专利名称：死亡受体5激动性多价抗体及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及死亡受体激动性抗体的制备，具体为死亡受体5激动性多价抗体的制备及其在抗肿瘤药物方面的应用。
背景技术：
肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand, TRAIL)是willy等于1995年发现的TNF超家族新成员。实验证实TRAIL对几乎所有系统恶性肿瘤的大部分细胞系均有杀伤作用，而对正常组织无杀伤作用(NatMed, 1999，5: 157-63)，因此以TRAIL受体为靶点的肿瘤治疗已成为研究的热点。 TRAIL的生物学效应主要是通过与细胞膜上的相应受体结合而产生的。目前在细胞膜已发现4种TRAIL受体二种为死亡受体DR4 (Death receptor-4), DR5(Death receptor-5), 二种受体为诱骗受体DcRl (Decoy receptor-1)、DcR2 (Decoyreceptor-2)。当TRAIL与死亡受体DR4与DR5结合后，DR4与DR5可以形成同源/异源三聚体，通过其含有的胞内死亡结构域(death domain, DD)传导凋亡信息至胞质内，激活caspase系统最终引起细胞凋亡。TRAIL与诱骗受体DcRl与DcR2结合后，可以形成异源三聚体。由于DcRl、DcR2缺乏有功能的胞内死亡结构域，形成的异源三聚体无法激活caspase系统，因此当诱骗受体过表达时，细胞对TRAIL诱导的凋亡产生耐受。肿瘤细胞通常主要表达死亡受体，低表达诱骗受体。然而有些肿瘤细胞却可以高表达诱骗受体，对TRAIL诱导的凋亡产生耐受[Science, 1997，277: 818 - 821; CellSignal, 2004, 16:139-44]。为此有些研究小组研发出单死亡受体激动性抗体,这些抗体与DR4或DR5特异性结合后，模拟TRAIL的作用，诱导肿瘤细胞凋亡。由于激动性抗体只与死亡受体特异性结合，而不与诱骗受体结合，因此对于那些高表达诱骗受体、躲避TRAIL杀伤作用的肿瘤细胞仍然有效[Oncogene. 2008, 27: 6207-15; Curr OpinPharmacol, 2008, 8: 433 - 439]。
发明内容
本发明目的在于提供死亡受体5激动性多价抗体，尤其是死亡受体5激动性四价抗体在制备抗肿瘤药物方面的应用。死亡受体5多价抗体,针对死亡受体5的单链抗体通过寡聚化的结构域,形成多价抗体，该多价抗体可以诱导肿瘤细胞的凋亡，对正常细胞无毒性，其氨基酸序列为(详见SEQID NO. I)
DIVMTQSPSSLAVSAGERVTMSCKSSQSLLNSRTRKNCLAWYQQKPGQFPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQSFDLPTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAEPVKSGASVKLSCTASGFNIKDTFIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTVYLQFSSLTSEDAAVYYCSRGTTVYYFDHWGQGSTLTVSS。
所述的死亡受体5多价抗体，针对死亡受体5的单链抗体通过p53结构域连接，形成四价抗体，该四价抗体可以诱导肿瘤细胞的凋亡，对正常细胞无毒性，其氨基酸序列为(详见 SEQ ID NO. 2)
DIVMTQSPSSLAVSAGERVTMSCKSSQSLLNSRTRKNCLAWYQQKPGQFPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSG
SGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQSFDLPTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAEPVKSGA
SVKLSCTASGFNIKDTFIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTVYLQFSSLTSEDAAV
YYCSRGTTVYYFDHWGQGSTLTVSSTPLGDTTDTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPo所述的死亡受体5多价抗体，其氨基酸序列与SEQ ID NO. 2的同源性大于80%，且可以形成四价抗体，与死亡受体5结合，诱导肿瘤细胞的凋亡，对正常细胞无毒性。
所述的死亡受体5多价抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。在本发明中，采用基因工程等现代生物技术，利用TRAIL受体DR5免疫小鼠，采用噬菌体展示技术，获得一株单链抗体，利用P53结构域使其多聚化，形成多价抗体。现有的死亡受体激动性抗体大多为完整的抗体(如中国专利申请号200680009970. I ；200410070093. I ；200580018426. 9)，本发明多价抗体与现有的死亡受体激动性抗体不同，该多价抗体去除了抗体的恒定区，可以减轻免疫原性，可以采用酵母或大肠杆菌表达；该多价抗体可以在体外强烈诱导肿瘤细胞凋亡，对正常细胞无毒性。因此该抗体可以用于新型抗肿瘤药物的研发。本发明还涉及了一种抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体的四价抗体的制备方法，它主要包括以下步骤以DR5胞外区蛋白免疫小鼠，利用噬菌体展示技术，得到亲和抗体。利用P53蛋白结构域，将其构建为四价抗体。瞬时转染发现其中一种四价抗体具有使Jurket细胞凋亡的能力，更多体外实验表明该四价抗体可以杀死白血病细胞、食道癌细胞，对永生化细胞无作用。本发明与国内外类似专利相比，其可变区序列为未见报道的抗体序列，该序列多聚化后可以诱导肿瘤细胞凋亡。这些结果均为本领域技术人员所想象不到。
