、乙醇、乙醇水溶液或其组合作为溶剂，经提取获得的提取物；或者是头花寥经二氧化碳超临界提取方法获得的提取物。
根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述提取物是头花寥的乙醇水溶液的提取物。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是3(Γ99%乙醇水溶液。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是5(Γ98%乙醇水溶液。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是6(Γ98%乙醇水溶液。在一个实施方案中，所述乙醇水溶液是7(Γ95%乙醇水溶液。根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物由头花寥药材用水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取，浓缩提取液，干燥。根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述提取物是用二氧化碳超临界萃取头花寥得到的。在一个实施方案中，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物用二氧化碳超临界萃取头花寥药材，和/或用二氧化碳超临界萃取头花寥药材经水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取得到的药渣。根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物取头花寥药材，加5 20倍(例如5 15倍，例如8 12倍)的水、乙醇、或乙醇 水溶液煎煮和/或回流提取f 5次(例如2 3次)，每次O. 5飞小时(例如O. 5^3小时，例如f 3小时)，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为I. Γ ·5(25° C)(例如I. 2 I. 4)的稠膏，干燥，即得。根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物取头花寥药材，加5 20倍(例如5 15倍，例如8 12倍)的水，在8(Tl00° C左右煎煮提取O. 5飞小时(例如O. 5^3小时，例如f 3小时)；过滤，滤液减压浓缩成膏状；用2-5倍量5(Γ90%的乙醇回流提取2-3次，将乙醇提取液于70-90° C除乙醇，真空干燥，即得。根据本发明第二方面的药物组合物，其中所述与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症包括但不限于，胃粘膜相关性淋巴瘤、消化性溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急慢性胃炎、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌、心血管疾病、冠心病、动脉硬化、脑梗塞、高血压、贫血、缺铁性贫血、消化性溃疡复发、胃黏膜萎缩、肠上皮化生、以及血小板减少性紫癜，以及它们的并发症。根据本发明第二方面的药物组合物，其中还包含一种或多种选自下列的药物抗微生物药、质子泵抑制剂、胃粘膜保护剂等。所述的抗微生物药例如但不限于青霉素类例如阿莫西林，大环内酯类例如克拉霉素，硝咪唑类例如甲硝唑。所述的质子泵抑制剂例如但不限于奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑。所述的胃粘膜保护剂例如但不限于硫糖铝、思密达
坐寸ο根据本发明第二方面的药物组合物，其呈口服或注射给药的制剂形式。在一个实施方案中，所述药物组合物呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液剂、注射剂(水针和/或粉针)等的形式。本发明第三方面提供了治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的方法，该方法包括给有需要的哺乳动物施用有效量的头花寥或其提取物。