预防和治疗猪的继发感染的呼吸系统疾病的抗原组合物及其制备方法和应用的制作方法

预防和治疗猪的继发感染的呼吸系统疾病的抗原组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了预防和治疗猪的继发感染的呼吸系统疾病的抗原组合物，其中，该抗原组合物包含至少一种免疫量的猪繁殖与呼吸综合征抗原和至少一种免疫量的副猪嗜血杆菌抗原以及佐剂，该猪繁殖与呼吸综合征抗原和副猪嗜血杆菌抗原各自独立地包括减毒活全抗原、灭活的全抗原、亚单位抗原、重组活载体抗原和DNA载体的抗原；该抗原组合物不仅不会产生两种抗原成份的相互免疫干扰或影响，而且猪繁殖与呼吸综合征和副猪嗜血杆菌抗原有相互增强免疫效果的作用，且该抗原组合物接种程序简便，安全性好。
【专利说明】预防和治疗猪的继发感染的呼吸系统疾病的抗原组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种预防和治疗副猪嗜血杆菌病与猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物及其制备方法，属于兽用疫苗领域。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductive and RespiratorySyndrome,PRRS)，又称猪蓝耳病，是由单股正链RNA猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒引起，以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征，现已经成为规模化猪场的主要疫病之一。2006年我国部分地区爆发的高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸障碍综合征(俗称蓝耳病)病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病，属于国家二类动物疫病。该病在我国出现新的流行特点，病毒发生变异，致病力增强，在部分地区出现大规模爆发流行。临床以高热、皮肤发绀、眼结膜炎、呼吸系统症状、神经症状及死亡为主，解剖后可见肺脏呈间质性肺炎，淋巴结肿大并伴有出血充血，表现为发病快、症状严重、病变明显，死亡率高，短时间内母猪大量流产，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。直至今日，疫病形势依然严峻，同其他病毒性疾病一样，目前尚无有效的治疗性药物用于繁殖与呼吸综合征的治疗，疫苗免疫接种是防制该病的最有效方法。
[0003]副猪嗜血杆菌病是副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, Hps)引起的猪的多发性浆膜炎和关节炎，该病又称为猪革拉泽氏病(Glasser’ sDisease) 0副猪嗜血杆菌可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5~8周龄的猪，发病率可达40%，死亡率可达50%。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；剖检可见纤维素性胸膜炎、心包炎、关节炎和脑膜炎，也可见腹腔器官表面出现纤维素性渗出物，导致肠道之间粘连等。此外，副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。在大量分离副猪嗜血杆菌的基础上，发现该菌的血清型复杂多样，按`Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型；根据我国血清流行病学调查和分离菌株的鉴定，以4、5型最为流行。近年来，由于我国目前饲养技术的调整进行不当，以及突发新的呼吸道综合征，使得该病日趋流行，危害日渐严重。
[0004]根据近几年猪场流行病学研究结果显示，呼吸系统疾病越来越多，临床上表现为呼吸道症状，主要特征是发热、生长迟缓、食欲降低、呼吸困难，死亡猪四肢、耳朵发紫；母猪流产前体温升高，厌食，尤其第一胎的母猪更为常见。死亡猪剖检呈现心包炎、胸膜炎、腹膜炎和关节炎，肺部炎症，淋巴结出血、肿大。从发病猪中分离出最常见的病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒和副猪嗜血杆菌，然而，本发明人在一项重现表现上述症状的呼吸系统疾病时发现，当猪群中只感染副猪嗜血杆菌，并不会引发疾病，只有当猪群中存在繁殖与呼吸综合征的情况下，才会引发上述症状的呼吸系统疾病。表明这些症状的病猪是由这两种病原体协同作用引起，并且，一旦继发感染副猪嗜血杆菌引发疾病，各种抗菌药物均难以奏效。
[0005]近年来，人们发现猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪易继发感染其他病原，特别是侵害呼吸系统的病原体，临床上最常见的是多杀性巴氏杆菌、肺炎支原体、链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、波氏杆菌和沙门氏菌等，造成猪群高发病率与高死亡率。杨汉春(“猪免疫抑制性疾病的流行特点与控制对策”，中国畜牧兽医，2004，31 (5):41-43)、万遂如(“防控猪免疫抑制的主要技术措施”，养猪，2009，1:42-46)等研究发现蓝耳病病毒在猪体内的持续性感染还可导致猪瘟疫苗的体液免疫受到明显的抑制，影响猪瘟弱毒疫苗的免疫效果，因此认为猪繁殖与呼吸综合征是一种免疫抑制性疾病。