图I显示DR5在白血病细胞的表达情况；A Jurkat ；B K562 ；
图2显示DR5在人食管癌细胞、人食管上皮永生化细胞的表达情况；A: EC9706 ；Β:
NEC ；
图3 Westen blot鉴定四价抗体表达；43KD :四价抗体；34KD:单链抗体；
图4显示2. 5mg/L死亡受体5四价抗体作用于Jurket细胞20h作用结果；a为死亡受体5激动性四价抗体，b为对照单链抗体；
图5显示2. 5mg/L死亡受体5四价抗体作用于K562细胞20h作用结果；a为死亡受体5激动性四价抗体，b为对照单链抗体；
图6显示2. 5mg/L死亡受体四价抗体作用于肿瘤细胞EC9706 20h作用结果；a为死亡受体5激动性四价抗体，b为对照单链抗体；
图7显示2. 5mg/L死亡受体四价抗体作用于永生化细胞NEC 20h作用结果；a为死亡受体5激动性四价抗体，b为对照单链抗体；
图8显示不同浓度四价死亡受体激动性抗体作用于Jurket细胞的死亡率；图9显示不同浓度四价死亡受体激动性抗体作用于K562细胞的死亡率；
图10显示不同浓度四价死亡受体激动性抗体作用于EC9706细胞的死亡率；
图11显示不同浓度四价死亡受体激动性抗体作用于永生化细胞NEC的死亡率。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此。实施例I DR5单链抗体的制备
以DR5抗原(peproTech公司)100 μ I (100 μ g)与等体积弗氏完全佐剂乳化后，常规免疫。取小鼠脾脏，提取总RNA，逆转录合成cDNA。根据《重组抗体》(沈倍奋，科学出版社)方案，以cDNA为模板，扩增全套VH和VL基因，将扩增得到的重、轻链产物进行重叠延伸PCR扩增出ScFv片段。ScFv片段和载体PAK100经Sfi I酶切后，T4连接酶连接，电转化 入E. coli XLl-Blue感受态细胞，制备噬菌体抗体库。用DR5抗原包被96孔板(第I轮100 yg/ml,第 2 轮 30 yg/ml,第 3 轮 10 yg/ml,第 4 轮 I 4区/1111,第5轮0.5 μ g/ml),1%BSA封闭后每孔加50 μ I噬菌体库，37°C放置2 h，用TBST洗5遍(第2轮10遍，后几轮20遍)。将得到的噬菌粒送上海英骏生物公司测序。(I)轻链正向引物
LBl:gccatggcggactacaaagayatccagctgactcagccLB2 gccatggcggactacaaagayattgttctcwcccagtcLB3 gccatggcggactacaaagayattgtgmtmactcagtcLB4 gccatggcggactacaaagayattgtgytracacagtcLB5 gccatggcggactacaaagayattgtratgacmcagtcLB6 gccatggcggactacaaagayattmagatramccagtcLB7 gccatggcggactacaaagayattcagatgaydcagtcLB8 gccatggcggactacaaagayatycagatgacacagacLB9 gccatggcggactacaaagayattgttctcawccagtcLBlO gccatggcggactacaaagayattgwgctsacccaatcLBlI gccatggcggactacaaagayattstratgacccartcLB12 gccatggcggactacaaagayrttktgatgacccaracLB13 gccatggcggactacaaagayattgtgatgacbcagkcLB14 gccatggcggactacaaagayattgtgataacycaggaLB15 gccatggcggactacaaagayattgtgatgacccagwtLB16 gccatggcggactacaaagayattgtgatgacacaaccLB17 gccatggcggactacaaagayattttgctgactcagtcLB λ gccatggcggactacaaagatgctcttgtgactcaggaatc
(2)轻链反向引物
LFl ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgtttkatttccagcttggLF4 ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgttttatttccaactttgLF5 ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgtttcagctccagcttggLF λ ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacctaggacagtcagtttgg(3)重链正向引物
HBl ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgakgtrmagcttcaggagtcHB2 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtbcagctbcagcagtcHB3 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtgcagctgaagsartcHB4 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtccarctgcaacartcHB5 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtycagctbcagcartcHB6 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtycarctgcagcartcHB7 