治疗癌症的制作方法

治疗癌症的制作方法
【专利摘要】一种用于治疗癌症的方法，包括将来自患者或受试者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述固体载体包含能够特异性地结合于趋化因子受体，可选地为趋化因子受体CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5或结合于直接或间接固定在载体上的Treg受体的一种或多种结合试剂，从而从患者或受试者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体，可选地为CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5或Treg受体表达细胞。还描述了各种伴随诊断方法和有用的结合试剂。
【专利说明】治疗癌症
【技术领域】
[0001]本发明的各种实施方式涉及用于治疗癌症的产品和方法，尤其是通过降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病和慢性髓样白血病。所述产品和方法还可以用于急性髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)的减体治疗(debulking)，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及用于治疗淋巴瘤的白血病期。还描述了伴随诊断。
【背景技术】
[0002]癌症是一种疾病，其特征在于由细胞DNA中基因突变累积导致的失控的细胞生长。按照从其中首先发展癌症或肿瘤的起源细胞归类，存在200种以上的不同癌症。另外，癌症可以宽泛地分类为实体瘤，例如乳腺癌、结肠直肠癌和黑色素瘤，或血液恶性肿瘤如白血病和淋巴癌。
[0003]实体瘤通常起始和生长为在局部部位处的异常团块。然而，在癌症进展的过程中，细胞可以获得侵入底层组织并从而进入循环和/或淋巴系统的能力。这些侵入性能最终允许实体瘤转移到体内的远端部位，并且它是与在继发部位处生长相结合的转移，这占癌症死亡的相当大部分。
[0004]和实体瘤相对，癌症如白血病和淋巴癌源自血液起源的细胞，因此表现为系统性疾病。尤其是，慢性淋巴性白血病，白血病的最常见形式，发展自源自骨髓的恶性淋巴细胞。
[0005]身体具有用来抵抗癌症发展的许多内在机制。在此方面，免疫系统被认为在消除包含基因突变的细胞方面具有关键作用。因此，接着癌细胞经常通过进化途径保持避免被免疫系统的细胞识别。尤其是，已表明，在外周循环中以及在肿瘤微环境中T调节细胞的升高水平是在癌症患者中看到的免疫抑制的基础。增加数目的调节性T细胞的存在还已被认为是成功实施癌症免疫疗法的障碍。
[0006]成分血分离是用于清除血液成分，如抗体、低密度脂蛋白(LDL)和血细胞的治疗方法。白细胞去除法是用于除去白细胞(white blood cell)(白血球,leukocyte)的成分血分离治疗方法。将患者连接于体外血液循环系统，从一个臂的静脉中抽取血液，通过柱装置，然后返回到患者的另一个臂。W02010/029317描述了用于治疗炎性病症的成分血分离柱，包括固定在固体载体上的趋化因子。

【发明内容】

[0007]趋化因子是一类细胞因子分子，其涉及在炎症中的细胞募集和激活。趋化因子引起在免疫系统中细胞的各种亚群的趋化性和激活。主要通过紧密结合于它们在白细胞表面上的受体来介导趋化因子的活性。在某些实施方式中，本发明是基于认识到，在趋化因子和表达它们的受体的细胞之间的相互作用可以开发用于治疗各种癌症及其组分，如通过降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从外周血中除去调节性T淋巴细胞(在本文中可以将其称作“Treg”)，或 治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及用于治疗淋巴瘤的白血病期。本发明的发明人已确定，靶向特异性趋化因子受体表达细胞可以提供新的治疗方式来治疗所述疾病。此外，在所述疾病中，可以再次增加在每种细胞上的趋化因子受体表达，从而提供用来治疗所述疾病的治疗方式。本文中表明，癌症患者，尤其是患有UBC和PC的受试者，显示CCR4表达循环Treg的增加频率，以及这种反应对于Treg是特异性的(并且并不适用于其他T淋巴细胞)。因此可以靶向CCR4表达细胞，以治疗癌症。治疗可以依靠适宜的结合试剂如CCL22 (MDC)及其衍生物(如本文中进一步详细描述的)。本文还表明，患有白血病(如CLL)的受试者具有高度增加数目的循环(白血病)B细胞。白血病B细胞表达特征性趋化因子受体，如CCR7。本文还表明，在白细胞去除法中，利用MIP3b作为特异性结合试剂，可以有效地清除CCR7表达B细胞。
[0008]因此，在某些实施方式中，本发明用来降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率,从外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病。在某些实施方式中，本发明还可以用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及用来治疗淋巴瘤的白血病期。这是利用特异性结合试剂来捕捉来自患者特定的趋化因子受体表达癌细胞和调节性T淋巴细胞来实现的。因此，在某些实施方式中，在第一方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法，包括将来自患者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在载体上的一种或多种趋化因子受体，尤其是趋化因子受体CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种结合试剂，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体，尤其是 C·CR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种。然后可以将从其中除去趋化因子受体表达细胞的外周血返回至患者以完成治疗。因此在某些实施方式中，本发明可以依靠连续体外回路(在一些实施方式中)。可替换地，在其他实施方式中，本发明可以包括以下步骤:从患者体内获得外周血，将外周血施加于柱，随后将从其中除去趋化因子受体表达细胞的外周血返回至患者。
