专利名称：一种纳米佐剂及含有该纳米佐剂的流感病毒疫苗及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米佐剂及流感病毒疫苗，具体涉及一种纳米佐剂及含有该纳米佐剂的流感病毒疫苗及制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
流行性感冒感传染性极强(主要通过飞沫或人与人密切接触传播)，而且流行、变异极快，同时极易引起多种并发症，而导致死亡。流感分为季节性流感和大流行流感，季节性流感多发于冬季，由于季节性流感病毒大多存在于人群中，对人体免疫系统而言，其危害 性相对较小。但当流感病毒突变或者跨越物种而从其他动物感染给人类，则容易造成大流行流感。目前防止流感最有效的手段就是接种流感疫苗。但面对大流行的暴发，要在短时间内提供足够多的疫苗免疫易感人群，目前尚无法做到。佐剂属于抗原辅助剂，能够与疫苗共同使用而明显提高疫苗的免疫效果。由于流感疫苗的生产在时间上属于后延性，一旦大流行流感暴发，难于在短时间内大量生产出急需的疫苗量。但当辅以较好的佐剂时，则可在增强流感疫苗免疫效果的同时，有效减少流感疫苗的用量，让更多的易感人群能够接种疫苗，以应对大流行流感的暴发。就常规的疫苗佐剂而言，目前已经应用于流感疫苗的佐剂有铝佐剂、MF59、LTK63等。铝佐剂可以增强初次免疫，减少每次免疫抗原的用量以及免疫次数，但是对于嗣后加强免疫效果较小，且可能发生多种不良反应。其余的MF59、LTK63，虽不良反应较少，但对疫苗免疫原性的增强作用不明显。目前将粒径小于IOOnm的乳剂称为纳米乳剂，它由油相-水相-乳化剂-助乳化剂组成，连续相为水相、分散相为油相的纳米乳剂为0/W型，连续相为油相、分散相为水相的纳米乳剂为W/0型。纳米乳剂具有粒径小且均匀，易于制备，稳定性、流动性均较好，易于注射等特点，可作为药物载体应用于多种吸收方式的药物制剂中。
发明内容
为克服现有疫苗佐剂，尤其是流感疫苗铝佐剂存在的不良反应，MF59、LTK63等佐剂对疫苗免疫原性的增强作用不明显等不足，本发明提供一种纳米佐剂，还提供含有该纳米佐剂的流感病毒疫苗及制备方法，可以极大增强疫苗免疫效果，降低不良反应，减少每剂流感疫苗的使用量，满足大流行流感暴发期的用量。本发明提供的是这样一种纳米佐剂，由下列质量比的组分组成
油相10 50%
乳化剂20 50%
助乳化剂20 50%。所述油相为市购的棉子油或注射用无水羊毛脂。
所述乳化剂为市购的豆磷脂或卵磷脂。所述助乳化剂为市购的海藻酸钠或单硬脂酸甘油酯。本发明提供的纳米佐剂经过下列方法制备
A、按下列质量比备料
油相10 50%
乳化剂20 50%
助乳化剂20 50% ；
B、将步骤A的乳化剂、助乳化剂和油相混合后，在20 60°C温度下，按50-500转/分钟的转速，搅拌均匀，得纳米佐剂。 本发明提供的是这样一种含有纳米佐剂的流感病毒疫苗，由下列质量比的组分组成:血凝素含量为15 180 μ g/株.ml的流感病毒疫苗10 30%
油相10 50%·
乳化剂20 50%
助乳化剂20 50%。所述稀释流感病毒疫苗为将流感病毒疫苗原液或半成品或成品的用注射用水稀释到血凝素含量为15 180 μ g/株.ml的流感病毒疫苗。所述流感病毒疫苗原液是用世界卫生组织(WHO)提供的毒种所制备的公知公用产品。本发明提供的含有纳米佐剂的流感病毒疫苗，经过下列步骤制备
A、按下列质量比备料
血凝素含量为15 180 μ g/株.ml的流感病毒疫苗10 30%
油相10 50%
乳化剂20 50%
助乳化剂20 50% ；
B、将步骤A的乳化剂、助乳化剂和油相混合后，在20 60°C温度下，按50-500转/分钟的转速，搅拌均匀，得纳米佐剂；
C、用注射用水稀释步骤A的流感病毒疫苗至血凝素达15 180μ g/株.ml，得稀释流感病毒疫苗；
D、将步骤C所得的稀释流感病毒疫苗缓慢滴入步骤B所得纳米佐剂中，同时按50-500转/分钟的速度搅拌混合，直至得到均匀分散的透明的含有纳米佐剂的流感病毒疫苗。制得的含有纳米佐剂的流感病毒疫苗经检测，结果如下1.经马尔文粒径检测仪检测，粒径为10 IOOnm,合格；2.经1500_8000rpm，15min离心，不分层，合格；3.经4°C 60°C放置7 60天，无变化，合格。本发明具有下列优点和效果采用上述方案，即可获得含有纳米佐剂的流感病毒疫苗，其中的纳米佐剂具有毒性小，性质温和，增溶药物效果明显，流动性良好，对机体刺激性极小等优点，极大增强了流感病毒疫苗的免疫效果，本发明提供的含纳米佐剂的流感病毒疫苗，与无佐剂的流感病毒疫苗相比，具有给药量小、生物利用度高的优点；与含其他佐剂的流感疫苗相比，具有极大的增强疫苗生物利用度、减小刺激性、降低不良反应、延长疫苗释放时间，以及增强疫苗靶向性，降低损耗率等优点。经系统查阅文献和专利，目前未发现关于纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗的报道。
