中和性促乳素受体抗体Mat3及其治疗用途
【专利摘要】本发明涉及中和性促乳素受体抗体Mat3和抗原结合片段，含有其的药物组合物及其在治疗或预防由促乳素受体介导的良性失调和适应症如子宫内膜异位症、子宫腺肌病、非激素女性避孕、良性乳腺疾病和乳腺痛、泌乳抑制、良性前列腺增生、纤维样瘤、高促血促乳素性脱发和血促乳素性脱发中的应用以及在组合激素疗法抑制乳腺上皮细胞增殖共同治疗中的应用和治疗及预防抗雌激素抗性乳腺癌中的应用。本发明的抗体阻断促乳素受体介导的信号传导。
【专利说明】中和性促乳素受体抗体Mat3及其治疗用途
[0001]本发明涉及促乳素受体抗体Mat3并且提供了特异性结合并中和促乳素受体的抗体Mat3的重组抗原结合区及含有这种抗原结合区的功能性片段，编码前述抗体的核酸序列，含有其的载体，含有其的药物组合物及其在治疗或预防获益于抑制促乳素受体介导的信号传导的子宫内膜异位症及其它疾病的用途。
[0002]促乳素(PRL)是由199个氨基酸组成的多肽激素。PRL属于生长激素(GH)，多肽激素的胎盘促乳素(PL)家族，在垂体的泌乳素细胞和一些垂体外组织如淋巴细胞、乳腺上皮细胞、子宫平滑肌及前列腺中合成。两种不同的启动子调节垂体和垂体外PRL合成(BioEssays28:1051-055，2006)。
[0003]PRL结合PRL受体(PRLR)，属于I类细胞因子受体超家族的单跨膜受体(Endocrine Reviewsl9:225-268，1998)。PRLR以三种不同的同种型存在，可以通过其胞质尾部的长度区分的短、长和中等形式。在配体结合时，相继的过程导致PRLR激活。PRL通过其结合位点I与一个PRLR分子相互作用，然后通过其结合位点2吸引第二受体分子，产生活化的PRLR 二聚体。PRLR 二聚体化导致JAK/STAT (Janus激酶/转录的信号转导物和激活剂)通路的优势激活。在受体二聚体化时，与受体结合的JAK(主要是JAK2)彼此反式磷酸化(transphosphorylate)和激活。另外，PRLR也被磷酸化并可以结合含有SH2-结构域的蛋白如STAT。受体结合的STAT随后被磷酸化，从受体解离并移位至核，在此其刺激靶基因的转录。另外，通过PRLR的Ras-Raf-MAPK通路的激活和胞质src激酶的激活已被描述(见综述 Endocrine Reviewsl9:225-268，1998)。
[0004]PRLR-介导的信号传导在多种过程如乳腺发育、哺乳、生殖、乳腺和前列腺肿瘤生长、自身免疫疾病、一般生长和代谢以及免疫调节中起作用(EndocrineReviewsl9:225-268, 1998;Annu.Rev.Physiol.64:47-67，2002)。
[0005]目前，除了通过`使用溴隐亭(bromocriptine)和其它多巴胺受体2激动剂(NatureClinical Practice Endocrinology and Metabolism2 (10): 571-581，2006)抑制垂体 PRL分泌之外，没有能够完全干扰PRLR-介导的信号传导的药物。然而，这些药物不阻抑能够成功代偿垂体PRL合成抑制的垂体外PRL合成，导致几乎没有损害的PRLR-介导的信号传导(Endocrine Reviews 19:225-268,1998)。因此，多巴胺2型受体激动剂无益于患有乳腺癌或自身免疫疾病如全身性狼疮或风湿性关节炎的患者并不令人惊讶(Breast Cancer Res.Treat.14:289-29，1989; Lupus7:414-419, 1998)，尽管在这些疾病中涉及促乳素。分别在乳腺癌或自身免疫疾病中起重要作用的乳腺癌细胞或淋巴细胞中的局部促乳素合成不被多巴胺受体激动剂阻断。
[0006]用于乳腺癌诊断的结合PRLR的抗体首次描述于W02003/004989 (MilleniumPharmaceuticals)。在W003/004989中，在一些乳腺癌中过表达的众多基因及相应的蛋白质包括PRLR被认为是早期检测恶性病的合适标记。在W003/008583中，关注淋巴瘤和白血病，描述了癌相关基因基因和蛋白质包括PRLR。
[0007]此外，在W02006/110585 (Novartis)中，描述了 PRLR过表达作为癌症标记以及PRLR-特异性抗体用于诊断和治疗乳腺癌和其它类型癌症(肺癌、前列腺癌和皮肤癌)的用途。这时，基于两个实验证据请求保护具有拮抗活性的单克隆抗体:a)在乳腺癌MCF7细胞中通过PRLR-特异性siRNA阻断PRLR表达导致抑制这些细胞增殖以及b)在乳腺癌细胞如T47D中促乳素诱导STAT5和MAPK磷酸化。然而，没有提供任何证据显示单克隆抗体确实抑制了乳腺癌细胞系的增殖，也没有公开任何具体抗体。
