专利名称：13-甲基十四烷酸在制备治疗局灶性脑缺血的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物应用，尤其涉及一种13-甲基十四烷酸在制备治疗局灶性脑缺血的药物中的应用。
背景技术：
缺血性脑血管病(ischemiccerebrovascular disease, ICVD),是指供应脑的血管病变或血流动力学障碍所致的脑部血液供应障碍，使相应供血区脑组织由于缺血、缺氧，而引起短暂或持久的局部或弥漫性脑损伤，造成一系列神经功能缺损症候群，并出现脑组织坏死或软化。具有发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高和愈发愈重的特点，并有不断升高及年轻化的趋势，严重危害人类健康和生活质量。临床上大多数脑梗死是由于脑动脉血栓形成所致，一旦脑动脉阻塞，缺血、缺氧区域的脑组织细胞即刻发生一系列的“缺血瀑布样反应”，最后导致细胞死亡。其中以大脑中动脉血栓形成最为常见。我们的实验采用线栓法制备大鼠右大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，分别复制不同时限的局灶性脑缺血，在此基础上，以不同剂量的13-甲基十四烷酸(13-methyltetradecanoic acid, 13-MTD)干预，观察治疗结果。13-MTD是一种末端支链饱和脂肪酸，化学结构:C15H3tlO2, MW242.4，天然存在于细菌和某些真菌的细胞膜上，是细菌胞膜的重要成分。本发明在下述实验中采用的13-MTD为福建医科大学药学院经多年实验研究，通过化学合成方法得到的高纯度13-MTD，气相色谱检测纯度> 98.5%，化学结构为13-甲基十四烷酸，LD50 口服给药> 2g /kg。我们的实验结果提示，13-MTD的几个剂量均可有效改善不同时限的局灶性脑缺血，可能是治疗缺血性脑血管疾病很有前途的一种先导化合物，已在深入研究。而目前13-MTD及其同类物对中枢的作用以及对缺血性脑血管疾病的影响国内外文献尚未见报道。相关文献仅见于外周，主要是稳定细胞膜，抗炎抑 菌，抗氧化，防治血栓形成，以及对肿瘤细胞的凋亡调控作用。目前临床对脑缺血的药物治疗主要是基于神经保护药，目的是改善脑代谢和脑循环。此类药物有数十种，但尚缺乏多中心、随机、双盲、和安慰剂对照试验的检验，疗效很难评价。其中依达拉奉(必存注射剂)，是临床新型的治疗缺血性脑卒中的神经保护药，其药理机制在于通过清除自由基，抑制脑细胞脂质过氧化，以防治神经元死亡。我们在实验中以依达拉奉作为阳性对照药，在MCA012h造成的局灶性脑缺血模型中，应用13-MTD80mg/kg与依达拉奉3mg/kg分别静脉注射给药，比较它们对脑梗塞灶的改善作用，结果表明，13-MTD组的疗效更优于依达拉奉组。
发明内容
本发明的目的是提供一种13-甲基十四烷酸在制备治疗局灶性脑缺血的药物中的应用。本发明的目的是这样实现的，所述的13-甲基十四烷酸(13-MTD)，是一种末端支链饱和脂肪酸，化学结构=C15H3tlO2, MW242.4，其天然存在于细菌和某些真菌的细胞膜上，是细菌胞膜的重要成分。本发明采用的13-MTD，为福建医科大学药学院经多年实验研究，通过化学合成方法得到的高纯度13-MTD，气相色谱检测纯度> 98.5%，化学结构为13-甲基十四烷酸，LD50 口服给药> 2g /kg。所述的13-甲基十四烷酸在制备治疗缺血性脑血管病尤其是局灶性脑缺血的药物中的应用。本发明的优点为:13_MTD是一种末端支链饱和脂肪酸，作为细胞膜成分能嵌入膜脂质结构中，可通过调节膜的组成而影响细胞功能，对哺乳动物细胞膜有膜稳定作用。而脑是一个富含脂质的器官，脑缺血后，由于较强的脂质过氧化反应，可使膜磷脂降解，造成脑细胞严重损伤，对此，13-MTD应具有较好的膜保护作用，同时我们进一步的实验也证实，13-MTD可通过抗炎、抗氧化、防治脑细胞凋亡、保护血脑屏障(BBB)的作用治疗缺血性脑血管病。本发明在实验中以不同剂量的13-MTD和溶媒组比较发现，13-MTD 40、80、120mg/kg均可明显改善局灶性脑缺血6、12、24h后的神经功能缺失症状0°〈0.001)，使脑梗死体积明显缩小0°〈0.01，P<Q.05)。在MCA012h模型中，13-MTD 80mg/kg组比阳性对照药依达拉奉3mg/kg组的脑梗死灶缩小更明显(/X0.01)。