根据本发明第三方面的方法，其中所述与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症包括但不限于，胃粘膜相关性淋巴瘤、消化性溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急慢性胃炎、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌、心血管疾病、冠心病、动脉硬化、脑梗塞、高血压、贫血、缺铁性贫血、消化性溃疡复发、胃黏膜萎缩、肠上皮化生、以及血小板减少性紫癜，以及它们的并发症。根据本发明第三方面的方法，其中还在施用所述头花寥或其提取物之前、同时或之后施用一种或多种选自下列的药物抗微生物药、质子泵抑制剂、胃粘膜保护剂等。所述的抗微生物药例如但不限于青霉素类例如阿莫西林，大环内酯类例如克拉霉素，硝咪唑类例如甲硝唑。所述的质子泵抑制剂例如但不限于奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑。所述的胃粘膜保护剂例如但不限于硫糖铝、思密达等。根据本发明第三方面的方法，其中所述的哺乳动物是在身体的任何部位(特别是消化道内，更特别的是胃和十二指肠内)感染幽门螺旋杆菌或者有被幽门螺旋杆菌感染的倾向或可能的任何哺乳动物，包括人类，以及驯养动物(例如但不限于猪、牛、羊、马等)，试验动物(例如但不限于狗、猫、大鼠、小鼠、兔、猴等)，伴侣动物(例如但不限于宠物狗、宠物猫等)，野生动物(例如但不限于虎、猿、猴、熊猫等);观赏动物(例如动物园饲养的哺乳动物)。 本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。在本发明中，除非所述及的语境明确含有另外的含义，否则提到的头花寥是指寥科寥属植物头花寥(Polygonum capitatum Buch. -Ham. ex D. D on),包括其鲜品或干品，包括其全草、地上部分、叶、花、茎、种子或其组合。在本发明中，短语“与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症”可以表示任何疾病，其成因直接或间接与幽门螺旋杆菌感染有关。另外，特别地，“与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症”多数情况下直接表现为胃病，例如胃炎、胃溃疡等，因此，本发明使用本发明所涉及的中药或其提取物治疗或预防的疾病，包括任何成因直接或间接与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或疾病；并且，只要受试个体体内因成因直接或间接与幽门螺旋杆菌感染而造成的身体疾病或病症，使用本发明所涉及的中药或其提取物治疗或预防可显示出临床效果，则均落入本发明的保护范围。例如某个体例如患者，身体出现任何(某种/某些)胃部不适症状，并且经检测其胃中感染有幽门螺旋杆菌，则使用本发明所涉及的中药或其提取物治疗或预防可显示出临床效果，并且这种治疗或预防所涉及的治疗用途和药物组合物以及治疗方法，均落入本发明的保护范围。在本发明中，术语“提取”可以是常温下的浸溃，或者是在升高的温度下的提取(例如煎煮和/或回流)，或者这些操作方式的结合。还可以进一步包括对提取物进行进一步处理，例如进一步进行纯化，例如除溶剂、沉淀除杂质、溶剂萃取、树脂吸附分离等。如本文所述的，术语“提取物”将包括可用于实现本发明目的的任何纯度的提取物，本领域技术人员根据本发明精神可以理解本发明提取物的提取纯度可以在较大的范围内变化。例如本发明头花寥提取获得的提取物，根据不同的工艺条件的差异，Ikg头花寥经提取可得到IOg至500g之间任一量(例如IOg至200g,例如IOg至150g,例如IOg至IOOg)亦即不同纯度的提取物，本领域技术人员可根据不同需要，使用不同纯度的提取物来调配适合需要的组合物。在本发明的一些实施方案中，所述的提取物可以称为浸膏粉。在本发明中，可以使用有效量的本发明组合物施用于有需要的受试个体。如本文所述的，术语“有效量”是指可在受试者中实现预防和/或治疗本发明所述状况、障碍、病症或疾病的目的剂量。本领域技术人员根据本发明上下文，可以容易地确定本发明组合物的使用剂量。特别地，本据本发明，术语“有效量”可以理解为本发明组合物以适用于任何医学治疗和/或预防的合理效果/风险比治疗和/或预防所述状况、障碍、病症或疾病的足够量。但应认识到，本发明组合物的总日用量可以由本领域技术人员在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的受试者，具体的预防有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体组合物；与本发明组合物组合使用或同时使用的其它治疗活性物质；及医疗领域公知的类似因素。