[0008]PRLR拮抗剂成功干扰乳腺癌发展的第一个体内概念验证(Proof of concept)公开于1988年。在DMBA小鼠乳腺癌模型中，单克隆PRLR抗体导致乳腺癌发病率降低(Am JPathol133:589-595, 1988)。
[0009]在US 2007/0269438 (Biogen)中描述了请求保护用于预防和治疗乳腺癌的首批PRLR抗体。来自5种杂交瘤细胞系的表达产物(抗体)通过其紧密结合乳腺癌细胞系T47D和MCF7及阻断PRL-介导的信号传导(STAT5-、MAPK-、AKT-磷酸化)的能力来描述。然而，还没有公开体内概念验证。而且，现有技术知识中没有提供证据说明特别是在患者的癌症成为抗雌激素非依赖性之后，抗-PRLR抗体可以施用给患者。
[0010]第二组单克隆PRLR-特异性抗体以及公开的一级序列描述于WO2008/022295 (Novartis)。尽管请求保护这些抗体作为用于乳腺癌、肺癌和前列腺癌的治疗剂，淋巴瘤模型示出这些药物的体内抗增殖作用。
[0011]另一方面，衍生自促乳素并具有N-末端缺失和点突变(例如deltal_9G129R促乳素)的肽能(peptidergic)PRLR拮抗剂也作为PRLR的拮抗剂，然而如果与促乳素(Pituitary6:89-95, 2003)相比，其具有降低的半衰期(15-20分钟)和低效力。因此，中和性PRLR抗体是优异的，特别是对于抑制增强的在乳腺癌和前列腺癌中起作用的自分泌促
乳素信号传导。 [0012]PRLR-介导的信号传导的作用也在良性疾病子宫内膜异位症中研究。在一个研究中，在月经周期的中晚期增生期(mid-late proliferative phase of the menstrualcycle)分析了来自子宫内膜异位症患者的子宫内膜异位样品和在位内膜(eutopicendometrium)中的 PRLR 表达模式(Acta Obstet Gynecol Scand81:5-10，2002)。证明了 PRLR mRNA存在于79%的分析的子宫内膜异位症患者的在位内膜中，而在86%的子宫内膜异位症患者的子宫内膜异位损伤中缺失。这些数据提示在正常和子宫内膜异位组织中PRLR表达的可能的差异调节。然而，根据这些表达数据，不能推断抑制PRLR可能代表了适当的子宫内膜异位症治疗-特别是因为没有发现PRLR在子宫内膜异位损伤中表达(ActaObstet Gynecol Scand81:5-10，2002)。
[0013]总之，尽管PRLR-介导的信号传导在多种细胞过程中起作用，但是公开了极少和部分矛盾的结果证明PRLR拮抗机制对于大多数良性疾病包括子宫内膜异位症的治疗价值。
[0014]公开了许多数据，表明PRLR可能是乳腺癌的起因。而且从概念上来说，有效的PRLR拮抗剂可能是证明PRLR抑制对于乳腺癌的治疗价值的适当物质。然而，迄今为止没有提供体内概念验证证明PRLR阻断确实导致抑制肿瘤生长(除了淋巴瘤治疗和抑制乳腺癌发展)并且拮抗性PRLR抗体可以用于治疗得益于阻断PRLR信号传导的良性疾病。因此，目前可以获得的抗体不能用于可以允许临床前概念验证研究的预测模型中。
[0015]需要在人、猴和小鼠中以高亲和力结合PRLR而不竞争性结合PRL的抗体，并且这种方法在所有3个物种中中和PRLR-介导的信号传导，其允许以合理剂量在小鼠以及猴中进行临床前概念验证研究。
[0016]因此，本发明的根本问题在于提供可以用于预测模型中的新PRLR抗体，其可以进行临床前概念验证研究并且可以用于治疗得益于阻断泌乳受体信号传导的疾病。
[0017]所述问题通过提供新的抗体Mat3而解决。
[0018]现已发现所述抗体在生物化学以及细胞结合研究中对于人、猴和小鼠中的PRLR具有令人惊讶的特异性并具有高亲和力，而不竞争结合PRL，并且这种方式在所有3种物种中中和PRLR-介导的信号传导，与WO 2008/022295中公开的那些抗体不同，其非竞争性结合PRL如HE06642。这种方式，所述抗体能够以合理剂量在小鼠以及猴中进行临床前概念验证研究。而且，已发现与WO 2008/022295中公开的非竞争性结合PRL那些抗体如HE06642相比，所述抗体由于更有效并与人种系序列更密切而可以给对象提供治疗益处并因此提供了改良副作用谱的机会，即由于降低的剂量以及与人种系序列增加的相似性而降低的免疫原性危险。