13-MTD 40、80、120mg/kg还可明显减轻脑缺血6、12、24h后的脑水肿程度和脑含水量(/X0.01，/X0.05)，并使损伤侧脑组织EB渗出明显减少0°〈0.01，K0.05)ο以上药效均有明确量效依赖性，以13-MTD 80 mg/kg疗效最佳。在局灶性脑缺血6、12、24h模型中，13-MTD80mg/kg被证实可下调损伤脑星形胶质细胞的AQP4蛋白表达0°〈0.001)，上调损伤脑脑血管内皮细胞的ZO-1蛋白表达0°〈0.001)，表明13-MTD改善脑细胞水肿，保护BBB结构功能的作用，与脑细胞AQP4蛋白表达降低和ZO-1蛋白表达增加有关。综上所述，I)本发明的13-MTD可有效改善局灶性脑缺血，是治疗缺血性脑血管疾病很有前途的一种先导化合物。2)不同剂量的13-MTD在不同时限的局灶性脑缺血中均有明显的药效作用。其治疗局灶性脑缺血的优势在于:13-MTD可化学合成，分子量小，脂溶性强，对BBB穿透率高，与脑组织脂质结构亲和力好，可快速高效作用于靶组织。且不良反应小，安全范围较大，可 静脉给药，尤其对危重病程的脑缺血的治疗应具有更好的临床适用性。
图1为13-MTD40，80, 120mg/kg对大鼠MCAO 6、12、24h后神经功能缺失评分的比较图('X ±5，n=5 ) ；6h:aP<0.001 ^Vehicle ； bP<0.01 vs M40, dP〈0.001 vs Ml20 ；eP〈0.001 vs M120 ；12h:aP<0.001 ^Vehicle ； CP<0.05 vs M40，dP〈0.001 vs Ml20 ；eP〈0.001 vs M120 ；24h:aP<0.001 ^Vehicle ； bP〈0.01 vs M40，dP〈0.001 vs Ml20 ；eP<0.001 vs M120。图2为13-MTD 40，80, 120mg/kg对大鼠MCAO 6、12、24h后脑梗塞体积的改善作用图('X ±5., n=5 )。图3-1为13-MTD80 mg/kg与依达拉奉3mg/kg对大鼠MCAO 12h后脑梗塞体积的改善作用比较图('X ±5., n=5 ) O图3-2为13-MTD80 mg/kg与依达拉奉3mg/kg对大鼠MCAO 12h后脑梗塞体积的改善作用的柱形比较图('X ±5., n=5 ) ο图4为13-MTD 40，80, 120mg/kg对大鼠MCAO 6、12、24h后脑梗塞体积改善作用的比较图('X ±5., n=5 )；
6h: a P〈0.0l ^Vehicle; b P〈0.05 vs M40; CP〈0.01 vs M120 ；
12h: d P〈0.05 ；e P〈0.01 ^Vehicle; f P〈0.05 vs M40; g P〈0.01 vs M120 ；24h: h P<0.01f5 Vehicle; 1 P<0.05vs M40; J P〈 0.01 vs M120。图5为13-MTD 40，80, 120mg/kg对大鼠MCAO 6、12、24h后脑水肿程度改善作用的比较图('X ±5., n=5)；
6h: aP<0.01κ5 Vehicle; bP<0.01 vs M40; d P<0.01 vs M120 ；
12h: aP〈0.01 ^Vehicle; c P〈0.01 vs M40; dP〈0.01 vs M120 ；
24h: aP<0.01 ^Vehicle; b P<0.01 vs M40; d P<0.01 vs M120o图6为13-MTD 40，80, 120mg/kg对大鼠MCAO 6、12、24h后脑组织含水量改善作用的比较图('X ±5., n=5)；
6h: a P〈0.01 F^Sharn; b P〈0.01，c P<0.05vs Vehicle; d P〈0.01 vs M40; eP〈0.01 vs M120 ；
12h: a P〈0.01 F^Sharn; b P〈0.01 ^Vehicle; d P〈0.01 vs M40; e P〈0.01 vs M120 ；24h: a P〈0.01 F^Sharn; b P〈0.01 ^Vehicle; d P〈0.01 vs M40; e P〈0.01 vs M120。图7为 13-MTD 40，80, 120mg/kg 对大鼠MCAO 6、12、24h后脑组织EB 渗出的影响图('X ±.5, n=5)。图8为 13-MTD 40, 80, 120mg/kg 对大鼠 MCAO 6、12、24h后脑组织 EB渗出量的影响比较图('X ±5., n=5)；