本发明提供包含与一种或多种无毒生理学可接受的载体配制在一起的组合物。所述组合物可特别专门配制成以固体或液体形式供口服施用或供直肠施用，或者配制成供注射施用。供口服施用的固体剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性的生理学可接受赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合a)填充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸山)粘合剂如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保湿剂如甘油；d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂如石蜡；f)吸收加速剂如季铵化合物；g)湿润剂如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸附剂如高岭土和膨润土以及i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型中也可包含缓冲剂。供口服施用的液体剂型包括生理学可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏齐U。液体剂型除含有活性组分外还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。自从1983年Marshall等人分离出Hp以来，国内外许多学者对Hp进行了大量的研究，发现根除Hp的感染可治疗慢性胃炎，降低消化性溃疡的复发率、阻断或延缓胃黏膜萎缩和肠上皮化生的进一步发展。抑杀Hp成为消化科医生治疗Hp相关病的基本原则。多年来发展了多种针对Hp的治疗方案，目前标准方案是PPI加两种抗生素的三联疗法。但是用抗生素治疗Hp感染的同时，体内正常菌群也被杀灭或抑制，导致胃肠道、口咽部、阴道和皮肤各部位的菌群失调，引发二重感染。常规三联疗法对其根除率逐渐下降。因此寻找合适的药物替代三联疗法显得尤为重要。头花寥是少数民族地区的常用中药，2000年进入国家基本药物目录。是贵州省中药现代化2010年前重点发展的“六大苗药”和贵州“十五”期间重点培育发展的“七大中药产业链”中的品种之一。目前从头花寥全草中分离出的有机化合物共六十多个，主要有黄酮类、醛、酮、醇类及萜类化合物，主要有效成分是没食子酸和黄酮类。目前主要用于清热解毒、利尿通淋、肾盂肾炎、尿路结石、膀胱炎、痢疾、风湿痛、跌打损伤、尿道感染、疮疡湿疹等症状。尽管人们已经知晓，头花寥的水提物在体内外均有一定的抗菌活力，尤其是对淋球菌有较强的抗菌活力，(最小抑菌浓度范围为8-32g/L，平均值为11. 2g/L)。其次对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌和肺炎克雷伯菌也有较强的抗菌活力。对部分真菌及厌氧菌中的脆弱杆菌、消化球菌、消化链球菌和痤疮丙酸杆菌、颗粒丙酸杆菌等均具有一定的抗菌作用。然而本发明人令人意外地发现，头花寥对于幽门螺旋杆菌这种顽固性病原微生物及其所引起的相关病症是有效的。本发明采用琼脂稀释法进行抗菌活性实验。为了实验结果稳定可靠，本实验设立 严格的实验对照、重复和平行实验，即每个样品均连续进行三次相同实验，每次实验均对每个浓度至少接种两个平板。结果显示，三次结果一致，阴性对照(即不加菌)无生长、生长对照(即不加药)生长良好、溶剂对照(仅加溶剂不加样品))未见生长抑制现象。我们通过头花寥提取物的体外抑菌实验发现，其对两株幽门螺旋杆菌ATCC700392和ATCC700824抑菌效果明显(MIC为4mg/mL)。头花寥提取物对临床分离菌株Hp B-I型(对阿莫西林耐药)、Hp B-2型(对克拉霉素耐药)、Hp B-3型(对甲硝唑耐药)、Hp B_4型(对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均耐药的菌株)、Hp B-5型(对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均敏感的菌株)各3株临床株的抗菌活性实验中，为了实验结果稳定可靠，本实验设立严格的实验对照、重复和平行实验，每个样品均连续进行三次相同实验，每次实验均对每个浓度至少接种两个平板。