[0009]在本文中，提及CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5旨在包括所列出的趋化因子受体的任何一种或多种、直至全部的选择。另外，明确地考虑了 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4和/或CXCR7的组合作为单独的组，以包括CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4 和 CXCR7 的任何一种或多种。
[0010]因此，癌症的直接治疗依赖于除去表达CCR的肿瘤细胞。CCR可以限于/累积在白血病细胞上。在某些实施方式中，本发明还考虑(包括)除去(正常)调节性T细胞，其已被肿瘤诱导，作为肿瘤逃逸机制，作为一种治疗方式，除了直接治疗以外或作为直接治疗的替换方案其可以被实施。
[0011]在某些实施方式中，本发明因此还提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括将来自患者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在载体上的一种或多种调节性T细胞受体(其可以被确定为在癌症中被上调，尤其是皮肤淋巴细胞抗原(CLA)受体或在Treg上表达的趋化因子受体如CCR4和CCR8)的一种或多种结合试剂，从而从患者的外周血中除去一种或多种调节性T细胞受体表达细胞。然后可以将从其中除去调节性T细胞受体表达细胞的外周血返回至患者以完成治疗。因此在一些实施方式中本发明可以依靠连续体外回路。可替换地，在其他实施方式中，本发明可以包括以下步骤:从患者体内获得外周血，将外周血施加于柱，随后将从其中已除去调节性T细胞受体表达细胞的外周血返回至患者。
[0012]在本文中，提及CLA、CCR4和/或CCR8旨在包括所列出的趋化因子受体的任何一种或多种、直至全部的选择。另外，明确地考虑了 CLA、CCR4和/或CCR8的组合作为单独的组(本文还描述 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或CXCR5 组)。
[0013]通过趋化因子可以将Treg募集至肿瘤，如CCL17和CCL22结合于表达在Treg上的CCR4，或例如可以发生CCR8介导的募集(通过CCLl)。因此，在某些实施方式中，本发明还可以依靠能够特异性地结合于一种或多种趋化因子受体(如CCR4和CCR8)的一种或多种结合试剂。如下文所讨论的，结合试剂可以包括一种或多种趋化因子。CCL17和CCL22可以用来除去CCR4表达Treg以及CCLl可以用来除去CCR8表达Treg。
[0014]趋化因子受体的表达可以因白血病而变化。例如，在具有循环细胞的白血病和具有淋巴结恶性细胞的淋巴瘤之间的差异可以在于CCR7的表达，从而允许进入淋巴结。当淋巴瘤进入白血病期时，它可能是由于CCR7的下调。因此，在其他实施方式中，本发明还提供了用于治疗白血病的方法，该方法包括将来自患者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在载`体上的一种或多种趋化因子受体(其已被确定为连接白血病，例如在白血病中被上调)的一种或多种结合试剂，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体表达细胞。可以通过应用本文描述的方法来确定适宜的趋化因子受体表达细胞。
[0015]如本文所述，可以直接或间接地将适宜的结合试剂固定在固体载体上，以产生适合用于捕捉相关趋化因子受体表达细胞的成分血分离柱。在观测到趋化因子受体表达的增加水平的情况下，可以利用本发明的各种实施方式的柱从外周血中优选地除去这样的细胞。因此，本发明的各种实施方式的方法可以优选地靶向如本文定义的CCR5h1、CCR6h1、CCR7h1、CCR8h1、CXCR4h1、CXCR7h1、CCR4h1、CCR9h1、CCRlOh1、CXCR3hi 或 CXCR5hi 细胞的一种或多种，以便从外周血中除去。可以按照标准流式细胞术技术来确定“高”表达。相对于在取自健康受试者的细胞中趋化因子受体的表达水平来测量所述水平。图5提供了选通策略的一个实例。
[0016]在某些实施方式中，本发明进一步提供了能够特异性地结合于一种或多种趋化因子受体，尤其是结合于趋化因子受体/趋化因子受体CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的结合试剂，用于治疗癌症，其中将一种或多种结合试剂直接或间接固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对其施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体/CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞。在其他实施方式中，本发明还提供了能够特异性地结合于趋化因子受体/趋化因子受体CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种结合试剂用于制造用于治疗癌症的成分血分离柱的用途，其中将一种或多种结合试剂固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对其施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体 /CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5 表达细胞。
[0017]类似地，如本文所述，可以将适宜的结合试剂直接或间接固定在固体载体上，以产生适用于捕捉相关Treg受体表达细胞的成分血分离柱。在观测到Treg受体表达的增加水平的情况下，可以利用本发明的各种实施方式的柱从外周血中优选除去这样的细胞。因此，在某些实施方式中，本发明的各种实施方式的方法可以优选靶向如本文定义的CLAh1、CCR4hi和/或CCRShi细胞的一种或多种，以从外周血中除去。可以按照标准流式细胞术技术来确定“高”表达。相对于在取自健康受试者的细胞中的Treg受体的表达水平来测量所述水平。图5提供了选通策略的一个实例。