[0006]目前市场没有出现副猪嗜血杆菌病和蓝耳病的组合疫苗，以及二者的同时联合使用，这是因为存在副猪嗜血杆菌灭活疫苗会对蓝耳病活疫苗免疫效果产生影响，可能的原因有:一是灭活疫苗使用的油性佐剂粘度太大不能作为稀释剂稀释活疫苗；二是灭活疫苗部分所含的有毒成分:灭活剂如甲醛；防腐剂如硫柳汞、叠氮钠；毒素如大量内毒素、培养过程代谢物及杂蛋白等对活疫苗毒价影响显著而使活疫苗效力下降。而且市售商品疫苗需多次免疫，成本较高，对猪只的应激较大。

【发明内容】

[0007]本发明所要解决的问题为提供一种能够预防和治疗猪的继发感染的呼吸系统疾病的抗原组合物，所述抗原组合物包括至少一种免疫量的猪繁殖与呼吸综合征抗原和至少一种免疫量的副猪嗜血杆菌抗原，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原和副猪嗜血杆菌抗原各自独立地包含减毒活全抗原、灭活的全抗原、亚单位抗原、重组活载体抗原和DNA载体的抗原。所述呼吸系统疾病主要特征是发热、生长迟缓、食欲降低、呼吸困难，死亡猪四肢、耳朵发紫。死亡猪剖检呈现心包炎、胸膜炎、腹膜炎和关节炎。应该理解，对于给定组合，不一定使用相同形式。 此外，正如人们所已知的，抗原制品可包含兽医学上可接受的载体或赋形剂，并可选择包含兽医学上可接受的佐剂。
[0008]本发明所要解决的另一个问题为提供一种能同时预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征和副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物，在给猪接种猪繁殖与呼吸综合征疫苗，并联合接种副猪嗜血杆菌疫苗。可以理解为给猪同时接种猪繁殖与呼吸综合征疫苗和副猪嗜血杆菌疫苗。以解决在预防这两种疾病时所面临的上述问题，且在此过程中意外的发现，同时接种用副猪嗜血杆菌灭活疫苗稀释的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，没有影响抗副猪嗜血杆菌抗体的产生，抗原之间没有出现相互干扰。联合使用后，可以减轻猪繁殖与呼吸综合征强病毒攻击时的临床症状，而且副猪嗜血杆菌病灭活疫苗抗原含量减半也能达到单独使用时的免疫效果。
[0009]本发明的主题还涉及抵抗一种猪的继发感染的呼吸系统疾病的免疫原性组合物或疫苗，其包含处于兽医学上可接受的载体或赋形剂之中的有效量的上述猪繁殖与呼吸综合征抗原+副猪嗜血杆菌抗原制品，并可选择包含兽医学上可接受的佐剂。免疫原性组合物引起免疫应答。因此，术语“免疫原性组合物”包括“疫苗组合物”。
[0010]本发明主题还涉及包装上分开的抵抗猪繁殖与呼吸综合征的抗原制品或免疫原性组合物或疫苗和抵抗副猪嗜血杆菌的抗原制品或免疫原性组合物或疫苗的免疫或疫苗接种试剂盒。所述试剂盒可具有上述定义抗原制品、免疫原性组合物和疫苗的各种特征。[0011]本发明主题还有抵抗一种猪的继发感染的呼吸系统疾病的免疫或疫苗接种方法，包括施用抵抗猪繁殖与呼吸综合征的免疫原性组合物或疫苗和抵抗副猪嗜血杆菌的免疫原性组合物或疫苗，或施用在同一制剂中包含一种对两种病原均特异的抗原制品的二联免疫原性组合物或疫苗。具体地，所述免疫或接种方法使用上述疫苗。
[0012]本发明的主题还在于抵抗特别是以上定义的抵抗副猪嗜血杆菌的抗原制品或免疫原性组合物或疫苗，联合抵抗猪繁殖与呼吸综合征的抗原制品或免疫原性组合物或疫苗，在制备用于抵抗一种猪的继发感染的呼吸系统疾病的药物组合物中的应用。
[0013]在联合免疫或疫苗接种计划中，抵抗猪繁殖与呼吸综合征和副猪嗜血杆菌的免疫或疫苗接种也可联合抵抗其它猪病原体特别是可能与继发感染的呼吸系统疾病有关的病原体的免疫或疫苗接种。因此，根据本发明的免疫原性组合物或疫苗可包含与其它猪病原体相应的其他效价，这些猪病原体选自猪肺炎支原体、和/或猪鼻支原体、和/或猪传染性胸膜肺炎、和/或猪萎缩性鼻炎、和/或猪流感病毒、和/或伪狂犬病毒、和/或猪圆环病毒、和/或猪霍乱及其组合。因此，可使用任何形式的免疫原性组合物或疫苗，特别是任何可获得的商业疫苗，以便其与本文所述的抵抗猪繁殖与呼吸综合征和副猪嗜血杆菌的免疫原性组合物或疫苗联合使用。
[0014]因此，本发明主题还在于多价免疫原性组合物和疫苗、多疫苗试剂盒、以及使得可采用这种联合免疫或疫苗接种计划的联合免疫或疫苗接种方法。
[0015]技术方案
[0016]本发明提供了预防和治疗一种猪的继发感染的呼吸系统疾病的抗原组合物，其中，所述抗原组合物包含至少一种免疫量的猪繁殖与呼吸综合征抗原和至少一种免疫量的副猪嗜血杆菌抗原以及佐剂，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原和副猪嗜血杆菌抗原各自独立地包括减毒活全抗原、灭活的全抗原、亚单位抗原、重组活载体抗原和DNA载体的抗原。