结果显示，三次结果一致，阴性对照(即不加菌)无生长、生长对照(即不加药)生长良好、溶剂对照(即仅加溶剂)未见生长抑制现象、菌株对照(即同时做Hp国际标准测序株ATCC700392)与前期试验结果一致。本发明的结果表明，头花寥提取物对幽门螺旋杆菌国际标准测序株ATCC700392和ATCC700824两株菌都具有较强的体外抑制Hp效果。此外，头花寥提取物对临床分离菌株Hp B-I型(对阿莫西林耐药)、Hp B-2型(对克拉霉素耐药)、Hp B-3型(对甲硝唑耐药)、HpB-4型(对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均耐药的菌株)、Hp B-5型(对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均敏感的菌株)的实验中具有较强的体外抑制Hp效果。本发明通过对头花寥提取物体外抗菌活性实验，令人惊奇地发现其具有抗幽门螺旋杆菌的活性。例如在一个实施方案中，将头花寥提取物分别对两株幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，简称 H. pylori,或 Hp) ATCC700392 和 ATCC700824 进行体外抑菌实验，在阴性对照(即不加菌)无生长、生长对照(即不加药)生长良好、溶剂对照(即仅加溶剂)未见生长抑制现象的条件下，以完全无菌生长的样品最高稀释度为该菌株对相应样品的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。在另一实施方案中，将头花寥提取物分别对这五种类型各3株临床分离株进行体外抑菌实验，在阴性对照(即不加菌)无生长、生长对照(即不加药)生长良好、溶剂对照(即仅加溶剂)未见生长抑制现象、样品对照(即同时做第一阶段H-2-65样品)与第一阶段实验结果一致、菌株对照(即同时做Hp国际标准测序株ATCC700392)与前期试验结果一致条件下，以完全无菌生长的样品最高稀释度为该菌株对相应样品的最低抑菌浓度。本发明人发现(I)头花寥提取物作用于Hp ATCC700392和ATCC700824时抑菌效果明显(MIC为彡4mg/mL)。(2)头花寥提取物对Hp B-I型(对阿莫西林耐药)临床分离3株菌的抑菌效果明显(MIC为4μ g/mL);对Hp B-2型(对克拉霉素耐药)临床分离3株菌的抑菌效果明显(MIC为4μ g/mL) ；Hp B-3型(对甲硝唑耐药)临床分离3株菌的抑菌效果明显(MIC为彡2 μ g/mL) ；Hp B_4型(对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均耐药的菌株)临床分离3株菌的抑菌效果明显(MIC为<8yg/mL),Hp B-5型(对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均敏感的菌株)临床分离3株菌的抑菌效果明显(MIC为彡4 μ g/mL) ; (3) DH-2-65、DH-2_24对Hp临床分离株的抑菌效果明显(MIC为<4 μ g/mL)。由此，头花寥提取物对两株幽门螺旋杆菌国际标准测序株ATCC700392和ATCC700824两株菌都具有较强的体外抑菌效果；头花寥提取物对临床分离菌株的实验中具有较强的体外抑制Hp效果，从而有望成为一种全新的抗菌药物特别是可以用于治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症。



图I显示了头花寥提取物对幽门螺旋杆菌体外抑菌的结果。图2显示了头花寥提取物处理幽门螺旋杆菌后细菌显微形态的电镜图。
具体实施例方式下面通过具体的实施例/实验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和实验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。A、制备实施例部分实施例I :制备头花蓼地上部分水提取物取头花寥地上部分(干品)220kg，洗净，加入7倍量水，加热煮沸L 5小时，过滤，药渣中加入6倍量水，煮沸I. O小时，过滤。合并滤液，浓缩至相对密度为I. 2(20°C )得到浸膏，喷雾干燥得到浸膏粉23. Ikg (收率10. 