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtccaggtgaagcartcHB8 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtgaasstggtggartcHB9 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgavgtgawgstggtggagtcHBlO ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtgcagstggtggartcHBll ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgakgtgcamctggtggartcHB12 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtgaagctgatggartcHBI3 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtgcarcttgttgartcHB14 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgargtraagcttctccartcHBI5 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaagtgaarsttgaggartcHB16 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggttactctraaasartcHB17 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtccaactvcagcarccHB18 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgatgtgaacttggaasartcHB19 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtgaaggtcatcgartc
(4)重链反向引物
HFl ggaattcggcccccgaggccgaggaaacggtgaccgtggtHF2 ggaattcggcccccgaggccgaggagactgtgagaatggtHF3 ggaattcggcccccgaggccgcagagacagtgaccagagtHF4 ggaattcggcccccgaggccgaggagacggtgactgaggt
注Y=C，T ；ff=A, T ；B=C, G，T ；M=A, C ；R=A, G ；K=G, T ；S=G, C。以上引物序列左边为 5'
立而，右边为3'立而。实施例2四价抗体表达载体的构建
以DR5单链抗体基因为模板，以LI、H2为引物，PCR扩增得到ScFv，反应条件95°C3min,95°C 30 sec,60°C 40 sec,72°C 30 sec，30 个循环。以 P53a、P53b 为引物，PCR扩增得到P53片段，反应条件95°C 30 sec,60°C 40 sec,72°C 30 sec，30个循环。以上述产物为模板，以L1、P532为引物，重叠延伸PCR，反应条件95°C 3min，95°C 30 sec,60°C 40sec,72°C 30 sec，30个循环。取目的基因回收产物VL+VH2+P53，利用限制性内切酶Xho I和Hind III，作为片段双酶切体系。取空载体质粒pcDNA3. 1，利用限制性内切酶Xho I及Hind III，双酶切。切胶回收目的基因，T4连接酶连接，电转化入E. coli DH5a感受态细胞，筛选，挑取阳性克隆测序。LIGGCAAGCTTAGATATTGTGATGACACAGT ；
H2 GTTGTGTCACCAAGTGGGGTTGAGGAGACAGTGAGAGTGGA ；
P53a ACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATCCGGAAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCA·GATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCG ；
P53b TGGCTCCTTCCCAGCCTGGGCATCCTTGAGTTCCAAGGCCTCATTCAGCTCTCGGAACATCTCGAAGCGCTCACGCCCACGGATCT ；
P532 CGCCTCGAGTGGCTCCTTCCCAGCCT ；
实施例3激动性四价抗体的筛选
瞬时转染各克隆四价抗体质粒到C0S7细胞，48h后收获上清，westenblot证实四价抗体表达(结果见图3)。收集并制备Jurkat细胞悬液，加入24孔培养板，细胞终浓度为I X IO5/孔，置37°C，5%C02条件培养12 hr,加入C0S7细胞培养上清50 μ I ；阴性对照孔用RPMI1640培养液。于37°C和5%C02的条件下培养20 h，收集每孔所有细胞于相应的离心管中。PBS洗涤细胞后，每孔细胞分别悬浮于100 μ I的AnnExin V结合液中，分别加5 μ IAnnExin V-FITC溶液和5 μ I PI溶液，混匀后，于室温避光温育20 min，用结合液补至400 μ I。利用流式细胞仪对细胞进行检测。每个样品检测I万个细胞，用CellQuest软件分析细胞的凋亡率，实验重复3次。确定可以使肿瘤细胞凋亡的四价抗体。实施例4四价抗体的制备