[0017]所述“猪繁殖与呼吸综合征抗原”是指含有至少一种抗原的任何组合物，所述抗原当对猪给药时，可诱导、刺激或增强抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的免疫应答。优选地，本发明所述疫苗组合物中，猪繁殖与呼吸综合征抗原为全病毒抗原，包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，含有，优选为灭活形式的猪繁殖与呼吸综合征全病毒，改良的猪繁殖与呼吸综合征活病毒或减毒的猪繁殖与呼吸综合征病毒，含有至少猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽、亚单位或其他成分，猪繁殖与呼吸综合征抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原:如勃林格殷格翰动物保健(美国)有限公司生产的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(Ingelvac_?prrs mlv)冲牧实业股份有限公司成都药械厂、齐鲁动物保健品有限公司等多家公司生产的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXA1株)和哈尔滨维科生物技术开发公司生产的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗灭活疫苗(CH-1a株)；哈尔滨维科生物技术开发公司生产的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(CH-1R株)；广东大华农动物保健品股份有限公司等生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)；江苏南农高科技股份有限公司等生产的猪繁殖与呼吸综合症活疫苗(R98);哈药集团生物疫苗有限公司等生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)；新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(TJM-F92株)。
[0018]优选地，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原为NVDC-JXAl-R减毒全病毒疫苗，所述副猪嗜血杆菌抗原为血清型4型JS株和血清5型ZJ株的灭活全菌疫苗，所述副猪嗜血杆菌血清4型JS株保藏号为CCTCCN0.M2011172,所述副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株保藏号为CCTCCN0.M2011173。
[0019]更优选地，本发明所述疫苗组合物中，所述猪繁殖与呼吸综合征全病毒抗原为每头份病毒含量IO4 5TCID5tl~IO7 tlTCID5ci;更优地，所述全病毒抗原为每头份病毒含量IO4-8TCID50~106_ 5TCID5tl ;再优选地，所述全病毒抗原为每头份病毒含量105_°TCID5(I。
[0020]所述“副猪嗜血杆菌抗原”是指包含至少一种抗原的任何组合物，所述副猪嗜血杆菌抗原在对猪给药后可诱导、刺激或增强抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答。优选地，所述副猪嗜血杆菌抗原是完整的副猪嗜血杆菌全菌，包括本领域技术人员熟知的临床分离的野菌株，含有，优选为灭活形式的副猪嗜血杆菌全菌，改良的副猪嗜血杆菌活菌或减毒的副猪嗜血杆菌，含有至少副猪嗜血杆菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合菌株，任何其它含至少副猪嗜血杆菌的免疫原性氨基酸序列的多肽、亚单位或其他成分，副猪嗜血杆菌抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原:如勃林格殷格翰动物保健(美国)有限公司生产的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(Z-1517株)，西班牙海博莱生物大药厂生产的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(血清I型SVl +血清6型SV6)，华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司、中牧实业股份有限公司生产的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(血清4型MD0322 +血清5型SH0165)，山东省农业科学院畜牧兽医研究所的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(血清I型LC株+血清5型LZ 株)。
[0021]更优选地，所述血清4型副猪嗜血杆菌全病毒抗原含量为灭活前5X IO8CFU/头份~8X IO9CFU/头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌全病毒抗原含量为灭活前为4X IO9CFU/头份，再优选所述血清4型副猪嗜血杆菌全病毒抗原含量为灭活前2 X IO9CFU/头份。
[0022]所述血清5型副猪嗜血杆菌全病毒抗原含量为灭活前5X108CFU/头份~8 X IO9CFU/头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌全病毒抗原含量为灭活前4 X IO9CFU/头份，再优选所述血清5型副猪嗜血杆菌全病毒抗原含量为灭活前2 X IO9CFU/头份。