4%)，为本实施例的头花寥提取物棕色粉末；每g样品相当于原生药8. 7g ;采用分光光度计法测定，黄酮含量18. 21mg/g,没食子酸含量17. 82mg/g。取以上浸膏粉I份，加2份淀粉、2份微晶纤维素，混合均匀，装胶囊，即为本发明的药物组合物。实施例2:制备头花蓼全草水提取物(喷雾干燥)参考实施例I的方法，不同之处是用头花寥全草(鲜品)代替头花寥地上部分进行提取，得本实施例的头花寥提取物。收率8. 12%。实施例3 :制备头花蓼根95%乙醇提取物取头花寥干燥根10kg，洗净，置不锈钢浓缩罐内，加入7. 5倍量的95%乙醇，回流提取I. 5小时，过滤。药渣加入7. 5倍量95%乙醇，回流提取I. O小时，过滤。合并两次滤液，浓缩得浸膏，减压干燥，得到本实施例提取物，O. 34kg。实施例4 :制备头花藜萃75%乙醇提取物参考实施例3相同的方法，不同之处是将头花寥干燥茎用75%乙醇进行提取，得本实施例提取物。收率5. 74%。实施例5 :制各头花蓼叶60%乙醇提取物参考实施例3相同的方法，不同之处是将头花寥干燥叶用60%乙醇进行提取，得本实施例提取物。收率8. 62%。实施例6 :制备头花藜种子30%乙醇提取物参考实施例3相同的方法，不同之处是将头花寥干燥种子用30%乙醇进行提取，得 本实施例提取物。收率13.4%。实施例7 :制备头花藜糖浸物取头花寥地上部分(干品)，粉碎成细粉，与饱和蔗糖溶液混合(I :1，重量)混合(注意防止微生物生长)，放置3个月以上。放置3个月的混合物经挤压使固液分离，并使固形物水份含量低于15%，所得浸取液作为本发明提取物用于本发明的生物学试验例部分。下文试验例中结果显示该浸取液的有效性，表明头花寥药材即可直接(例如直接与糖混合制成蜜丸)用于本发明期望的用途。实施例8 :制备头花蓼全草7%乙醇提取物取头花寥全草10kg，洗净，置不锈钢浓缩罐内，加入7-8倍量80%乙醇，回流提取I. 5小时，过滤。药渣加入5倍量60%乙醇，回流提取I. 5小时，过滤。合并两次滤液，浓缩得浸膏，减压干燥得到提取物O. 74kg。实施例9 :制备头花蓼全草水前醇沉溶液粉取头花寥全草10kg，洗净，加入350kg水，加热煮沸I. 5小时，转移上清液，残渣中加入150kg水，煮沸I. O小时。合并煎煮液，过滤浓缩至相对密度为1.04(24°C )得浸膏16kg。加入95%乙醇调至含醇量为60%，静至24小时，分取溶液。向沉淀加入95%乙醇调至含醇量为60%，静至24小时，分取溶液，合并两次溶液，挥去乙醇，80°C减压干燥得头花寥全草水煎醇沉溶液粉O. 78kg，作为本实施例的提取物。实施例10 :制备头花蓼全草水前醇沉沉淀粉取头花寥全草10kg，洗净，加入350kg水，加热煮沸I. 5小时，转移上清液，残渣中加入150kg水，煮沸I. O小时。合并煎煮液，过滤浓缩至相对密度为1.04(24°C )得浸膏16kg。加入95%乙醇调至含醇量为60%，静至24小时，分取溶液。向沉淀加入95%乙醇调至含醇量为60%，静至24小时，分取溶液，合并两次溶液，挥去乙醇，80°C减压干燥得头花寥全草水煎醇沉溶液粉O. 78kg ;由16kg浸膏以后处理步骤所得沉淀于80°C减压干燥，得头花寥全草水煎醇沉沉淀粉O. 49kg，作为本实施例的提取物。实施例11 :制备头花蓼原药粉二氧化碳超临界萃取提取物取头花寥地上部分原药粉10kg，洗净，投入超临界萃取釜中，对萃取釜和两个解析釜加热，对贮罐进行冷却，当温度达到预定的温度时，打开二氧化碳气瓶送气，当压力达到预定压力时，开始循环萃取，调节流量，并加入夹带剂，恒温恒压萃取2小时。将得到的液体减压浓缩得到浸膏O. 17kg，作为本实施例的提取物。
实施例12 :制备头花藜药渣二氧化碳超临界萃取提取物取头花寥药渣(实施例I所得总药渣与实施例8所得总药渣以重量比I: I的混合物)10kg，投入超临界萃取釜中，对萃取釜和两个解析釜加热，对贮罐进行冷却，当温度达到预定的温度时，打开二氧化碳气瓶送气，当压力达到预定压力时，开始循环萃取，调节流量，并加入夹带剂，恒温恒压萃取2小时。将得到的液体减压浓缩得到浸膏O. 131kg。实施例13 :制备头花藜药渣二氧化碳超临界萃取提取物取头花寥地上部分(干品)30kg，加8倍量的水，在80-100° C间煎煮60分钟，提取液排入沉淀缸，再向煎煮锅内加入药材4倍量的水，在80-100° C间煎煮60分钟，提取液排入沉淀缸并与前次提取液合并，待澄清后取上清液送入真空浓缩锅，在60-80° C下减压浓缩至膏状，然后将此膏状物送入乙醇提取锅内，用3倍量65%乙醇提取2次，再将乙醇提取液送入真空浓缩锅内，在70-90° C下除去乙醇，减压浓缩，干燥，即得本实施例提取物，收率3. 