本发明涉及药物制剂，包含作为活性剂的2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮（尼替西农）。该制剂可用于治疗其中需要抑制4-羟基苯基丙酮酸双氧化酶（HPPD）的障碍和疾病，例如可用于治疗I型遗传性酪氨酸血症。
背景技术：
化合物2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮也称为尼替西农或NTBC，首次公开是将其作为除草剂（US5,006,158；US4,695,673；US5,668,089）。
商标名为的尼替西农用于治疗I型遗传性酪氨酸血症（HT-1）这种罕见的儿科疾病。HT-1是一种起因于无法分解氨基酸酪氨酸的遗传性代谢障碍。由于其导致的肝衰竭和肝癌，HT-1儿童患者在没有肝移植的情况下难以存活到二十几岁。
如在例如US5,550,165中公开的，尼替西农是4-羟基苯基丙酮酸双氧化酶（HPPD）的竞争性抑制剂，4-羟基苯基丙酮酸双氧化酶是在酪氨酸分解代谢途径中延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH）的上游（upstream）酶。通过抑制HT-1患者内酪氨酸正常的分解代谢，尼替西农预防分解代谢中间产物马来酰乙酰乙酸盐和延胡索酰乙酰乙酸盐的累积。在HT-1患者内，这些代谢中间产物转化成毒性代谢物琥珀酰丙酮和琥珀酰乙酰乙酸盐，造成观察到的肝毒性和肾毒性。
进一步地，尼替西农已描述为可用于其它疾病如帕金森病（WO2006/090117）、抑郁症（WO2008/020150）、不宁腿综合症（WO2010/054273）、和尿黑酸症（Sunwanarat,P.et al.,Metabolism54:719-728,2005）的治疗。也已公开了尼替西农在用于增强患者感染微生物后的吞噬溶酶体融合的方法中的用途（美国专利申请，公开号No.2010-0227936）。
口服给药因其简易性成为治疗的优选途径之一。通常以片剂或胶囊这种可能不太优选的形式给药，例如，当需要以精细剂量给予待治疗受试者，或者可能不太方便，例如，在幼儿或动物药物的情况下。液体制剂可以是一种有利的替代品。
因此，需要稳定的液体尼替西农组合物以适于给予幼儿患者并克服固体药物组合物的缺点。
技术实现要素：
根据本发明，已示出包含微粉化尼替西农的悬浮液并且pH约为3的的液体药物制剂具有出乎意料有利性质，如增强的稳定性。因此，本发明涉及一种适于口服给予的液体药物制剂，包含：
（a）有效量的微粉化2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮（尼替西农）的悬浮液；以及
（b）柠檬酸缓冲液，pH范围为2.5-3.5，优选pH为3.0。
术语“有效量”的尼替西农应理解为可有效抑制4-羟基苯基丙酮酸双氧化酶的量。优选地，尼替西农的量为1-10mg/ml，更优选为4mg/ml。
尼替西农可以由已知的生产结构类似物质的有机化学常规程序获得。因此，例如，如US5,550,165公开的，在丙酮氰醇和诸如三乙胺的适当碱存在下，尼替西农可以由2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰氯和环己烷-1,3-二酮反应方便地获得。起始的2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰氯本身可以由相应的苯甲酸获得，例如，如Reagents for Organic Synthesis（有机合成试剂）（J Wiley and Sons,1967;Vol.1,pp.767-769）中描述的，通过与亚硫酰氯或草酰氯反应获得，而且通常无需特定提纯即可使用。类似地，也可以通过，例如，Haupstein等人在J.Amer.Chem.Soc,1954,76,1051中所述的方法或通过The Chemistry of Carboxylic Acids and Esters（羧酸与酯化学）（J Wiley and Sons,1969;编者:S.Patai）和（Survey of Organic Synthesis（有机合成综述）（J Wiley and Sons,1970；C.A.Buehler and D.F.Pearson）中所述的通用方法之一获得2-硝基-4-三氟甲基苯甲酸。