[0018]在其他实施方式中，本发明进一步提供了能够特异性地结合于一种或多种Treg受体，尤其是结合于Treg受体CLA、CCR4和/或CCR8的结合试剂，用于治疗癌症，其中将一种或多种结合试剂直接或间接固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对其施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去一种或多种Treg受体表达细胞。在某些实施方式中，本发明还提供了能够特异性地结合于Treg受体/Treg受体CLA、CCR4和/或CCR8(待用)的一种或多种结合试剂在制造用于治疗癌症的成分血分离柱中的用途，其中将一种或多种结合试剂固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对其施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去一种或多种Treg受体/CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞。
[0019]针对本发明的各种实施方式的治疗方法所描述的所有实施方式适用于这些方面(在细节上作必要的修改)并且为简洁起见不再重复。因此，参照治疗方法进行的以下讨论也适用于本发明的各种实施方式的医学用途方面。
[0020]在某些实施方式中，本发明旨在治疗各种特定癌症、或癌症相关病症。特定病症可以选自降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及治疗淋巴瘤的白血病期。降低循环肿瘤细胞的水平可以适用于一定范围的癌症。该方面可以与某些实体瘤如乳腺癌、结肠癌或肺癌相关。降低肿瘤转移的发生率可以依 靠防止转移细胞进入特定位置，因为这可以通过趋化因子-趋化因子受体相互作用来驱动。因此，在某些实施方式中，本发明的方法可以用来防止转移细胞进入骨、肺、淋巴结、皮肤和小肠的任何一种或多种。在【具体实施方式】中，靶向CXCR4表达细胞以防止转移细胞进入骨和/或肺。在其他实施方式中，靶向CCR7表达细胞以防止转移细胞进入淋巴结。在进一步的实施方式中，靶向CCRlO表达细胞以防止转移细胞进入皮肤。在更进一步的实施方式中，靶向CCR9表达细胞以防止转移细胞进入小肠
[0021]从外周血中除去调节性T淋巴细胞(在本文中可以将其称作“Treg”)可以帮助免疫系统识别癌症或肿瘤。T调节细胞(Treg)是T细胞的亚群，其抑制免疫系统以保持免疫稳态。在癌症中，Treg可以抑制针对肿瘤的有效免疫反应，因此除去Treg可以导致针对癌细胞的改善的免疫激活。因此在某些实施方式中，本发明的这个方面可以适用于治疗任何癌症。具体实例包括胰腺癌和膀胱癌，尤其是膀胱癌。
[0022]在某些实施方式中，还可以与其他形式的治疗(如化学治疗)结合来使用本发明的方法。利用白细胞去除法程序的减体治疗可以降低对化学治疗的需要，并因而减小副作用。
[0023]白血病如慢性淋巴性白血病和慢性髓样白血病的治疗可以基于在外周血中直接除去癌性细胞。在AML和ALL中减体治疗的应用可以依靠通过本发明的各种实施方式实现的靶向细胞减少效应。类似地，在从受试者或患者体内收获骨髓或干细胞用于自体骨髓/干细胞移植以前，除去癌性细胞或有助于癌性病症的细胞(如Treg)可能是有用的。在某些实施方式中，当在外周血中发现过多淋巴细胞时，本发明还可以用于治疗淋巴瘤的白血病期。基于表达特定受体、尤其是趋化因子受体的细胞，可以除去过多的淋巴细胞，其可以包括Treg。
[0024]通过靶向CXCR4和/或CXCR3表达细胞，可以治疗白血病，尤其是急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。通过靶向CXCR4、CXCR5和/或CXCR3表达细胞，可以治疗白血病，尤其是慢性粒细胞性白血病(CML)。
[0025]治疗是指，在患者的外周血中减少特定的趋化因子受体表达细胞。减少可以包括减少细胞，在病患者中所述细胞以增加的水平表达趋化因子受体，尤其是CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5 的一种或多种。患者通常是病人，但术语患者可以包括人和非人动物受试者(在一些实施方式中)。在本发明的各种实施方式的情况下，这通常涉及在患者的外周血中减少CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5 表达细胞的一种或多种，如 CCR5h1、CCR6h1、CCR7h1、CCR8h1、CXCR4h1、CXCR7h1、CCR4h1、CCR9h1、CCR10h1、CXCR3hi 和 / 或 CXCR5hi 表达细胞的一种或多种。在某些实施方式中，CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3和/或CXCR5表达细胞包含肿瘤细胞、中央记忆T淋巴细胞和调节性T淋巴细胞，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方式中，肿瘤细胞可以源自白血病，如慢性淋巴性白血病，尤其是B-CLL (B细胞慢性淋巴性白血病)、慢性髓样白血病、AML、ALL和淋巴瘤的白血病期。在某些实施方式中，本发明可以，例如，通常依赖除去白血病的B细胞。B细胞可以表征为⑶19阳性细胞。
[0026]在Treg针对的用途的情况下，治疗尤其依赖于在患者的外周血中特异性Treg受体表达细胞的减少。减少可以包括减少这样的细胞，在病患者中所述细胞以增加的水平表达Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种。在一些实施方式中，患者通常是病人，但术语患者可以包括人和非人动物受试者。在本发明的上下文中，这通常涉及在患者的外周血中减少CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的一种或多种，如“CLAh1、CXCR4hi和/或CXCR8hi”表达细胞的一种或多种。本文中表明，癌症患者显示CCR4表达循环Treg的增加频率，并且这种反应对于Treg是特异性的(并且并不适用于其他T淋巴细胞)。利用适宜的结合试剂如CCL22 (MDC)及其衍生物，可以靶向CCR4表达细胞(如本文中进一步详细描述的)。