82%。 实施例14 :制备头花藜提取物头花寥地上部分(干品)10kg，加水80升，回流提取2次，每次2h，合并提取液，静置过夜，离心。滤液上大孔吸附树脂AB-8 (IOkg)，先用水洗2个柱体积，弃去洗脱液，再用85%乙醇洗3个柱体积，收集洗脱液，常压干燥，得头花寥提取物。经检测，该提取物含总黄酮为15%，没食子酸为2. 5%。实施例15 :制备头花蓼提取物头花寥地上部分(干品)10kg，加10倍量50%乙醇，回流提取3次，每次I. 5h，合并提取液，减压回收乙醇至乙醇含量低于10%，上大孔吸附树脂NKA-9，先用水洗2个柱体积，弃去洗脱液,再用10%乙醇洗脱2个柱体积，弃去洗脱液，再用80%乙醇洗3个柱体积，收集洗脱液，减压干燥，得头花寥提取物。经检测，该提取物含总黄酮为41%，没食子酸为11%。实施例16 :制备头花蓼提取物头花寥地上部分(干品)10kg，加10倍量95%乙醇，回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇至乙醇含量低于10%，上大孔吸附树脂HPD400，先用水洗2个柱体积，弃去洗脱液，再用90%乙醇洗2个柱体积，收集洗脱液，喷雾干燥，得头花寥提取物。经检测，该提取物含总黄酮为39%，没食子酸为7%。实施例17 :制备头花蓼提取物头花寥地上部分(干品)10kg，加10倍量95%乙醇，回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇至乙醇含量低于10%，上大孔吸附树脂HPD100，先用水洗2个柱体积，弃去洗脱液，再用90%乙醇洗2个柱体积，收集洗脱液，减压干燥，得头花寥提取物。经检测，该提取物含总黄酮为32%，没食子酸为8%。实施例18 :制备头花蓼提取物头花寥地上部分(干品)10kg，加8倍量水，回流提取2次，每次2h，合并提取液，静置过夜，离心。滤液上大孔吸附树脂ADS-17，先用水洗2个柱体积，弃去洗脱液，再用10%乙醇洗脱2个柱体积，弃去洗脱液，再用90%乙醇洗2个柱体积，收集洗脱液，减压干燥，得头花寥提取物。经检测，该提取物含总黄酮为37%，没食子酸为9%。
B、牛物学试骀例部分试验例I :头花藜提取物(实施例I)对幽门螺旋杆菌标准株及临床分离菌株的抗菌活性检测I)实骀菌株标准菌株所用的两株菌株为幽门螺旋杆菌ATCC700392和幽门螺旋杆菌ATCC700824国际标准测序株，购自ATCC(美国菌种保藏中心)，传代次数在10代以内。临床分离菌株为幽门螺旋杆菌临床分离菌株，均是贵阳医学院消化内科将做胃镜检查证实为消化性溃疡和慢性胃炎，同时镜下活检粘膜快速尿素酶测定为阳性的病人，将其活检的胃窦部粘膜分离Hp菌株。Hp菌株的鉴定采用国际公认幽门螺旋杆菌的鉴定方法，分为形态学、尿素酶、氧化酶、过氧化氢试验、血清学试验。临床分离到五种菌株(命名)及其特性分别为
Hp B-I型其对阿莫西林耐药，Hp Β-2型其对克拉霉素耐药，Hp Β-3型其对甲硝唑耐药，Hp Β-4型其对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均耐药的菌株，Hp Β-5型其对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑三种药均敏感的菌株。2)试验使用的一些主要试剂哥伦比亚血琼脂和脑心浸液粉得自英国0X0ID，无菌脱纤维羊血得自北京燕生政博生物科技有限公司，氧化酶试剂、尿素酶试剂、触酶试剂和E-test试条得自生物梅里埃公司，盐酸万古霉素、两性霉素、磺胺(TMP)和多黏菌素B得自美国Sigma公司。3)试验样品本发明一部分实施例所得头花寥提取物。4)主要试剂和材料的制备:4. I)混合抗生素按说明书的方法配制盐酸万古霉素30mg,TMP25mg,多黏菌素B20mg,两性菌素20mg、灭菌蒸懼水100ml。4. 2)普通哥伦比亚血平板的制备按说明书方法配制，于三角瓶中称取哥伦比亚琼脂基础Sg，置于250ml锥形瓶中，加入180ml单蒸水，经121°C 20min高压蒸汽灭菌后，冷却至56°C左右，在超净工作台中加入混合抗生素2ml和无菌脱纤维羊血20ml，调PH值为7. 2，振荡混匀后快速倾倒平板，每皿约20ml，琼脂冷却凝固后放入4°C冰箱保存，3天内使用，同时随机选择一皿放入37°C温箱培养24h，确保无菌生长该批培养皿方可使用。4. 