[0023]优选地，所述佐剂包括纳米化氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、MONTANIDE GEL ST、蜂胶、细胞因子、脂质体、免疫刺激复合物、含CpC脱氧寡核苷酸、纳米化ISA206、ISA760VG、纳米化磷酸铝、皂苷、山梨聚糖、植物油、油酸乙酯、二 (辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的的一种或几种组合物。
[0024]优选地，所述佐剂为水性佐剂，术语水性佐剂是不含油或含油量为5%(w/v)的佐剂的统称。例如卡波姆水溶液、SEPPIC公司生产的MONTANIDE GEL ST水性佐剂、纳米化氢氧化铝胶。更优选地， 所述佐剂为水性佐剂，所述水性佐剂包括卡波姆水溶液、206佐剂、纳米化氢氧化招胶佐剂、Montanide IMS1313 VG、Montanide ISA15A VG、Montanide GEL 01PR以及Montanide GEL ST聚合物佐剂。
[0025]本发明还提供了一株血清4型副猪嗜血杆菌JS株，保藏号为CCTCCN0.M2011 172 ；和一株血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株，保藏号为CCTCCN0.M2011173。
[0026]本发明的优选方式涉及疫苗组合物的耐热冻干保护剂，优选为明胶、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、谷氨酸钠、牛血清白蛋白、山梨醇、羧甲基纤维素钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乳糖、脱脂牛奶的一种或几种组合物。
[0027]优选地，所述NVDC-JXAl-R减毒全病毒疫苗还包括耐热冻干保护剂，所述耐热冻干保护剂包括1%~2%明胶、5%~10%海藻糖、1%~2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.5%~2%谷氨酸钠、0.1%~2%牛血清白蛋白、0.1%~1%山梨醇、0.1%~0.2%羧甲基纤维素钠、
0.164%磷酸二氢钾以及0.052%磷酸氢二钠,其余为水。
[0028]作为本发明猪繁殖与呼吸综合征活疫苗-副猪嗜血杆菌病灭活疫苗组合物的优选实施方案，所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗部分，菌液制备用培养基为本实验室优选的副猪嗜血杆菌培养基(MHPs):多聚蛋白胨(5~10g/L)、酵母抽提物(3~10g/L)、谷氨酸钠(2~8g/L)、水解乳蛋白(I~5g/L)、氯化钠(I~6g/L)、磷酸氢二钾(I~5g/L)、葡萄糖(0.1~4g/L)，用NaOH调pH值至6.8~8.0，116~121°C灭菌10~40min，再加入猪血清(5~100ml/L)、l%的NADH (I~50ml/L)，制备固体培养基时在灭菌前加入琼脂粉(I~20g/U。抗原配比为1:1 (血清4型JS株:副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株)，抗原总体积为所述疫苗总体积的75%~90%，疫苗中含量为灭活前副猪嗜血杆菌血清4型和5型活菌数均为5.0XlO8CFU / 头份~8.0XlO9CFU / 头份。
[0029]作为本发明猪繁殖与呼吸综合征活疫苗-副猪嗜血杆菌病灭活疫苗组合物的优选实施方案，所述猪繁殖与呼吸综合征活疫苗部分，PRRS弱毒是国内流行的毒株经过化学的或者其他方法致弱的且证明不返强的CH-1R株、JXAl-R株、R98株、HuM-Fl 12株或者TJM-F92株，加入耐热冻干保护剂为1%~2%明胶、5%~10%海藻糖、1%~2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.5%~2%谷氨酸钠、0.1%~2%牛血清白蛋白、0.1%~1%山梨醇、0.1%~0.2%羧甲基纤维素钠、0.164%磷酸二氢钾、0.052%磷酸氢二钠，冻干后即为成品(每头份病毒含量 104.5TCID5tl ~107.ciTCID50)。
[0030]本发明提供了一种制备预防和治疗猪的继发感染的呼吸系统疾病的抗原组合物的方法，所述方法包括制备猪繁殖与`呼吸综合征活疫苗的步骤和制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗的步骤:
[0031]所述制备猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的步骤包括增殖所述猪繁殖与呼吸综合征病毒，与耐热冻干保护剂混合制备，冻干得猪繁殖与呼吸综合征活疫苗；
[0032]所述制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗的步骤包括增殖所述副猪嗜血杆菌，灭活，与佐剂混合配制。