6h: a P〈0.01 F^Sharn; b P〈0.01，c P<0.05vs Vehicle; d P〈0.01 vs M40; fP〈0.01 vs M120 ；
12h: a P〈0.01 F^Sharn; b P〈0.01 ^Vehicle; d P〈0.01 vs M40; f P〈0.01 vs M120 ；24h: a P〈0.01 F^Sharn; b P〈0.01 ^Vehicle; e P〈0.01 vs M40; f P〈0.01 vs M120。图9为13-MTD 80 mg/kg对大鼠MCAO 6、12、24h后损伤侧脑组织AQP4蛋白表达的影响的免疫组化检测结果图(X400);图中:A: Sham-6h; B: Veh-6h ；C: M80-6h ；D:Sham-12h ；E: Veh-12h ；F: M80_12h ;G: Sham_24h ;H: Veh-24h ；1: M80_24h。图10为13-MTD 80 mg/kg对大鼠MCAO 6、12、24h后损伤侧脑组织AQP4蛋白表达阳性细胞面积的影响比较图(i±s, n=5)；
6h: aP〈0.0OlKsSham; bP〈0.0OlrVehicle, CP〈0.0lKsVeh_12h，dP〈0.00lKsVeh_24h;hP〈0.0Iks M80-12h, ^<0.0OIks M80_24h ；
12h: aP<0.001FSham; bP<0.0OlF5Vehicle; eP〈0.0lKsVeh_6h; fP〈0.00lKsVeh_24h;JP<0.0Iks M80-6h, M80_24h ；
24h: aP〈0.001 F5Sham; b P〈0.001 ^Vehicle; gP〈0.001 vs Veh-6h, Veh_12h;kP〈0.001 vs M80-6h; lp〈0.01 vs M80_12h。图11为13-MTD 80 mg/kg对大鼠MCAO 6、12、24h后损伤侧脑组织AQP4蛋白表达阳性细胞IOD值的影响比较图('X ±5., n=5)；
6h: aP<0.001 F1S1Sh am; bP<0.001 F^Veh-12h, Veh_24h; eP<0.001 vs Vehicle;^<0.001 VS M80-12h, M80_24h ；12h: aP<0.0Ol F1S1Sham; P<0.001 F5Veh-6h, Veh_24h; fP<0.05 vs Vehicle;iP〈0.01 vs M80-6h, J P〈0.01 vs M80- 24h ；
24h: aP<0.001 F^Sharn; d P<0.001 vsYeh~6h, Veh-12h; gP<0.01 vs Vehicle;k P<0.001 vs M80-6h, 1 P<0.01 vs M80_12h。图12为13-MTD 80 mg/kg对大鼠MCAO 6、12、24h后损伤侧脑组织Z0-1蛋白表达的影响的免疫组化检测结果图(X400);图中:A:Sham-6h; B:Veh-6h; C: M80-6h;D: Sham-12h; E Veh-12h; F: M80_12h;G: Sham_24h; H: Veh-24h; 1: M80_24h。图13为3-MTD 80 mg/kg对大鼠MCAO 6、12、24h后损伤侧脑组织Z0_1蛋白表达阳性细胞面积的影响比较图(.V ±.5，η=5)；
6h: aP<0.001 F5Sham; bP<0.001 ^Vehicle, CP<0.01 F5Veh-12h, dP<0.001KsVeh-24h; hP〈0.001 vs M80-12h, M80_24h
12h: aP<0.001FSham; bP<0.0OlF5Vehicle; eP〈0.0lKsVeh_6h; fP〈0.00lKsVeh_24h;^〈0.0OIks M80-6h; JP〈0.01 vs M80_24h
24h: aP〈0.001 F5Sham; b P〈0.001 ^Vehicle; gP〈0.001 vs Veh-6h, Veh_12h;kP〈0.001 vs M80-6h; lp〈0.01 vs M80-1 2h。图14为13-MTD 80 mg/kg对大鼠MCAO 6、12、24h后损伤侧脑组织Z0_1蛋白表达阳性细胞IOD值的影响比较图('X ±.5，η=5)；