图I为不同接种组在8周内血凝抑制效价的变化。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明做进一步说明，本发明包括但不仅限于以下实施例。本发明实施例所用的流感病毒疫苗原液为公知公用产品，并且是按照《中国药典》三部2010版中所述流感病毒裂解疫苗制造方法制备的，依据《中国药典》三部2010版所述各项检定标准检验合格的流感病毒疫苗原液。实施例I
A、用注射用水稀释流感病毒疫苗原液至血凝素浓度为30μ g/(株.ml)， 得稀释流感病
毒疫苗；
B、按下列质量比备料稀释流感病毒疫苗10g，棉子油50g，海藻酸钠20g，豆磷脂
20g；
C、向混合搅拌瓶内加入20g豆磷脂，20g海藻酸钠，60°C温度下持续搅拌，转速维持在50转/分钟,之后加入50g棉子油,得混合溶液；
D、在上述混合溶液中缓慢滴入步骤A的稀释流感病毒疫苗10g，同时维持转速在50转/分钟，搅拌至液体为透明，得到含有纳米佐剂的流感病毒疫苗。制得的流感病毒疫苗进行如下检测1.经马尔文粒径检测仪检测,粒径范围为
28.596 42. 218nm,合格；2.经1500rpm, 15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格；3.经4°C放置60天，纳米乳剂体系无变化，合格。实施例2
A、用注射用水稀释流感病毒疫苗原液至血凝素浓度为15μ g/(株.ml)，得稀释流感病
毒疫苗；
B、按下列质量比备料30g稀释流感病毒疫苗，30g注射用无水羊毛脂，20g单硬脂酸甘油酯，20g豆磷脂；
C、向混合搅拌瓶内加入20g豆磷脂和20g单硬脂酸甘油酯，20°C温度下持续搅拌，转速维持在500转/分钟，之后加入30g注射用无水羊毛脂，得混合物；
D、在上述混合物中缓慢滴入稀释的流感病毒疫苗30g，同时维持转速在500转/分钟，搅拌至液体为透明，得到含有纳米佐剂的流感病毒疫苗。制得的流感病毒疫苗进行如下检测1.经马尔文粒径检测仪检测,粒径范围为
29.972 36. 633nm,合格；2.经3000rpm, 15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格；3.经20°C放置30天，纳米乳剂体系无变化，合格。实施例3
A、用注射用水稀释流感病毒疫苗原液至血凝素浓度为50μ g/ (株.ml);
B、按下列质量比备料20g稀释流感病毒疫苗，20g注射用无水羊毛脂，40g单硬脂酸甘油酯，20g豆磷脂；
C、向混合搅拌瓶内加入20g豆磷脂，40g单硬脂酸甘油酯，40°C温度下持续搅拌，转速维持在200转/分钟，之后加入20g注射用无水羊毛脂，得混合物；
D、在上述混合物中缓慢滴入稀释的流感病毒疫苗20g，同时维持转速在200转/分钟，搅拌至液体为透明，得到含有纳米佐剂的流感病毒疫苗。制得的流感病毒疫苗进行如下检测1.经马尔文粒径检测仪检测,粒径范围为.28. 064 34. 548nm,合格；2.经4000rpm, 15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格；.3.经26°C放置50天，纳米乳剂体系无变化，合格。实施例4
A、用注射用水稀释流感病毒疫苗原液至血凝素浓度为180 μ g/(株.ml)
B、按下列质量比备料IOg稀释流感病毒疫苗，IOg棉子油，30g单硬脂酸甘油酯，.50g卵磷脂；
C、向混合搅拌瓶内加入50g卵磷脂，30g单硬脂酸甘油酯，30°C温度下持续搅拌，转速维持在300转/分钟，之后加入IOg棉子油，得混合物；
D、在上述混合物中缓慢滴入稀释的流感病毒疫苗10g，同时维持转速在300转/分钟，搅拌至液体为透明，得到含有纳米佐剂的流感病毒疫苗。制得的流感病毒疫苗进行如下检测1.经马尔文粒径检测仪检测,粒 径范围为26. 258 38. 162nm，合格；2.经6000rpm，15min离心分离，纳 米乳剂体系不分层，合格；3.经30°C放置20天，纳米乳剂体系无变化，合格。实施例5