[0033]副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的制备包括如下步骤:⑴分别将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株菌种繁殖培养，得到副猪嗜血杆菌4型JS株菌液、5型ZJ株菌液分别将步骤⑴培养得到的副猪嗜血杆菌4型JS株菌液、5型ZJ株菌液按各自总量加入0.3%的甲醛溶液，放置37°C灭活24h，期间搅拌3~5次，根据计数结果超滤菌液；⑶将上述已灭活、超滤的副猪嗜血杆菌4型JS株菌液1:1比例混合，然后和佐剂进行乳化，佐剂含量为10%~25% ;成品副猪嗜血杆菌病灭活疫苗抗原含量为灭活前副猪嗜血杆菌血清4型和5型活菌数均为5.0X IO8CFU /头份~8.0X IO9CFU /头份。⑷以适量体积分装新型副猪嗜血杆菌病灭活疫苗。猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法包括如下步骤:⑴潮汐式微载体悬浮培养生物反应器中，加入1.0X IO9~2.0X 109cells/g微载体的Marc-145细胞或其克隆细胞株传代细胞及细胞生长液，培养传代细胞，运行程序:载体上下运行频率为O~lOmm/s，载体在载体瓶中上下端点停留时间为O~2min。⑵传代细胞培养至1.5X 101(lcellS/L~2.0父101(1(^118/1时换用细胞维持液，按照感染复数为1 0.1.=0.0001~1.0接种猪繁殖与呼吸综合征病毒，培养猪繁殖与呼吸综合征病毒；(3)收获猪繁殖与呼吸综合征病毒液加入耐热冻干保护剂进行冻干，制得猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。
[0034]作为本发明猪繁殖与呼吸综合征活疫苗-副猪嗜血杆菌病灭活疫苗组合物的优选实施方案，所述组合物要进行相容性检验，各取2瓶活疫苗部分，分别用副猪嗜血杆菌病灭活疫苗部分(待检稀释液)和参考稀释液(无菌注射用水)，按照使用说明(活疫苗部分I头份/瓶，灭活疫苗部分I头份(2ml)/瓶)复原。20±3°C放置2h，依照猪繁殖与呼吸综合征活疫苗滴定方法检验。通过与参考稀释液的比较，评估待检稀释液对病毒活性组分的影响，病毒组分的滴定结果的差值应不超过0.71ogl0。
[0035]本发明还提供了一种所述抗原组合物在制备预防和治疗猪的继发感染的呼吸系统疾病药物中应用。
[0036]优选地，所述应用包括在应用前用所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗复原所述猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。
[0037]本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括在包装上分开的抵抗猪繁殖与呼吸综合征的抗原制品或免疫原性组合物或疫苗和抵抗副猪嗜血杆菌的抗原制品或免疫原性组合物或疫苗。
[0038]技术效果
[0039]本发明采用了副猪嗜血杆菌血清4型、5型和猪繁殖与呼吸综合征毒株，发明人意外地发现不仅几株毒株的免疫效果良好，而且相互之间不影响，能够有效预防预防由副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病和猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪蓝耳病及其二者的混合感染；本发明灭活疫苗部分采用了水溶性聚合物类佐剂和适宜的配苗技术制备了副猪嗜血杆菌病灭活疫苗，用其作为稀释剂可以稀释猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，二者作为组合物联合使用安全、质量可控，免疫效果良好，攻毒保护率达到80%~100%。
[0040]本发明至少具有以下优点:
[0041]I)解决了现有技术困难，改变了人们对猪繁殖与呼吸综合征病毒和副猪嗜血杆菌同时感染时的认识偏见，首次将猪繁殖与呼吸综合征抗原和副猪嗜血杆菌抗原按照合适的比例联合使用，尤其是，首次将副猪嗜血杆菌灭活抗原用作稀释猪繁殖与呼吸综合征活抗原这种疫苗组合方式来使用，而在本发明之前，一直没有人认为两种病可以同时进行预防进而这两种疫苗可以联合使用。
[0042]11本发明的猪繁殖与呼吸综合征和副猪嗜血杆菌抗原组合物及使用所述抗原组合物制备的预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征和副猪嗜血杆菌感染的二联疫苗，不仅不会产生两种抗原成份的相互免疫干扰或影响，而且意外发现猪繁殖与呼吸综合征和副猪嗜血杆菌的抗原混合后，猪繁殖与呼吸综合征和副猪嗜血杆菌的抗原组合物不仅能产生的保护性免疫应答的同时，还意外发现猪繁殖与呼吸综合征和副猪嗜血杆菌抗原有相互增强免疫效果的作用，而且如本发明后`续实施例所证明的，特别是存在其中一种抗原的情况下，另一种抗原量减半仍能维持本抗原的免疫效果，而这出乎本领域普通技术人员预料的。
[0043]本发明的猪繁殖与呼吸综合征和副猪嗜血杆菌抗原组合物及使用所述组合物制备的预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征和副猪嗜血杆菌感染的二联疫苗，与猪繁殖与呼吸综合征或副猪嗜血杆菌的单疫苗的效力相比，在对猪注射免疫过程中，猪体无副反应，注射部位不会发生红肿、化脓等炎症反应，因此，本发明的二联疫苗安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应。