[0027]淋巴细胞的三种主要类型是T细胞、B细胞和天然杀伤(NK)细胞。术语“T淋巴细胞”包括CD4+T细胞如T辅助细胞(Thl细胞和Th2细胞)，以及CD8+T细胞如细胞毒性T细胞。可以通过CCR5的表达和/或通过IFN-的生产来表征Thl细胞。可以通过CCR3的表达和/或通过IL-4的生产来表征Th2细胞。调节性T细胞(Treg)在细胞表面上表达转录因子FoxP3并表达高水平的IL-2Ra(CD25)。另外，它们具有下调水平的IL_7a受体CD127。因此，Treg可以被定义为CD4+CD25hiCD1271o/_和Foxp3阳性的。Treg的功能是通过由细胞因子介导的直接和间接接触来调节和调整T效应细胞反应。因此，肿瘤诱导Treg以避免被T效应细胞识别和清除(作为肿瘤逃逸机制)。
[0028]在某些实施方式中，除基于结合于趋化因子受体如CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5 和 / 或 Treg 受体如 CLA、CCR4 和 / 或 CCR8的去除以外，本发明的方法还可以涉及与这些另外的细胞表面(和细胞特异性)标志物的任何一种或多种的特异性结合相互作用。可以制备适宜的结合试剂以特异性地结合于这些细胞表面标志物。因此，(趋化因子受体，尤其是0^5、0^6、0^7、0^8、0乂0?4、0乂0?7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5 ;和/或Treg受体)特异性结合试剂的讨论是适用的(在细节上作必要的修改)。
[0029]CCR5是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)受体5的基因符号。该基因的HGNC ID是1605。该基因位于染色体位置3p21处。该基因的先前的符号和名称是CMKBR5。该基因的同义词包括CC-CKR-5、CD195CKR-5、IDDM22和CKR5。CCR5的Entrez Gene参考序列是如于2011年6月13日可获得的1234，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0030]CCR6是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)受体6的基因符号。该基因的HGNC ID是1607。该基因位于染色体位置6q27处。该基因的先前的符号和名称是 STRL22。该基因的同义词包括 BN-1、CD196、CKR-L3、CMKBR6、DCR2、DRY-6、GPR-CY4、GPR29。CCR6的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的U68030.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0031]CCR7是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)受体7的基因符号。该基因的HGNC ID是1608。该基因位于染色体位置17ql2_q21.2处。该基因的先前的符号和名称是CMKBR7、EBI1。该基因的同义词包括BLR2、CD197和CDwl97。CCRl的RefSeq参考序列是如于2011年6月13日可获得的NM_001838.3，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0032]CCR8是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)受体8的基因符号。该基因的HGNC ID是1609。该基因位于染色体位`置3p22处。该基因的先前的符号和名称是 CMKBR8、CMK。该基因的同义词包括 CDwl98、CKR-Ll、CY6、GPR-CY6、TERl。CCR8 的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的D49919.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0033]CXCR4是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_X_C基序)受体4的基因符号。该基因的HGNC ID是2561。该基因位于染色体位置2q21处。该基因的先前的符号和名称是〃趋化因子(C-X-C基序)受体4(fusin)〃。该基因的同义词包括CD184、D2S201E、融合受体、腿89、HSY3RR、LESTR、NPY3R、NPYR、NPYY3R。CXCR4 的 Genbank 参考序列是如于2011年6月13日可获得的AJ132337.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0034]CXCR7是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_X_C基序)受体7的基因符号。该基因的HGNC ID是23692。该基因位于染色体位置2q37.3处。该基因的先前的符号和名称是〃趋化因子孤儿受体1〃、CMK0R1。该基因的同义词包括GPR159和RDCl。CXCR7的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的BC008459.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0035]CCR4是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)受体4的基因符号。该基因的HGNC ID是1605。该基因位于染色体位置3p24_p21.3处。该基因的同义词包括 CC-CKR-4、CD194、ChemRl3, CKR4、CMKBR4、k5_5。CCR4 的 Genbank 参考序列是如于2012年4月4日可获得的X85740.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0036]皮肤淋巴细胞抗原(本文中为CLA)是表达在皮肤归巢T细胞上的PSGL-1的特化形式，参见 Fuhlbrigge et al.，Nature389, 978-981 (300ctoberl997) | do1: 10.1038/40166(全部内容以引用方式结合于本文)。渗透皮肤的记忆T细胞表达独特的皮肤归巢受体，称作皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA)，一种碳水化合物表位，其促进T细胞靶向至发炎皮肤I(skinl )，CLA是P选择素糖蛋白配体_1 (PSGL-1)的可诱导的碳水化合物修饰，一种已知的表面糖蛋白，其组成型表达在所有人外周血T细胞上。