3)含样品血平板的制备不同浓度的样品血平板配制于三角烧瓶中称取哥伦比亚血琼脂粉3. 9g，加入89ml单蒸水，高压蒸汽灭菌后，冷却至50°C左右，每个样品不同梯度浓度的血平板按照浓度从高到低依次加入相应样品母液，使其终浓度为8mg/mL、4mg/mL、1024l·! g/mL、512l·! gmL、256 μ g/mL、128 μ g/mL>64 μ g/mL、32 μ g/mL,同时加入 Iml 混合抗生素和 IOml 无菌脱纤维羊血，振荡混匀后快速倾倒平板(平板直径为90mm)，琼脂冷却凝固后即可使用。4. 4)含溶媒血平板的配制(溶剂对照)方法同含样品血平板的配制，即加入相应体积的二甲亚砜或无水乙醇替代样品母液，以双蒸水作为溶剂则不需配制。
5)实验方法5. I)幽门螺旋杆菌标准株的复苏培养及菌株的鉴定从_80°C冰箱中取出幽门螺旋杆菌ATCC700392和幽门螺旋杆菌ATCC700824标准菌株，置于37°C水浴箱中溶解，用接种环醮取菌液均匀涂布于含混合抗生素的哥伦比亚血平板上，置于厌氧培养盒中，并于盒内放置两袋微需氧产气袋(85%N2，10%C02，5%02)，密封后置37°C培养72-96h。对这两株标准菌株进行培养特性、革兰染色、尿素酶鉴定、过氧化氢酶鉴定、氧化酶鉴定。5. 2)菌液配制将血平板上的菌落或菌苔刮至预冷含2ml脑心浸液肉汤管中，离心洗涤三次后，重悬于4°C脑心浸液肉汤中，将此菌液作10倍、100倍、1000倍稀释后，在紫外分光光度计上测菌液的0D600值，结果位于O. 1-1. O之间的OD值与菌液浓度有较好的线性关系，菌液含量的计算公式如下菌量/ml=2. 2 X IO8X OD6c 值X稀释倍数。将菌液稀释得到108CFU/mL。在15分钟内完成菌液配制和接种，接种过程中菌液需保持在4°C。
5.3)头花寥提取物的体外抗菌活性实验5. 3. I)菌液涂布吸取200 μ I浓度为108CFU/mL菌液，用L型棒在琼脂表面均匀涂布。按每种样品每个浓度均涂布2块平板。同时设阴性对照(即不加菌)、生长对照(即不加实验样品)、溶剂对照各两块平板。5.3.2)培养按照说明书方法，置于厌氧培养盒中，并于盒内放置两袋微需氧产气袋，密封后37°C培养72-96h后观察结果。每个样品的体外抗菌活性实验重复两次。5. 3. 3)头花寥提取物抑菌效果判定在阴性对照(即不加菌)无菌生长、生长对照(即不加实验样品)生长良好、溶剂对照无生长抑制现象的条件下，以完全无菌生长的样品最高稀释度为该菌株对相应样品的MIC。6)实验的结果:6. I)幽门螺旋杆菌的鉴定两株幽门螺旋杆菌ATCC700392和ATCC700824及临床分离株在普通哥伦比亚血平板上置于微需氧条件下培养72-96小时，菌落呈针尖状无色透明，光滑湿润，边缘整齐，凸起，呈小水滴样，菌苔灰白色，发油光。生化试验尿素酶试验阳性，氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阳性；在显微镜油镜下观察，典型的海鸥状，S状，革兰染色阴性。6. 2)头花寥提取物的体外抗菌活性试验实验结果见表I。表I、本发明实施例I的提取物对幽门螺旋杆菌体外抑菌结果(MIC)
权利要求
1.头花寥或其提取物在制备用于治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的药物中的用途。
2.权利要求I的用途，其特征在于以下(a)至(d)任一项或多项 (a)所述的头花寥是头花寥的鲜品或干品； (b)所述的头花寥是选自头花寥的全草、地上部分、叶、花、茎、种子或其组合； (C)所述的头花寥是选自头花寥的地上部分； (d)所述的头花寥是选自头花寥的叶、花、茎、种子或其组合。
3.权利要求I至2任一项的用途，其特征在于以下(a)至(C)任一项或多项 (a)所述提取物是头花寥用水、乙醇、乙醇水溶液或其组合作为溶剂，经提取获得的提取物；或者是头花寥经二氧化碳超临界提取方法获得的提取物；进一步地；所述乙醇水溶液是3(Γ99%乙醇水溶液； (b)所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物由头花寥药材用水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取，浓缩提取液，干燥。或者，其中所述提取物是用二氧化碳超临界萃取头花寥得到的； (c)所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物取头花寥药材，加5 20倍的水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取I飞次，每次O. 5飞小时，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为l.f I. 5 (25° C)的稠膏，干燥，即得。