[0044]4)含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的特点。与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫。
[0045]5)本发明预防和治疗猪肺炎支原体相关疾病和猪链球菌相关疾病的二联疫苗，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的多次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，本发明仅免疫I次就能够预防猪肺炎支原体和猪链球菌两种病原感染，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可
O
[0046]6)此外，本 申请人:在一项重现主要特征是传播迅速、体温升高、食欲降低、呼吸困难，死亡猪四肢、耳朵发紫，剖检可见间质性肺炎、心包积液、腹膜器官表面大量纤维性渗出物、肠管和腹腔壁粘连、关节肿大并有积液和淋巴结肿大的呼吸系统疾病时发现，当猪群中只感染副猪嗜血杆菌，并不会出现以上大量特征性临床症状及病变，只有当猪群中存在繁殖与呼吸综合征的情况下，才会引发上述症状的呼吸系统疾病。意外发现这些症状的病猪是由这两种病原体协同作用引起，并且，一旦继发感染副猪嗜血杆菌引发混合感染，各种抗菌药物均难以奏效，发病迅速、死亡率高。本发明猪繁殖与呼吸综合征和副猪嗜血杆菌抗原组合物对所述呼吸系统疾病有良好的预防了控制作用。
[0047]菌株保藏说明:
[0048]副猪嗜血杆菌病血清4型JS株
[0049]分类命名:副猪嗜血杆菌血清4型JS株(Haemophilus parasuisSerotype
4,strain JS),`
[0050]保藏号为:CCTCCΝ0:Μ 2011172;
[0051]保藏日期:2011年5月18日，
[0052]保藏地址:中国武汉,武汉大学，中国典型培养物保藏中心
[0053]保藏单位:中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。
[0054]副猪嗜血杆菌病血清5型ZJ株:
[0055]分类命名:副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株(Haemophilus parasuisSerotype
5,strainZJ),
[0056]保藏号为:CCTCCΝ0:Μ 2011173;
[0057]保藏日期:2011年5月18日，
[0058]保藏地址:中国武汉,武汉大学，中国典型培养物保藏中心
[0059]保藏单位:中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。
【专利附图】

【附图说明】
[0060]图1为潮汐式微载体悬浮生物反应器示意图；
[0061]图2为副猪嗜血杆菌疫苗内毒素含量测定结果。
[0062]附图标记[0063]进料桶1、收料桶2、自动馈料仪3、pH/DO监控器4、恒温振荡箱5、培养液袋6、电脑控制器7、载体罐8、载体9、恒温培养舱10、进/取样管11。
【具体实施方式】
[0064]本发明实施例中采用的潮汐式生物反应器结构如图1所示。
[0065]载体罐8放置于恒温培养舱10中，恒温培养舱10为载体罐8提供一个恒温的环境。载体罐8是细胞培养与病毒增殖的场所，细胞贴附生长在载体罐8内部的载体9上，当培养液袋6内的培养液泵入载体罐8时，载体罐8内的培养液液面上升并淹没细胞，向细胞供给养分，并将细胞的新陈代谢产物从细胞上去除。当载体罐8内的培养液泵入培养液袋6时，载体罐8中的培养液液面随之下降，细胞露出，进行通风供氧。间歇淹没与暴露载体床的培养方式使载体9上的细胞能够得到足够的营养和氧气，同时产生的代谢废物能够有效地被排出去。
[0066]载体罐8的盖子上装有数根管道，这些管道的作用包括:人工手动方式向载体罐8内注入液体(如接种细胞悬液等)或排出载体罐8内的液体；由电脑控制器7控制向载体罐8注入气体，气体通常是压缩空气、氧气及CO2三种的混合物，三种气体在混合物中的比例可以自动调节控制，以适应细胞培养需要。电脑控制器7可自动控制混合气体向载体罐8内的注入与排出，并为潮汐提供动力。培养液袋6用以盛装培养液，并通过两条管道与载体罐8底部相通，两条管道分别为液体灌流通道，通过与载体罐8之间的液体流动，从而完成潮汐过程。培养液在潮汐过程中的灌流速度可通过电脑控制器7进行调整。培养液的换液量是指在一次潮汐过程中，泵入或泵出载体罐8的液体量，换液量的大小决定了载体罐8内液面顶部和底部所处的位置。在培养液袋6与载体罐8之间相连通的管道上设有进/取样管11，可使用无菌注射器通过进/取样管11对培养液进行取样，用以检测其中的葡萄糖含量及病毒含量等指标 。葡萄糖的添加:若葡萄糖低于规定标准，则根据葡萄糖测定仪测定培养液中剩余葡萄糖的含量，及培养液的总体积计算出需补加的葡萄糖量，利用无菌注射器抽取配制的葡萄糖溶液从进/取样管11中注射到载体罐8与培养液袋6之间的导管中，葡萄糖溶液随着载体罐的换液得以从导管进入培养液袋6并做进一步混匀。恒温振荡箱5通过加热与振荡，来维持培养液袋6内培养液温度的恒定及成分的匀质性。pH/DO监控器4可以监测培养液袋内培养液的酸碱度(pH值)及溶氧(D0)，并通过注入碱性溶液(NaOH或NaHCO3溶液)将培养液的PH值控制在合适范围内。收料桶2及进料桶I均通过自动馈料仪3与培养液袋6相连，培养液袋6内的培养液需要进行收获时，可通过自动馈料仪3进入收料桶2，而进料桶I内的培养液则可以通过自动馈料仪3对培养液袋6进行补充。