[0037]CXCR3是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_X_C基序)受体3的基因符号。该基因的HGNC ID是4540。该基因位于染色体位置Xql3处。该基因的先前的符号和名称是〃G蛋白耦联受体9〃，GPR9。该基因的同义词包括CD183、CKR-L2、CMKAR3、IPlO-R和MigR0 CXCR3的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的U32674.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0038]CXCR5是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_X_C基序)受体5的基因符号。该基因的HGNC ID是1060。该基因位于染色体位置llq23.3处。该基因的先前的符号和名称是BLR1。"Burkitt淋巴瘤受体1、GTP结合蛋白(趋化因子(C-X-C基序)受体5)〃、〃Burkitt淋巴瘤受体1、GTP-结合蛋白〃。该基因的同义词包括CD185、MDR15。CXCR4的Genbank参考序列是如于2012年5月29日可获得的X68829.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0039]CCR9是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)受体9的基因符号。该基因的HGNC ID是1610。该基因位于染色体位置3p22处。该基因的先前的符号和名称是GPR28。该基因的同义词包括CDwl99、GPR-9-6。CCR9的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可 获得的AJ132337.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0040]CCRlO是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)受体10的基因符号。该基因的HGNC ID是4474。该基因位于染色体位置17p21.1_q21.3处。该基因的先前的符号和名称是〃G蛋白耦联受体2〃、GPR2。CCR9的Genbank参考序列是如于2012年5月29日可获得的AF215981.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0041]根据本发明的各种实施方式的治疗可以导致减轻或改善症状、防止进展、减退病症、或完全恢复。成功治疗的可测量参数包括以下的一种或多种，直至全部:循环⑶4+⑶25hi⑶1271ο/-和Foxp3阳性细胞的数目将减少以及在外周血中T效应细胞的功能性激活将增加，作为有效治疗的标志。循环趋化因子受体表达白血病或肿瘤细胞的数目可以减少，作为有效白细胞去除法的标志。在【具体实施方式】中，单次治疗足以引起从患者的外周血中清除约10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%、或更高达到80%、90%、95%或更多、或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围的特定趋化因子受体的一种或多种，尤其是 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5 表达细胞的一种或多种。在【具体实施方式】中，在单次治疗中，实现至少约50%的清除。因此，可以参考 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5 表达细胞的一种或多种的清除来定义成功治疗。在某些实施方式中，治疗可以导致清除约100至500百万个 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5 表达细胞，如癌细胞和调节性T淋巴细胞，以及更具体地约100、150、200、250、300、350。400、450、或 500 百万个 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 /或CXCR5表达细胞。类似的清除水平可以适用于这样的方法，其中靶向Treg受体表达细胞(CLA、CCR4 和 / 或 CCR8)。
[0042]通过结合于柱(通过结合试剂-趋化因子受体相互作用)来固定趋化因子受体表达细胞。这些固定的细胞可以进一步表达未I禹联的趋化因子受体(unoccupied chemokinereceptor)，其可以具有与用于捕捉的那些趋化因子受体相同或不同类型。这些另外的趋化因子受体可以允许从外周血中捕捉可以有助于病症的循环趋化因子。因此，循环(特定)趋化因子水平的降低可以提供成功治疗的度量，这是因为例如趋化因子下调可以减少Treg募集。