6h: aP<0.001 F5Sham; bP<0.001 ^Vehicle, CP〈0.01 F5Veh-12h, dP<0.001KsVeh-24h; iP<0.001 vs M80-12h, M80_24h
12h: aP〈0.001 F^Sharn; bp〈0.001 ^Vehicle; e P〈0.01 vs Veh-6h, fP〈0.001 vsVeh-24h; iP<0.001 vs M80-6h, M80-24h
24h: aP〈0.001 F^Sharn; b P〈0.001 ^Vehicle; gP〈0.001 vs Veh-6h, hP〈0.001 vsVeh-12h; kP〈0.001 vs M80-6h, M80_12h。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述:
13-甲基十四烷酸(13-MTD)的实验方法与结果
一、实验方法与实验动物分组
Sprague-Dawley (SD)大鼠，由福建医科大学实验中心提供(SCXK闽2012-0001)，古，体重230 270g，每组5只。线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，缺血时间分为
6、12、24h，造成不同时限的局灶性脑缺血，于插入栓线前30min分别尾静脉注射13-MTD40、80、120mg/kg。实验动物随机分为假手术组(Sham):即 Sham_6h、Sham-12h> Sham_24h 组。Sham组除不插入线栓，其它相同。空白脂质体对照组:即溶媒组(Vehicle)，包括Veh_6h、Veh-12h、Veh_24h 组。用药组:13_MTD40、80、120mg/kg 组(M40、M80、M120)，即 M40_6h、M40-12h、M40-24h 组，M80-6h、M80-12h、M80_24h 组，M120-6h、M120-12h、M120_24h 组。阳性对照药依达拉奉(Edaravone)组，即在MCA012h模型中，13_MTD80mg/kg组与依达拉奉3mg/kg组分别尾静脉给药，对照脑梗死体积。以上，Sham组除不插入线栓，其它相同。假手术组和溶媒组分别给予等体积脂质体，作为实验对照。各组大鼠均于相应缺血时间处死取材，待测指标。实验以Longa神经功能缺失评分观察神经功能缺失症状(O分:无明显神经损伤症状；I分:提尾悬空时不能完全伸展左前肢；2分:向左侧旋转即追尾征；3分:行走时向左侧倾倒；4分:不能自行行走)。TTC染色观察脑梗死体积大小。AutoCAD图像分析软件计算脑水肿程度。脑干湿重测定脑含水量。伊文思蓝(EB)检测血脑屏障(BBB)通透性。免疫组织化学法分别检测损伤侧脑组织星形胶质细胞水通道蛋白-4 (AQP4)蛋白表达、脑血管内皮细胞紧密连接蛋白-1 (ZO-1)蛋白表达。二、实验结果
(I)13-MTD对神经功能缺失评分的改善作用
各组大鼠于脑缺血6、12、24h时分别处死，并进行神经功能缺失评分比较。Sham组评O分。Veh-6h、12h、24h组均有不同程度的神经功能缺失症状，表现为右侧眼睑下垂，提尾悬空时左前肢内收及躯干向左侧扭转，运动时出现向左侧转圈式行走为追尾征，神经功能缺失严重时向左侧倾倒。各缺血时段神经功能评分有明显差异(/X0.001)。与脑缺血各时段Vehicle组(Veh_6h、12h、24h组)比较，13-MTD 40、80、120mg/kg均可降低各缺血时段的神经功能缺失评分0°〈0.001)，且存在剂量依赖性0°〈0.001)，以13-MTD80 mg/kg组改善最为明显0°〈0.05，/X0.01，K0.001)。提示不同剂量的13-MTD均可有效改善脑缺血后的神经功能缺失症状，保护脑的正常神经功能(见图1)。(2) 13-MTD对损伤侧脑梗塞体积的改善作用
Sham组切片经2%TTC染色后脑片全红，色泽均匀。脑缺血各时段，Veh-6h组损伤侧脑组织色泽度尚可，整体完整，缺血侧脑片2%TTC染色后可见皮层部分有白色梗死灶；Veh-12h组白色梗死灶明显，累及整个缺血侧的大脑皮层；Veh-24h组白色梗死灶最为明显，可累及到整个缺血侧脑半球并伴有轻度的糜烂。13-MTD 40、80、120mg/kg组均可改善不同时限脑缺血损伤侧脑组织外观，使白色梗死灶范围显著减少(ΖΧ0.01)，且各组间存在剂量依赖性0°〈0.05，/Χ0.01)， 以 13-MTD80 mg/kg 组治疗效果最好(/Χ0.05，/Χ0.01)。脑缺血 12h 模型中，13-MTD 80mg/kg组梗死灶体积较阳性对照药依达拉奉3mg/kg组更小0°〈0.01 )。提示不同剂量的13-MTD均可显著缩小脑缺血后的脑梗塞体积，减轻脑组织脑组织坏死或软化，保护脑细胞功能(见图2，3，4)。(3) 13-MTD对损伤侧脑组织水肿程度的改善作用