[0067]本发明的方法对于所用的设备、装置或仪器没有特殊要求，其他各种类型的生物反应器也可以使用本发明的方法完成。
[0068]本发明的具体实验方法可参见《中华人民共和国兽药典(二〇一〇年版)》及附录。其他未注明的试剂或原料均可由本领域技术人员根据现有技术获得。
[0069]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1潮汐式微载体悬浮生物反应器大规模生产猪繁殖与呼吸综合征病毒及疫苗制备
[0070]本实施例中所用的微载体为聚酯纤维，用于制备繁殖与呼吸综合征病毒抗原的病毒株为NVDC-JXAl-R毒株(该毒株公开于中国专利CN101307305A，以保藏号N0.1964保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心)，以对繁殖与呼吸综合征病毒具有良好敏感性的细胞系非洲绿猴肾细胞(Marc-145细胞)，作为制苗用细胞系，选用20L载体瓶潮汐式生物反应器。
[0071]I).细胞的接种与培养
[0072]先使用细胞生长液(含5%牛血清MEM培养基，pH值为7.25)利用转瓶扩增培养Marc-145细胞。20L生物反应器中，加入无菌载体1300g，把转瓶内的细胞消化分散后以细胞密度为1.0X 109Cells/L接入20L生物反应器中，使之与载体结合，生物反应器与装有生长液的37°C恒温振荡箱5 (容量500L)连接，培养条件为吸附程序:培养液的液面上升速度5mm / s,下降速度3mm / s,液面在反应器上下端点停滞时间为60s/10s。培养温度37.0°C, pH值调节7.3，溶氧调节65%，二氧化碳浓度调节10%。
[0073]自运行吸附程序计时，3h后启动培养程序:培养液的液面升降速度均为4mm/ s,液面在反应器上下端点停滞时间为50s/50 S。灌注培养5天，培养温度37.(TC，采用7.5%(W / V) NaHCO3自动调节pH值，使pH值控制在7.2左右，溶氧为50%，二氧化碳浓度为5%。细胞接种后按每24h的时间点取载体样和培养基样，控制培养液中葡萄糖浓度1000~4500mg / L0
[0074]2)病毒的接种与培养在20L潮汐式悬浮培养生物反应器中，细胞培养至第5天，Marc-145细胞在生物反应器内的密度达3.5 X IOltl个/L，把培养液袋6中的培养液换成维持液含有1%牛血清的标准MEM培养基)，按M.0.1.为0.001接种繁殖与呼吸综合征病毒。运行接毒程序:培养液的液面上升速度4mm/s，下降速度2mm/s，液面在反应器顶部停留55s，底部停留10s，病毒吸附3h。之`后，运行病毒培养程序:维持液的液面上升与下降速度均为4mm/s，液面在反应器顶部停留50s，底部停留50s。培养温度37.5°C ;采用7.5% (ff/V) NaHCO3自动调节pH，使pH值维持在7.2 ;溶氧为30%，二氧化碳浓度为3%。
[0075]4)病毒的收获培养至接毒后第3天即收获病毒液，先对载体瓶8运行病毒液排出程序，使之全部流入培养液袋6中，对培养液袋6中的病毒液，采用50L的自动收料桶2按照5L/min的流速进行收集，一 20°C保存。收获病毒液500L，病毒滴度保持在109 5TCID50/ml以上。
[0076]Marc-145细胞在利用其他体积的潮汐式生物反应器时，细胞培养和病毒增殖情况基本相同，收获病毒也的滴度也无明显差异。
[0077]5)制苗毒液的检验:按照高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXAl-R株)检验规程进行。
[0078]6)配苗、分装及冻干:将检验合格的病毒液，混合于同一容器中，按1:1 (v/v)加入1%~2%明胶、5%~10%海藻糖、1%~2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.5%~2%谷氨酸钠、0.1%~2%牛血清白蛋白、0.1%~1%山梨醇、0.1%~2%羧甲基纤维素钠、0.164%磷酸二氢钾、0.052%磷酸氢二钠和水组成的耐热冻干保护剂组分及配方(见表1，按百分比表示)，充分混匀，定量分装；分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品(每头份病毒含量105°TCID5。)。[0079]表1耐热冻干保护剂组分及配方
[0080]
【权利要求】
1.预防和治疗猪的继发感染的呼吸系统疾病的抗原组合物，其中，所述抗原组合物包含至少一种免疫量的猪繁殖与呼吸综合征抗原和至少一种免疫量的副猪嗜血杆菌抗原以及佐剂，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原和副猪嗜血杆菌抗原各自独立地包括减毒活全抗原、灭活的全抗原、亚单位抗原、重组活载体抗原和DNA载体的抗原。