4.权利要求I至3任一项的用途，其中所述与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症选自胃粘膜相关性淋巴瘤、消化性溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急慢性胃炎、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌、心血管疾病、冠心病、动脉硬化、脑梗塞、高血压、贫血、缺铁性贫血、消化性溃疡复发、胃黏膜萎缩、肠上皮化生、以及血小板减少性紫癜，以及它们的并发症。
5.权利要求I至4任一项的用途，其中所述的药物中还包含一种或多种其它的药物，该其它的药物选自抗微生物药(例如青霉素类例如阿莫西林，大环内酯类例如克拉霉素，硝咪唑类例如甲硝唑)、质子泵抑制剂(例如奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑)、胃粘膜保护剂(例如硫糖铝、思密达)。
6.用于治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的药物组合物，其中包含头花寥或其提取物，以及任选的药学可接受的载体或赋形剂。
7.权利要求6的药物组合物，其特征在于以下(a)至(d)任一项或多项 所述的头花寥是头花寥的鲜品或干品； 所述的头花寥是选自头花寥的全草、地上部分、叶、花、茎、种子或其组合； 所述提取物是头花寥用水、乙醇、乙醇水溶液或其组合作为溶剂，经提取获得的提取物；或者是头花寥经二氧化碳超临界提取方法获得的提取物； 所述乙醇水溶液是3(Γ99%乙醇水溶液。
8.权利要求6至7的药物组合物，其特征在于 (a)所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物由头花寥药材用水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取，浓缩提取液，干燥。或者，其中所述提取物是用二氧化碳超临界萃取头花寥得到的；和/或 所述提取物是按照包括如下步骤的方法制备的提取物取头花寥药材，加5 20倍的 水、乙醇、或乙醇水溶液煎煮和/或回流提取I飞次，每次O. 5飞小时，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为I. f I. 5 (25° C)的稠膏，干燥，即得。
9.权利要求6至8任一项的药物组合物，其中所述与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症选自胃粘膜相关性淋巴瘤、消化性溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急慢性胃炎、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌、心血管疾病、冠心病、动脉硬化、脑梗塞、高血压、贫血、缺铁性贫血、消化性溃疡复发、胃黏膜萎缩、肠上皮化生、以及血小板减少性紫癜，以及它们的并发症。
10.权利要求6至9任一项的药物组合物，其中还包含一种或多种其它的药物，该其它的药物选自抗微生物药(例如青霉素类例如阿莫西林，大环内酯类例如克拉霉素，硝咪唑类例如甲硝唑)、质子泵抑制剂(例如奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑)、胃粘膜保护剂(例如硫糖招、思S达)。
全文摘要
本发明涉及治疗幽门螺旋杆菌相关疾病的新方法。具体涉及头花蓼或其提取物在制备用于治疗和/或预防与幽门螺旋杆菌感染有关的疾病或病症的药物中的用途。本发明发现所述提取物可有效抑制幽门螺旋杆菌。
文档编号A61P9/10GK102824417SQ20121035285
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月20日 优先权日2011年9月26日
发明者王子厚, 莫非, 张淑华, 张姝, 胡伏莲, 杨国珍, 罗昭逊, 夏曙华, 孙朝琴, 张然 申请人:王子厚