[0019]所述新Mat3抗体优选与来自不同物种如称猴(Macaca mulatta)(恒河猴)和食蟹猴(Macaca fascicularis)、小鼠(Mus musculus)和智人(Homo sapiens)(人)的 PRLR是交叉反应性的。本文交叉反应性是指所述抗体对人、猴和小鼠PRLR的亲和力(Kd值)和细胞结合EC5tl值低于10x10_9M(见表1，实施例9、10、13和14)并且增殖抑制IC5tl值低于20x10_9M(见实施例1至3)。本发明基于这样的发现，即新抗体Mat3可以给对象提供治疗益处(所述新抗体的序列如SEQ ID NO: 1-10所示)。本发明的抗体(其最优选可以是与人种系序列具有非常密切关系的完全人抗体或者可以是其携带完全人形式的CDR的人源化或嵌合或人工程化变体)可以用于本文更完全描述的许多上下文中。
[0020]为了示出所述抗体在体外增殖研究中相对于W02008/022295的非竞争性结合PRL的最深入鉴定的已知抗体在效力和人-猴-小鼠交叉反应性方面的优越性，所述抗体与W02008/022295的HE06642进行了比较(实施例1_3)。本文提及的HE06642或HE06.642或06.642含有可变结构域SEQ ID NO: 14和15，其与WO 2008/022295的he06.642-2的序列相同。
`[0021]在一些细胞系统中鉴定抗体Mat3以确定其物种特异性及其效力以及在不同读出范例中的功效，解决了 PRLR-介导的信号传导和增殖的失活。在稳定转染了人PRLR(实施例I)、鼠PRLR(实施例2)或恒河猴PRLR(实施例3)的Ba/F细胞系中进行增殖测定。抗体Mat3完全抑制了携带人、鼠和恒河猴PRLR的细胞的增殖(实施例1_3)。抗体HE06642 (W02008/022295)在携带鼠PRLR的细胞中是无活性的，并与Mat3比较在恒河猴PRLR-细胞中示出强烈降低的活性。抗体Mat3在人PRLR中也比抗体HE06.642更有效力。也有证据表明Mat3比HE06422以更高的效力抑制大鼠NB2淋巴瘤细胞增殖。除了细胞增殖测定，使用稳定转染了人或鼠PRLR(实施例12)以及瞬时转染了在LHRE (催乳激素反应元件(lactogenichormone response elements))控制下的突光素酶报道基因的HEK293细胞系进行了突光素酶报道基因测定。使用这些系统，可以证实依赖于PRLR-介导的信号传导的启动子在存在Mat3时关闭。抗体HE06.642不能有效阻断鼠PRLR-介导的信号传导也是明显的。
[0022]总之，抗体Mat3因而适于在鼠和猴模型中测试PRLR-介导的信号传导的抑制。
[0023]所述抗体比HE06642含有更相似于翻译的人种系V基因的可变结构域。图6示出VH和VL结构域每个与翻译的人种系重链V和λ轻链V基因是90%相同的[VBASE2database; Retter I, Althaus HH, Miinch R, Mill Ier W: VBASE2, an integrative Vgene database.Nucleic Acids Res.2005Janl;33(Database issue):D671_4]。HE06642与VBASE2中发现的最相似的翻译的VH种系序列显示89%相同性并且与最相似的翻译的种系轻链V序列仅80%相同性。当用Mat3治疗患者时，这一发现提供了具有更低免疫原性风险的机会。
[0024]具有人、猴和小鼠PRLR的胞外结构域的Mat3和HE06642的结合研究表明这两种抗体与这些纯化的结构域相互作用(见下文，实施例10和表1)。然而，当这些结构域在细胞表面暴露时，可以在Mat3和HE06642之间观测到更显著的差异。更显著地，当Ba/F细胞表达抗体HE06642时，HE06642不结合鼠PRLR，而Mat3则结合(表2，和图5，和实施例9)。这一发现Mat3阻断鼠PRLR-介导的信号传导和增殖(与HE06642不同)的观测一致。具有人PRLR的胞外结构域(当纯化时以及暴露在细胞表面时被Mat3和HE06642结合)的肽扫描揭示Mat3结合亚结构域S2 (实施例11)如HE06642，如之前所报道(W0 2008/022295)。这一扫描还示出在Mat3和HE06642之间在结合S2结构域中存在差异(图8)。近来，公开了通过这种肽扫描观测到的抗体的不同结合能够解释抗体性质的差异(Niederfellner etal.,Blood.2011,Mar28.do1:10.1182/blood-2010-09_305847)。总之，所述肽扫描结果表明为什么抗体Mat3与HE06642相比显示不同的物种-特异性和效力。