A、用注射用水稀释流感病毒疫苗原液至血凝素浓度为120 μ g/(株.ml)；
B、按下列质量比备料15g稀释流感病毒疫苗，IOg注射用无水羊毛脂，海藻酸钠.50g,卵磷脂25g ；
C、向混合搅拌瓶内加入25g卵磷脂，50g海藻酸钠，50°C温度下持续搅拌，转速维持在.100转/分钟，之后加入IOg注射用无水羊毛脂，得混合物；
D、在上述混合物中缓慢滴入稀释的流感病毒疫苗15g，同时维持转速在80转/分钟，搅拌至液体为透明，得到含有纳米佐剂的流感病毒疫苗。制得的流感病毒疫苗进行如下检测1.经马尔文粒径检测仪检测,粒径范围为.28. 972 37. 925nm,合格；2.经8000rpm, 15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格；.3.经60°C放置7天，纳米乳剂体系无变化，合格。免疫效果试验
用实施例I提供的含有纳米佐剂的流感病毒疫苗注射小鼠。小鼠为标准体重昆明种雄性小鼠，每只注射血凝素含量相当于按照体重换算的成人剂量的10倍的含有纳米佐剂的流感病毒疫苗。Od接种一针，21d补种一针，每隔7d采尾血分离血清测定血凝抑制效价。同时设立注射等量生理盐水的空白对照组、等血凝素含量的Al (OH)3佐剂流感疫苗的佐剂对照组、等血凝素含量的流感疫苗对照组。图I为等量生理盐水空白对照组、等血凝素含量的流感疫苗单独注射组、等血凝素含量的Al (OH) 3佐剂流感疫苗组、等血凝素含量的含有纳米佐剂的流感病毒疫苗组，其四个组注射昆明种小鼠，每隔7天采尾血，分离血清测定血凝抑制效价的比较图。其中未经疫苗注射的空白对照组小鼠血
清血凝抑制效价均为O ;其余三组疫苗接种8周内的血凝抑制效价见表I。表I不同接种组在8周内的血凝抑制效价变化
权利要求
1.一种纳米佐剂，由下列质量比的组分组成油相10 50%乳化剂20 50%助乳化剂20 50% ； 其中，所述油相为市购的棉子油或注射用无水羊毛脂；所述乳化剂为市购的豆磷脂或卵磷脂；所述助乳化剂为市购的海藻酸钠或单硬脂酸甘油酯。
2.如权利要求I所述的纳米佐剂，其特征在于经过下列方法制备 A、按下列质量比备料油相10 50%乳化剂20 50%助乳化剂20 50% ； B、将步骤A的乳化剂、助乳化剂和油相混合后，在20 60°C温度下，按50-500转/分钟的转速，搅拌均匀，得纳米佐剂。
3 一种含有如权利要求I所述纳米佐剂的流感病毒疫苗，其特征在于由下列质量比的组分组成 血凝素含量为15 180 μ g/株.ml的流感病毒疫苗10 30%油相10 50%乳化剂20 50%助乳化剂20 50%。
4.如权利要求3所述含有纳米佐剂的流感病毒疫苗，其特征在于所述稀释流感病毒疫苗为将流感病毒疫苗原液或半成品或成品的用注射用水稀释到血凝素含量为15 180 μ g/株.ml的流感病毒疫苗。
5.如权利要求3所述含有纳米佐剂的流感病毒疫苗，其特征在于经过下列步骤制备 A、按下列质量比备料 血凝素含量为15 180 μ g/株.ml的流感病毒疫苗10 30%油相10 50%乳化剂20 50%助乳化剂20 50% ； B、将步骤A的乳化剂、助乳化剂和油相混合后，在20 60°C温度下，按50-500转/分钟的转速，搅拌均匀，得纳米佐剂； C、用注射用水稀释步骤A的流感病毒疫苗至血凝素达15 180μ g/株.ml，得稀释流感病毒疫苗； D、将步骤C所得的稀释流感病毒疫苗缓慢滴入步骤B所得纳米佐剂中，同时按50-500转/分钟的速度搅拌混合，直至得到均匀分散的透明的含有纳米佐剂的流感病毒疫苗。
全文摘要
本发明提供一种纳米佐剂及含有该纳米佐剂的流感病毒疫苗及制备方法，含有纳米佐剂的流感病毒疫苗由下列质量比的组分组成血凝素含量为15～180μg/株.ml的流感病毒疫苗10～30%，油相10～50%，乳化剂20～50%，助乳化剂20～50%。其中的纳米佐剂具有毒性小，性质温和，增溶药物效果明显，流动性良好，对机体刺激性极小等优点，极大增强了流感病毒疫苗的免疫效果，本发明提供的含纳米佐剂的流感病毒疫苗，与无佐剂的流感病毒疫苗相比，具有给药量小、生物利用度高的优点；与含其他佐剂的流感疫苗相比，具有极大的增强疫苗生物利用度、减小刺激性、降低不良反应、延长疫苗释放时间，以及增强疫苗靶向性，降低损耗率等优点。
文档编号A61K39/39GK102886044SQ201210403729
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者李映波, 孙笠雯 申请人:李映波