优选地，根据本发明的制剂，还包含选自由助悬剂、甜味剂、防腐剂、表面活性剂、和调味剂组成的组中的一种或多种药用成分。
合适的助悬剂，例如，羟丙基甲基纤维素（HPMC）的量为1-20mg/ml，优选为5mg/ml。
合适的甜味剂是丙三醇，其量为味觉可接受的。优选的尼替西农的量为100-500mg/ml，更优选为500mg/ml。
根据本发明的制剂优选包括至少一种选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、和苯甲酸钠中的防腐剂。优选地，防腐剂是对羟基苯甲酸甲酯，其量为1-2mg/ml，更优选为1.4mg/ml；对羟基苯甲酸丙酯，其量为0.1-0.2mg/ml，更优选为0.14mg/ml；以及苯甲酸钠，其量为0.2-5mg/ml，更优选为1.0mg/ml。
根据本发明的制剂优选包含表面活性剂，如聚山梨醇酯80（聚氧乙烯(80)失水山梨醇单油酸酯；常见商标名包括Alkest TW80TM和Tween80TM）。聚山梨醇酯80的量应足以在制备期间润湿尼替西农颗粒以促进尼替西农分散，以及在最终产品的储存期间避免尼替西农颗粒的任何凝聚（agglomeration）。优选地，根据本发明的制剂包含聚山梨醇酯80，其量为0.1-20mg/ml，更优选为0.10-0.15mg/ml，如约0.135mg/ml。
根据本发明的制剂优选包含诸如草莓香精的芳香剂。香精的量应足以达到制剂可接受的味道，优选的量为0.2-1.1mg/ml，更优选为0.7mg/ml。
在特别优选的形式中，根据本发明的制剂包含：
（a）尼替西农（4mg/ml）；
（b）一水合柠檬酸（9mg/ml）；
（c）脱水柠檬酸三钠（2.1mg/ml）；
（d）羟丙基甲基纤维素（5mg/ml）；
（e）丙三醇（500mg/ml）；
（f）对羟基苯甲酸甲酯（1.4mg/ml）；
（g）对羟基苯甲酸丙酯（0.14mg/ml）；以及
（h）聚山梨醇酯80（0.14mg/ml）。
在另一个特别优选的形式中，根据本发明的制剂包含：
（a）尼替西农（4mg/ml）；
（b）一水合柠檬酸（9mg/ml）；
（c）脱水柠檬酸三钠（2.1mg/ml）；
（d）羟丙基甲基纤维素（5mg/ml）；
（e）丙三醇（500mg/ml）；
（f）苯甲酸钠（1.0mg/ml）；以及
（g）聚山梨醇酯80（0.14mg/ml）。
制剂的更进一步优选的形式含有调味剂，如：
（h）草莓香精（0.7mg/ml）。
根据本发明的制剂可用于治疗医学障碍和疾病，其中期望抑制4-羟基苯基丙酮酸双氧化酶（HPPD）。这种病症的实例包括1型遗传性酪氨酸血症（HT-1）、帕金森病、抑郁症、不宁腿综合症、和尿黑酸症。
根据本发明的制剂特别适用于幼儿应用。具体地，其适用于新生儿直到8-10岁儿童，代表体重范围大约为3.5-4.0kg。因而1mg/kg的日剂量对应于2×1.75mg到2×20mg的剂量范围。4mg/ml的强度将达到的可接受剂量体积对应于每天2次给予0.44-5ml。在该范围内口腔注射器适合作为精确剂量的给予分配器。
具体实施方式
实施例1：微粉化尼替西农
使用Sturtevant Inc.的实验室规模2英寸规格样式的射流研磨机（air-jet mill）将从瑞士的Bachem公司获得的尼替西农微粉化。使用切向流操作研磨机（即气体和药物从同一方向进入研磨室）。使用磁力进料型F-TO-C（Magnet Feeder model F-TO-C）的一种文丘里式（Venturi）进料系统将未研磨的药物进料至研磨机，其中使用气体将进料吸入研磨室。通过附着在研磨机出口的产品过滤器将废气和研磨后的药物收集。研磨条件设定如下：
·磨制气体：干氮气