[0043]本领域技术人员可以容易确定治疗的持续时间，并且这将取决于多种因素如外周血的流速。可以将治疗的持续时间结合于监测治疗本身，其中在治疗的可测量参数已达到限定的阈值以后则认为治疗完成。如本文讨论的，可以采用任何适宜的参数。因此，例如，当已实现 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5表达细胞的一种或多种减少，如 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5表达细胞的一种或多种50%减少时，可以认为治疗已完成。能够以约10-80mL/分钟的流率，更具体地约20-70mL/分钟，或约30_60mL/分钟，来操作成分血分离系统。在【具体实施方式】中，进行治疗持续约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分钟等时间期间，或这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围。治疗通常并不旨在除去在外周血中的所有表达趋化因子受体的细胞，因为那些细胞的基本水平是健康受试者所需要的。然而，已发现，仅需要将低血液体积施加于本发明的柱以实现趋化因子受体表达细胞的有效清除水平。因此，在某些实施方式中，在单次治疗中，将约10-90%或更具体地约20、30、40、50、60。70、80或90%、或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围的患者血液施加于柱。循环通过成分血分离柱或系统的血液体积可以为约1000-3000ml，如约1000、1200、1400、1600、1800或2000ml、或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围。在已循环所述体积的血液以后，可以认为治疗已完成。在每个治疗期以前，可以给予患者抗凝血剂。适宜的溶液，如无菌盐水溶液，可选地包括抗凝血剂如肝素，可以用来起动成分血分离(体外)系统。在每个治疗期开始时，可以将另外体积的抗凝血剂加入回路，例如作为推注液。相同因素可以适用于(在细节上作必要的修改)本发明的多个方面，其中靶向Treg表达细胞(如CLA、CCR4和`/或CCR8表达细胞)。
[0044]在某些实施方式中，本发明依赖于结合试剂，其能够特异性地结合于趋化因子受体，或结合于调节性T细胞受体(在一些实施方式中)。当血液通过在其上或其中固定有结合试剂的固体载体时，这种特异性结合反应允许从患者的外周血中除去表达趋化因子受体或调节性T细胞受体的细胞。感兴趣的特定的趋化因子受体包括CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5 (当治疗癌症如白血病时)和/或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8 (当具体地旨在除去Treg时)。结合试剂可以是能够特异性地结合于所考虑的受体的任何结合试剂。“特异性结合”是指，结合试剂显示足够的结合特异性和适当的结合亲合力/动力学，以允许从外周血中除去表达CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5 的一种或多种、或调节性 T 细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的细胞(在适当的情况下)。虽然并不排除结合试剂能够结合于其他分子，如其他趋化因子受体，但结合试剂将优先结合于表达CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种，或调节性T细胞受体如 CLA、CCR4 和 CCR8 的细胞，尤其是结合于表达 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5的一种或多种，或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的增加水平的细胞(如本文中进一步定义的)。能够特异性地结合于CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5、或调节性 T 细胞受体如 CLA、CCR4 和 CCR8 的结合试剂可以分别是 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3和/或CXCR5、或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的激动剂或拮抗剂。因为疾病状态可以依靠 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5、或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的表达上调，或通过其发信号，所以在某些实施方式中，能够特异性地结合于CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3和/或CXCR5、或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的结合试剂分别是 CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5、或调节性T细胞受体如CLA、CCR4和CCR8的拮抗剂。趋化因子通常是，虽然并不一定唯一地是(尤其是在截短或修饰形式的情况下)它们的同源受体的激动剂并且用来激活表达相关受体的细胞，如本领域技术人员应当理解的。针对相关趋化因子受体的抗体一般被认为是拮抗剂，如本领域技术人员应当理解的。结合试剂的具体实例包括蛋白质或多肽，如抗体和受体配体，尤其是趋化因子。在某些实施方式中，结合试剂可以是核酸分子。在一些实施方式中，核酸是适体。核酸适体是长度约15-40个核苷酸的多核苷酸。可以利用SELEX方法(通过指数式富集使配体系统地演化)或本领域技术人员已知的任何其他方法来制备核酸适体。对于CLA，结合试剂可以基于已知的结合剂如血管凝集素内皮细胞-白细胞黏附分子I (ELAM-1)。本文中关于修饰的截短趋化因子的讨论适用于针对CLA的ELAM-1结合试剂(在细节上作必要的修改)。
[0045]在其他实施方式中，结合试剂可以是肽，以及在某些情况下，肽适体。肽适体是人工识别分子，其由插入恒定支架蛋白的可变肽序列组成(Baines IC, ColasP.Peptide aptamers as gui·des for small molecule drug discovery.Drug DiscovToday.2006; 11:334 - 341，以引用方式结合于本文)。许多方法，如噬菌体展示、核糖体展示和酵母菌双杂交筛选系统，可用于筛选潜在的基于肽的结合剂的文库。类似地，基于结构域的蛋白质支架，如纤连蛋白、锚蛋白重复序列、蛋白A、SH3结构域、脂质运载蛋白和泛素，可以用作结合剂。而且，许多技术如噬菌体展示和核糖体展示可用于筛选基于蛋白质的结合剂的文库。类似地，利用本领域中已知的适宜的筛选技术(在某些实施方式中其可以是高通量筛选)，可以针对与相关的趋化因子受体特异性结合来筛选候选化合物的文库。可以将候选结合剂固定在固体载体上，并确定所述试剂特异性地保留表达感兴趣的趋化因子受体或标记趋化因子受体的细胞的能力。可以将一系列细胞类型施加于固体载体以证实结合的特异性，或可替换地可以将混合样品(如外周血)施加于固体载体。可以证实感兴趣的细胞类型(表达适当的趋化因子受体)的保留以确定合适的结合剂。