3.1 AutoCAD软件测量脑水肿程度
Sham组大脑体积均匀；各缺血时段Veh-6h、12h、24h组，左右两侧脑组织体积不均等，缺血侧脑组织体积稍大，水肿明显0°〈0.01)。与Veh-6h、12h、24h组相比，13-MTD 40、80、120mg/kg组脑组织水肿减轻0°〈0.01)。各剂量组之间有显著量效差异0°〈0.01，P<Q.05)，以13-MTD 80mg/kg组脑组织水肿程度减轻更明显G°〈0.01)。提示不同剂量的13-MTD均可有效减轻脑缺血造成的脑组织水肿，减轻脑损伤(见图5)。干湿重比较测定脑组织含水量
与Sham组相比，Veh-6h、12h、24h组脑组织含水量明显增加G°〈0.01)，Veh_24h组最严重0°〈0.001)。与脑缺血各时点Vehicle组比较，13-MTD 40、80、120mg/kg组脑组织含水量均明显下降0°〈0.01，P<Q.05)，并有量效差异0°〈0.01)，以13-MTD 80mg/kg组效果最好0°〈0.01)。此与上述AutoCAD软件测量脑水肿程度的情况一致。提示不同剂量的13-MTD可有效降低脑缺血后的脑组织含水量，保护脑细胞功能(见图6)。(4) 13-MTD对损伤侧血脑屏障(BBB)通透性的保护作用Sham组脑片肉眼基本看不见蓝色渗出。与Sham组相比,各缺血时间段Veh_6h、12h、24h组可见明显的蓝色区域0°〈0.01)。与各缺血时段Vehicle组比较，13-MTD 40、80、120mg/kg组脑伊文氏蓝(EB)渗出明显减少0°〈0.01，/X0.05)，各用药组间有明显量效差异0°〈0.01)，以13-MTD 80mg/kg组效果更好。提示不同剂量的13-MTD均可保护不同时限的脑缺血后的BBB损伤，防止脑缺血病程进一步发展(见图7，8)。(5) 13-MTD对损伤脑星形胶质细胞AQP4蛋白表达的影响
脑内AQP4蛋白表达呈阳性的细胞，胞膜上呈均匀分布的棕黄色颗粒。AQP4蛋白主要表达于星形胶质细胞(AST)胞膜上。Sham组有少量AQP4阳性细胞表达。Veh_6、12、24h组AQP4阳性细胞数、阳性面积、IOD值升高G°〈0.001 )，Veh_24h组IOD值与阳性细胞面积上升最多(7X0.001)，Veh-12h组与Veh_24h组阳性细胞数无差别G°>0.05)，阳性面积Veh_24h组增大O°〈0.001)。在脑缺血6、12、2处模型中，13-101) 80mg/kg组损伤脑星形胶质细胞的AQP4蛋白阳性细胞数、阳性面积、IOD值均下降G°〈0.001,^0.01)，以脑缺血6h疗效最佳。提示13-MTD80mg/kg可通过下调脑缺血6、12、24h时损伤侧脑组织星形胶质细胞AQP4蛋白表达，改善不同时限脑缺血导致的脑水肿。(见表1，图9，10，11)。表I为13-MTD 80 mg/kg对大鼠MCAO 6、12、24h后损伤脑AQP4蛋白表达阳性细胞数的比较U ±5., n=5)。
权利要求
1.一种13-甲基十四烷酸在制备治疗局灶性脑缺血的药物中的应用，所述的13-甲基十四烷酸是一种末端支 链饱和脂肪酸。
全文摘要
本发明公开一种13-甲基十四烷酸在制备治疗局灶性脑缺血的药物中的应用。所述的13-MTD不同剂量在脑缺血各时段均有明显的药效作用，即减轻神经功能缺失症状，缩小脑梗死灶，通过下调脑组织AQP4蛋白表达减轻脑水肿，通过上调脑组织ZO-1蛋白表达保护血脑屏障(BBB)。13-MTD可能是治疗缺血性脑血管疾病很有前途的一种先导化合物。其治疗脑缺血的优势在于13-MTD可化学合成，分子量小，脂溶性强，对BBB穿透率高，与脑组织脂质结构亲和力好，可快速高效作用于靶组织。13-MTD作为细胞膜成分能嵌入膜脂质结构中，有膜稳定作用。而脑富含脂质，脑缺血使膜磷脂降解造成脑细胞严重损伤，13-MTD可发挥良好的膜保护作用。且不良反应小，安全范围较大，可静脉给药，尤其对危重病程的脑缺血的治疗应具有更好的临床适用性。
文档编号A61P9/10GK103099801SQ201210411848
公开日2013年5月15日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者余涓 申请人:福建医科大学