·磨制压力：90psi
·进料压力：85psi
·室内条件：常温
使5g的API通过实验室规模微粉粉碎机，收集得到的物质（3.7g）。利用高效液相色谱（HPLC）、X-射线粉末衍射（XRPD）、差示扫描量热法（DSC）和偏振光显微镜测试法（PLM）对物质的粒径（PSD）、成分和纯度进行了分析。微粉化的PSD结果在表I中示出。
表I
实施例2：包含对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂的微粉化尼替西农口服混悬剂的制备
如表II中所示，根据本发明的制剂是按照标准程序制备而成。
表II
实施例3：包含苯甲酸钠作为防腐剂和草莓香精作为调味剂的微粉化尼替西农口服混悬剂的制备
如表III中所示，根据本发明的制剂是按照标准程序制备而成。
表III
实施例4：用于对照的尼替西农溶液的制备
如表IV所示，尼替西农溶液是按照标准程序制备而成。
表IV
实施例5：根据欧洲药典（Ph Eur5.1.3）和美国药典（USP<51>）通过微生物挑战性研究优化防腐剂的量
不同量的防腐剂的结果在下表V和表VI中示出。
表V
根据实施例2制备包含不同量的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂的微粉化尼替西农口服混悬剂。
NI=没有增加
表VI
根据实施例3制备包含不同量的苯甲酸钠作为防腐剂的微粉化尼替西农口服混悬剂。
NI=没有增加
结果表明，根据本发明的所有上述制剂符合根据欧洲药典（Ph Eur）和美国药典（USP）的防腐剂有效性的规定要求，包括不含防腐剂的制剂指示基础制剂的自防腐剂性质。
实施例6：稳定性测试
根据实施例2制备的微粉化尼替西农口服混悬剂样品以及根据实施例4制备的尼替西农溶液分别在+5℃、+25℃和+40℃达到稳定12个月。利用HPLC-UV检测法检测尼替西农及其降解产物6-(三氟甲基)-3,4-二氢-lH-呫吨-l,9(2H)-二酮（6-(trifluoromethyl)-3,4-dihydro-lH-xanthenene-l,9(2H)-dione）（氧代四氢呫吨酮（oxotetrahvdroxanthenone））的浓度。结果在下表VII到表X中示出，以尼替西农的标称浓度表示（%的标示量）。
表VII
根据实施例2制备微粉化尼替西农口服混悬剂。
表VIII
根据实施例2制备微粉化尼替西农口服混悬剂（nd=未检出）。
表IX
根据实施例4制备尼替西农溶液。
表X
根据实施例4制备尼替西农溶液（nd=未检出）。
结果显示，在所有储存条件下，根据本发明的制剂（表VII和表VIII）比对照溶液（表IX和表X）更稳定。在对照溶液中，主要降解产物氧代四氢呫吨酮进一步降解为二级降解产物。因此对于参比溶液尼替西农和降解产物之间不可能获得质量平衡。
实施例7：氧代四氢呫吨酮的稳定性
实施例6中主要降解产物氧代四氢呫吨酮的稳定性研究是在实施例6中所述相似条件下进行的。81μg/ml的在柠檬酸盐缓冲液（pH3.0）或磷酸盐缓冲液（pH6.8）任一种缓冲液中的氧代四氢呫吨酮（OTHX）样品分别在+5℃、+25℃和+40℃可达到稳定6个月。利用LC-MS分析OTHX及其二级降解产物1,3-环己二酮（CHD）和4-(三氟甲基)水杨酸（TSA）的浓度。结果在下表XI中示出，以OTHX的初始浓度的百分数表示。表示为CHD+OTHX+TSA相对于OTHX初始浓度的总回收率的质量平衡是由MmOTHX/(Mm CHD+MmTSA)×(CHDconc+TSAconc)+OTHXconc计算得来的，以μg/ml表示，其中MmOTHX、MmCHD和MmTSA各自对应的分子量为282、202和206g/mol。质量平衡的结果示于表XII中，表示为OTHX初始浓度的百分数。
表XI
根据实施例7制备的氧代四氢呫吨酮溶液的稳定性。
表XII
质量平衡
结果表明，根据本发明的制剂相对于形成二级降解产物也出乎意料的稳定。接近100％的质量平衡的结果证实LC-MS方法能够检测并确定大部分的二级降解产物。