[0046]在本发明的各种实施方式的情况下，术语“趋化因子”还包括生物素化或以其他方式标记的趋化因子。术语“趋化因子”还包括趋化因子的修饰和截短形式以及趋化因子片段，前提条件是修饰或截短形式保留其结合于它的同源受体的能力(因而，在本发明的情况下，保持功能)。趋化因子不一定需要保留生物活性，这是因为，针对CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5 和 / 或针对 CCR4 和 CCR8 (其中特异性地靶向Treg)的特异性结合亲和力是所需要的。在某些实施方式中，趋化因子缺乏生物活性，例如就(CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 /或CXCR5 ;或CCR4或CCR8，当特异性地靶向Treg时)受体的激活而言。
[0047]可以进行修饰以改善蛋白质合成，例如产物和产量的均匀性。如本领域技术人员已知的，示例性修饰可以包括对在趋化因子中的一种或多种氨基酸的氨基酸添加、替代、缺失或其他修饰。修饰可以包括用非天然氨基酸如正亮氨酸(NLeu)和衍生氨基酸如焦谷氨酸(pyroGlu)来替代野生型氨基酸。可以进行这种修饰以在本发明的各种实施方式的柱的储存和使用期间将副产物形成降至最低。可以进行修饰以改善标记，例如包括聚乙二醇(PEG)间隔物以促进生物素化。以并不显著影响受体结合能力的方式，进行与趋化因子的荧光色素或其他标记基团的生物素化和/或结合。位点特异性生物素化或其他标记是优选的，这是因为趋化因子的非选择性标记性可以损害受体结合活性。生物素化或其他标记通常优选位于或朝向蛋白质的C端，因为本发明的发明人已发现，在此区域中的修饰通常是良好耐受的(就对于受体结合能力的最小影响而言)。可以在任何适宜的氨基酸处位点特异性地进行生物素化。适宜的氨基酸的实例包括赖氨酸和鸟氨酸。通常，可以参见 Natarajan S et al, Int.J.Pept.Protein Res., 1992, 40, 567-74;BaumeisterB, Int.J.Peptide Res.And Therapeutics, 2005, 11, 139-141;Bioconjugate techniques2ndedition, Greg T.Hermanson,全部内容以引用方式结合于本文。
[0048]截短可以涉及N或C端氨基酸的缺失(在适当的情况下)，或两者。通常，截短形式将保留趋化因子正确折叠所需要的残基，例如以保留趋化因子折叠结构，其与以下要求一致:截短形式必须保留结合于相关受体(由白细胞(在表面上)表达的)的能力。趋化因子分子通常包括分别在第一和第三以及第二和第四半胱氨酸残基之间的二硫键，如本领域技术人员理解的。在本文中提供序列的情况下，假设，这些二硫键将形成在折叠的蛋白质中(除非另有说明)。在某些实施方式中，截短形式可以包含比野生型氨基酸序列少I至100个氨基酸，如1、2、3、4、5个等氨基酸。当然，截短形式可以包含进一步的修饰(如本文详述的)。在某些实施方式中，修饰或截短形式`可以与全长野生型趋化因子具有40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的总体氨基酸序列一致性(其中缺失被计算为氨基酸序列的差异)。在某些实施方式中，在分子之间的共同序列上(即，未被删除的氨基酸)，可以具有 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的氨基酸序列一致性。可以利用已知算法，如BLAST或GAP分析(GCG程序)(采用默认设置)(其可免费获得)，来确定序列一致性。趋化因子可以缺少N端信号肽，其在体内合成过程中被切割掉。
[0049]在本发明的各种实施方式中用于结合于CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 和 / 或 CXCR5 的特定趋化因子包括 MIP-3 a (CCL20)、CCL19、CCL21、CCLU CXCLlU CXCL12、CCL25 (TECK)、CCL27 (CTACK)、CCL28 (MEC)、CXCL9 (MIG)、CXCL10 (ΙΡ10)、CXCL13 (BCA-1)、CCL17 (TARC)和 CCL22 (MDC)。在本文中，提及 MIP-3 a (CCL20)、CCL19、CCL21、CCLl、CXCLl1、CXCLl2, CCL25 (TECK)、CCL27 (CTACK)、CCL28 (MEC)、CXCL9 (MIG)、CXCL10 (ΙΡ10)、CXCL13 (BCA-1)、CCL17 (TARC)和 CCL22 (MDC)旨在包括所列出的趋化因子的任何一种或多种、直至全部的选择。另外，明确地考虑了MIP-3 a (CCL20)、CCL19、CCL21、CCLU CXCLll 和 CXCL12 的组合作为单独的组，以包括MIP-3 a (CCL20)、CCL19、CCL21、CCL1、CXCL11 和 CXCL12 的任何一种或多种。另外，明确地考虑了 CCL25 (TECK)、CCL27 (CTACK)、CCL28 (MEC)、CXCL9 (MIG)、CXCLlO (IPlO) XXCLll (ITAC)、CXCL13 (BCA-1)、CCL17 (TARC)和 CCL22 (MDC)的组合作为单独的组，以包括 CCL25 (TECK)、CCL27 (CTACK)、CCL28 (MEC)、CXCL9 (MIG)、CXCLlO (IPlO)、CXCLll (ITAC)、CXCL13 (BCA-1)、CCL17 (TARC)和CCL22(MDC)的任何一种或多种。