[0025]本发明提供了表5所示的人单克隆抗体Mat3(SEQ ID N0.1-10)或其拮抗促乳素受体-介导的信号传导的抗原结合片段。所述抗体特异性结合PRLR(SEQ IDNO: 12)或SEQ ID NO:12的人多态性变体如I146L和I76V变体的胞外结构域(ECD)，如PNAS105 (38)，14533，2008，和 J.Clin.Endocrinol.Metab.95 (I)，271，2010 所述。而且，所述抗体特异性结合恒河猴和食蟹猴PRLR(SEQ ID NO: 11)和鼠PRLR(SEQ ID NO: 13)的胞外结构域伍⑶)。
[0026]在一个实施方`案中，公开了人抗体Mat3或其人源化、人-工程化的或嵌合抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含相应于SEQ ID N0:3的核酸序列和SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变重链区，并且包含相应于SEQ ID N0:4的核酸序列和SEQ ID N0:2的氨基酸序列的可变轻链区，其拮抗促乳素受体-介导的信号传导。
[0027]在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含上述抗体CDR，其中
[0028]所述可变重链含有相应于SEQ ID NO: 5、6和7的⑶R序列以及所述可变轻链含有相应于SEQ ID N0:8、9和10的CDR序列。
[0029]在本发明的一个实施方案中，所述抗体Mat3由特异性结合人、猴和小鼠的PRLR的胞外结构域的一或多个区域的抗原结合区组成，并且其中所述人PRLR的氨基酸序列如SEQID NO: 12和SEQ ID NO: 12的人多态性变体的1-210位的氨基酸序列、SEQ ID NO: 11的猴PRLR和SEQ ID NO: 13的小鼠PRLR的1-210位的氨基酸序列所示。
[0030]在本发明的另一个实施方案中，所述Mat3由抗原结合区组成，其中对于人、猴和小鼠PRLR胞外结构域的亲和力至少是ΙΟΟηΜ，优选小于大约ΙΟΟηΜ，更优选小于大约30nM，甚至更优选小于大约ΙΟηΜ。
[0031]在另一个实施方案中，所述抗体Mat3由特异性结合人PRLR胞外结构域的一或多个区域并且亲和力是至少ΙΟηΜ、更优选小于大约InM的抗原结合区组成。
[0032]本发明的另一目的是前述的Mat 3，其中所述重链恒定区确定修饰或未修饰的IgGl、IgG2、IgG3 或IgG4。
[0033]表1提供了本发明抗体Mat3的解离常数(亲和力)和解离速率的总结，通过人PRLR(SEQ ID NO: 12)、恒河猴和食蟹猴PRLR(SEQ ID NO: 11，其中Fc-His融合体通过蛋白酶解因子Xa消化除去)和鼠PRLR(SEQ ID NO: 13)的单体胞外结构域(氨基酸1-210)对于直接固定的抗体的表面等离子共振确定(Biacore)(实施例10)。
[0034]表1:在HEK293细胞中表达的人、恒河猴/食蟹猴和小鼠PRLR的胞外结构域对于作为人IgG分子的Mat3通过表面等离子共振确定的单价解离常数和解离速率(见实施例10)
[0035]
【权利要求】
1.拮抗促乳素受体-介导的信号传导的抗体Mat3或其抗原结合片段，其中所述抗体包含相应于SEQ ID NO:3的核酸序列和SEQ ID NO:1的氨基酸序列的可变重链区以及相应于SEQ ID NO:4的核酸序列和SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变轻链区。
2.权利要求1的抗体Mat3或其抗原结合片段，其包含权利要求1的抗体的CDR，其中 所述可变重链含有相应于SEQ ID NO:5、6和7的CDR序列以及所述可变轻链含有相应于 SEQ ID NO:8、9 和 10 的 CDR 序列。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体由特异性结合人、猴和小鼠PRLR的胞外结构域的一或多个区域的抗原结合区组成，并且其中人PRLR的氨基酸序列由SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:12的人多态性变体的1_210位的氨基酸序列所示、由SEQ ID NO:11的猴PRLR和SEQ ID NO:13的小鼠PRLR的1-210位的氨基酸序列所示。