将四价抗体质粒瞬时转染到CHO细胞，48 h后用胰蛋白酶消化细胞，加入2 ml DMEM完全培养液将细胞重悬，平均分至6孔板的两个孔中，同时将未转染的CHO细胞作为阴性对照，各加入400 μ g/ml的Zeocin加压筛选。一周后,在倒置显微镜下可以看到,未转染加压孔细胞全部死亡，转染孔细胞仍有细胞存活，继续加压培养。待孔里细胞基本长满时，将转染的细胞用胰蛋白酶消化，含400 μ g/ml Zeocin的DMEM完全培养液重悬细胞，计数，按照5孔3个细胞的原则，10 ml培养液60个细胞铺96孔板，每孔100 μ I。在培养过程中可以观察到细胞单克隆的形成情况，无细胞孔和多细胞克隆孔在培养的过程中弃掉，只继续培养形成单克隆孔里的细胞。并且细胞培养逐渐由96孔板向24孔板然后向6孔板过渡。根据ELISA结果选择蛋白表达量最高的克隆，扩大培养，培养过程中继续维持200 μ g/ml的Zeocin加压。放大培养后，收获上清。将收集备用的细胞上清液以I ml/min的流速通过镍柱，上完样品后，用20 mM咪唑平衡柱子至基线平稳，然后用50 mM咪唑洗脱未结合蛋白以及杂蛋白。接着用250 mM咪唑洗脱目的蛋白，同时收集洗脱液。将上述收集的洗脱液取30 μ I再加入30 μ I 2XLoading Buffer，混悬裂解，冰上孵育20 min，然后于沸水中煮10 min，4°C，12 000 g，离心5 min，取上清转入新的EP管内，待SDS-PAGE分析后，合并所有含目的蛋白的洗脱液，用BCA法测定蛋白浓度,并用western blot验证纯化的目的蛋白。实施例5细胞表面DR5的表达检测
I将生长状态良好的人食管癌细胞EC9706、人食管上皮细胞NEC、人白血病细胞Jurkat, K562常规培养于含10%的胎牛血清的RPMI1640培养液中。2将细胞调整为3X106个/ml，每种细胞各取3份，200 μ I/份细胞悬液，以PBS洗涤细胞3次。3试验管加浓度为5 yg/ml的DR5单抗(RD公司)200 μ 1，同型对照组加入小鼠正常血清200 μι (I 200稀释)，阴性对照加等量的PBS，冰浴45 min。4以预冷PBS洗涤细胞3次，每次每管加入3 ml PBS,弃去上清。5加入50 μ I PBS和FITC标记的羊抗鼠IgG (I 50稀释)50 μ I混合，冰浴40 min，用PBS洗涤2次，流式细胞仪检测DR5的表达，用Cellquest软件分析细胞DR5表达(结果见图1、2)。实施例6四价抗体对肿瘤细胞的细胞毒作用 I细胞凋亡率的检测
收集并制备EC9706、NEC、Jurkat, K562细胞悬液，加入24孔培养板，2 ml/孔，细胞终浓度为I X 105/孔，置37°C，5%C02条件培养12 hr,分别加入单链抗体、四价抗体使其终浓度为2. 5 mg/L ;阴性对照孔用RPMI1640培养液。于37°C和5%C02的条件下培养20 h，收集每孔所有细胞于相应的离心管中。PBS洗涤细胞后，每孔细胞分别悬浮于100 μ 的AnnExin V结合液中，分别加5 μ I AnnExin V-FITC溶液和5 μ I PI溶液，混匀后，于室温避光温育20 min，用结合液补至400 μ I。利用流式细胞仪对细胞进行检测。每个样品检测I万个细胞，用CellQuest软件分析细胞的凋亡率，实验重复3次(结果见图4、5、6、7)。2剂量依赖性测定 于96孔平底细胞培养板分别加入EC9706、NEC、Jurkat, K562细胞悬液，每孔加200μ I (I X IO4/孔)细胞悬液，于37°C和5%C02的条件下继续培养12 hr。离心弃上清，分别加入不同浓度(O. 25,0. 5、1、2、2. 5、3 μ g/ml)的目的蛋白溶液继续培养16 hr ;阴性对照组仅加入RPMI1640培养液。每孔终体积200 μ I。离心更换不含目的蛋白的培养液，终体积仍为200 μ 1，加入MTT工作液(5 mg/ml) 20 μ I/孔，继续培养4 hr。离心弃上清，每孔加入150 μ I DMS0，振荡5 min裂解细胞。用全自动酶标仪检测0D570吸光度值。每一浓度设4个复孔，实验重复3次(结果见图8、9、10、11)。计算细胞抑制率=(I 一实验组0D570/对照 0D570) X 100%ο
权利要求
1.死亡受体5激动性多价抗体，其特征在于，针对死亡受体5的单链抗体通过寡聚化的结构域，形成多价抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.如权利要求I所述的死亡受体5激动性多价抗体，其特征在于，针对死亡受体5的单链抗体通过p53结构域连接,形成四价抗体,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.如权利要求2所述的死亡受体5激动性多价抗体，其特征在于，其氨基酸序列与SEQID NO. 2的同源性大于80%，且可以形成四价抗体，与死亡受体5结合，诱导肿瘤细胞的凋亡，对正常细胞无毒性。
4.如权利要求I一 3任一所述的死亡受体5激动性多价抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种抗人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的受体DR5(deathreceptor5)胞外区的抗体。死亡受体5激动性多价抗体，针对死亡受体5的单链抗体通过寡聚化的结构域，形成多价抗体，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。针对死亡受体5的单链抗体通过p53结构域连接，形成四价抗体，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。该抗体多聚化后可以诱导肿瘤细胞的凋亡，对正常细胞无毒性。本发明还提供了该死亡受体5激动性多价抗体在制备抗肿瘤药物方面的应用。
文档编号A61P35/00GK102924600SQ20121045734
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者马远方, 刘峰涛, 张军, 季泽俊, 刘广超, 李淑莲 申请人:河南大学