2.根据权利要求1所述的抗原组合物，其中，所述猪繁殖与呼吸综合征抗原为NVDC-JXAl-R减毒全病毒疫苗，所述副猪嗜血杆菌抗原为血清型4型JS株和血清5型ZJ株的灭活全菌疫苗，所述副猪嗜血杆菌血清4型JS株保藏号为CCTCC N0.M2011172，所述副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株保藏号为CCTCC N0.M2011173。
3.根据权利要求1或2所述的抗原组合物，其中，所述猪繁殖与呼吸综合征全病毒抗原为每头份病毒含量IO4 5TCID5tl~IO7 tlTCID5ci ;更优地，所述全病毒抗原为每头份病毒含量IO4-8TCID50~106_ 5TCID5tl ;再优选地，所述全病毒抗原为每头份病毒含量105_°TCID5Q。
4.根据权利要求1或2所述的抗原组合物，其中，所述血清4型副猪嗜血杆菌全病毒抗原含量为灭活前5 X IO8CFU/头份~8 X IO9CFU/头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌全病毒抗原含量为灭活前为4 X IO9 CFU/头份，再优选所述血清4型副猪嗜血杆菌全病毒抗原含量为灭活前2 X IO9CFU/头份； 所述血清5型副猪嗜血杆菌全病毒抗原含量为灭活前5 X IO8CFU/头份~8 X IO9CFU/头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌全病毒抗原含量为灭活前4 X IO9CFU/头份，再优选所述血清5型副猪嗜血杆菌全病毒抗原含量为灭活前2 X IO9CFU/头份。
5.根据权利要求1-2任意一项所述的抗原组合物，其中，所述佐剂包括纳米化氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、MONTANIDE GEL ST、蜂胶、细胞因子、脂质体、免疫刺激复合物、含CpC脱氧寡核苷酸、纳米化ISA206、ISA760VG、纳米化磷酸铝、皂苷、山梨聚糖、植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种组合物；优选地，所述佐剂为水性佐剂，所述水性佐剂包括卡波姆水溶液、206佐剂、纳米化氢氧化铝胶佐剂、MontanideIMS1313 VG、Montanide ISA15A VG、Montanide GEL 01 PR 以及MontanideGEL ST聚合物佐剂。
6.根据权利要求2所述的抗原组合物，其中，所述NVDC-JXAl-R减毒全病毒疫苗还包括耐热冻干保护剂，所述耐热冻干保护剂包括1%~2%明胶、5%~10%海藻糖、1%~2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP )、0.5%~2%谷氨酸钠、0.1%~2%牛血清白蛋白、0.1%~1%山梨醇、0.1%~0.2%羧甲基纤维素钠、0.164%磷酸二氢钾以及0.052%磷酸氢二钠，其余为水。
7.制备预防和治疗一种猪的继发感染的呼吸系统疾病的抗原组合物的方法，所述方法包括制备猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的步骤和制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗的步骤: 所述制备猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的步骤包括增殖所述猪繁殖与呼吸综合征病毒，与耐热冻干保护剂混合制备，冻干得猪繁殖与呼吸综合征活疫苗； 所述制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗的步骤包括增殖所述副猪嗜血杆菌，灭活，与佐剂混合配制。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，所述增殖所述副猪嗜血杆菌使用MHPs副猪嗜血杆菌培养基，所述MHPs副猪嗜血杆菌培养基包括5~10g/L多聚蛋白胨、3~10g/L酵母抽提物、2~8g/L谷氨酸钠、I~5g/L水解乳蛋白、I~6g/L氯化钠、I~5g/L磷酸氢二钾、0.1~4g/L葡萄糖，pH值为6.8~8.0,116~121°C灭菌10~40min,再加入5~100ml/L猪血清、I~50ml/L NADH，制备固体培养基时在灭菌前加入I~20g/L琼脂粉。
9.根据权利要求1-2任意一项所述的抗原组合物在制备预防和治疗猪的继发感染的呼吸系统疾病药物中应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述应用包括在应用前用所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗复原所述猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。
11.一种试剂盒，所述试剂盒包括在包装上分开的抵抗猪繁殖与呼吸综合征的抗原制品或免疫原性组合物或疫 苗和抵抗副猪嗜血杆菌的抗原制品或免疫原性组合物或疫苗。
【文档编号】A61K39/12GK103784951SQ201210435109
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月1日 优先权日:2012年11月1日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司