4.权利要求3的抗体，其中对于人、猴和小鼠PRLR的胞外结构域的亲和力是至少ΙΟΟηΜ、优选小于大约ΙΟΟηΜ、更优选小于大约30nM、甚至更优选的亲和力小于大约ΙΟηΜ。
5.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体由特异性结合人PRLR的胞外结构域的一或多个区域的抗原结合区组成，并且其中亲和力是至少ΙΟηΜ、更优选小于大约InM。
6.权利要求1-5任一项的抗体,其中重链恒定结构域确定修饰的或未修饰的IgGl、IgG2、IgG3 或IgG4。
7.编码权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段的分离的核酸序列。
8.权利要求7的分离的核酸序列，其中所述核酸序列相应于SEQID N0:3和4。
9.包含权利要求7或8的核酸序列的表达载体。
10.包含权利要求9的载体或`者权利要求7或8的核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞可以是高等真核宿主细胞如哺乳动物细胞，低等真核宿主细胞如酵母细胞，以及可以是原核细胞如细菌细胞。
11.使用权利要求10的宿主细胞生产抗体或抗原结合片段的方法，包括在适当条件下培养权利要求10的宿主细胞并回收所述抗体。
12.通过权利要求11的方法产生的抗体或抗原结合片段。
13.纯化至至少95%重量均一性的权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段。
14.作为药物的权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段。
15.药物组合物，其包含权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段和药学可接受载体包括赋形剂和辅剂。
16.包含权利要求1-6任一项的抗体的试剂盒，其包含包装在容器中的治疗有效量的抗体Mat3，所述试剂盒任选含有第二种治疗剂，并且进一步包含附于容器或与容器包装的标签，所述标签描述了容器的内容物并提供关于使用所述容器内容物治疗子宫内膜异位症、子宫腺肌病、良性乳腺疾病和乳腺痛、泌乳抑制、高血促乳素性脱发和正常血促乳素性脱发、良性前列腺增生、纤维样瘤或用于非激素女性避孕或治疗接受组合激素治疗(即雌激素加孕激素治疗)的女性以抑制乳腺上皮细胞增殖或用于治疗和预防抗雌激素抗性乳腺癌的指示和/或说明。
17.权利要求1-6的抗体或抗原结合片段用于治疗和/或预防子宫内膜异位症和子宫腺肌病(宫内子宫内膜异位症)的方法中。
18.权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段在制备女性避孕药物中的应用。
19.权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段用于治疗良性乳腺疾病和乳腺痛的方法中。
20.权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段用于制备泌乳抑制药物。
21.权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段用于治疗良性前列腺增生的方法中。
22.权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段用于治疗高血促乳素性脱发和正常血促乳素性脱发的方法中。
23.权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗接受组合激素疗法的女性的药物中的应用。
24.权利要求23的应用，其中所述组合激素疗法是雌激素加孕激素疗法。
25.权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段用于治疗或预防抗雌激素抗性乳腺癌的方法中。
26.权利要求15的药物组合物，包含权利要求1-6任一项的PRLR抗体或抗原结合片段组合至少一种其 它物质。
【文档编号】A61K39/395GK103764679SQ201280038107
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年5月31日 优先权日:2011年6月3日
【发明者】C·弗莱贝格, C·奥托, L·林登, A·哈尔恩加, M·特劳特魏茵, S·格雷文, A·威尔门 申请人:拜耳知识产权有限责任公司