[0050]CCL3、CCL4、CCL5 和 CCL8 结合 CCR5。CCL20 结合 CCR6 (仅)。CCL19 和 CCL21 结合 CCR7。CXCL12 结合 CXCR4。CCLl 结合 CCR8。CXCLll 和 CXCL12 结合 CXCR7。CCL17 和CCL22 各自结合于 CCR4。CCL25 (TECK)结合于 CCR9、CCL27 (CTACK)和 CCL28 (MEC)各自结合 CCR10。CXCL9 (MIG)、CXCLlO (IPlO)和 CXCLll (ITAC)结合 CXCR3。CXCL13 (BCA-1)结合CXCR5。CCL17 (TARC)和 CCL22 (MDC)仅结合 CCR4。
[0051]根据本发明的各种实施方式，可以各自应用在本文中更详细描述的修饰和截短的趋化因子(参考相关的氨基酸序列，如在SEQ ID NO和伴随的实验性实施例中提出的)。所述修饰形式可以指导技术人员可以适用于本发明的各种实施方式的相同和其他趋化因子的另外的修饰形式。趋化因子显示可变的序列同源性:从小于20%至90%以上，但均共享非常类似的三级结构，其由以下各项组成:无序的N端，接着长环(N环)，其终止于31(|螺旋，3链β折叠和C端螺旋。通过二硫键来稳定总体拓扑结构。这种共同三级结构是趋化因子蛋白家族的共同特征(Fernandez EJ annd Lolis E., Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，202，42，469-99; Allen SJ et al, Annu.Rev.1mmunol.，2007，25，787-820，以引用方式结合于本文)。
[0052]在该N端区内的截短可以保持结合于受体，但可以导致功能的改变或丧失(例如 Zhang YJ et al, J.Biol.Chem.，1994，269，15918，； Gong J-H and Clark-Lewis 1., J.Exp.Med., 1995, 181, 631-640;Fernandez EJ annd Lolis E.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol., 202, 42, 469-99; Allen SJ et al, Annu.Rev.1mmunol.，2007，25，787-820,其各自以引用方式结合于本文)。·
[0053]还可以制造在趋化因子C端的截短并保持受体结合活性(Treating InflammatoryDisorders, Ola Winqvist and Graham Cotton, W02010/029317,全部内容以引用方式结合于本文)。
[0054]在其他实施方式中，在如本文公开的装置和方法中使用趋化因子的片段和变体。更具体地讲，所述片段和变体保留特异性地结合于它们的同源趋化因子受体的能力。本领域技术人员已知，趋化因子共享特定受体结合域，包括类似的单体折叠，其特征在于例如，无序的氨基末端域，接着是保守核心区，其由所谓的“N环”、三个反向平行链、和羧基末端α-螺旋组成。虽然不受理论限制，认为趋化因子-趋化因子受体相互作用是两步机制，其中趋化因子的核心首先与由受体的胞外域形成的结合位点相互作用，同时在趋化因子N端和在受体上的第二结合位点之间形成另一种相互作用以触发受体激活。因此，“片段”，如趋化因子的功能片段，是指蛋白质的氨基酸序列的一部分，其保留针对其同源受体的结合。片段可以包括，例如，单体折叠区、或其部分，如氨基末端域、保守核心区和/或“N环”、反向平行β链、和/或羧基末端α-螺旋、或它们的组合和部分。
[0055]此外，认识到，多肽可以被显著突变而没有显著改变多肽功能的一种或多种，例如，没有改变蛋白质的特异性结合和/或折叠。众所周知，遗传密码是简并的，因此不同的密码子编码相同的氨基酸。甚至在引入氨基酸替代的情况下，突变也可以是保守的并且对蛋白质的基本功能没有重大影响(参见例如，Stryer, Biochemistry4th Ed., W.Freeman&C0., New York, NY, 1995)。这包括,例如，蛋白质与其他蛋白质结合和相互作用的能力，如截短趋化因子结合于它的同源受体。
[0056]在一些实施例中，可以删除多肽链的一部分而没有损害或清除所有它的功能。例如,在C和/或N端上约I至约20个氨基酸的缺失，如在C和/或N端约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个氨基酸的缺失，可以导致这样的趋化因子，其保留功能，如它的同源受体的特异性结合。所述截短可以保留整个蛋白质的全部功能，和/或可以允许保留的功能，如蛋白质-蛋白质相互作用，如在配体-受体相互作用的情况下。缺失少量的氨基酸的趋化因子，例如，小于约20%(如小于约18%、小于约15%、小于约10%、小于约8%、小于约5%、小于约2%、或小于约1%)的氨基酸的总数(在野生型趋化因子中)也可以用于本文公开的方法和装置。此外，在多肽链中可以进行插入或添加，例如，添加附加表位，而没有损害或消除它的功能(Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publ.Assoc, and Wiley-1ntersciences, 1998)。在没有显著损害多妝的一种或多种功能的情况下可以进行的其他修饰包括，例如，体内或体外化学和生化修饰或稀有氨基酸的结合。在一些实施例中，趋化因子的功能片段可以由趋化因子氨基酸序列的约10或更多、约25或更多、约50或更多、约75或更多、约100或更多、约125或更多、约150、约175或更多、或约更多或200或更多个氨基酸残基组成。
[0057]在一些实施例中，趋化因子或其功能片段具有氨基酸，与参考序列(如本文详细描述的那些)相比(例如利用NCBI Blast2.0gapped BLAST设定为默认参数)在其全长上，其具有至少约60%或65%的序列一致性，约70%或75%的序列一致性，约80%或85%的序列一致性，约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。还可以通过检查，手工进行比对。还可以在趋化因子氨基酸序列中进行一种或多种保守氨基酸修饰，无论是添加、缺失或修饰，其并不显著改变多肽的三维结构或它结合于同源受体的能力。例如，保守氨基酸替代并不影响趋化因子特异性地结合它的同源受体的能力。提供功能类似氨基酸的保守替代表是本领域中众所周知的。以下六组各自包含彼此是保守替代的氨基酸:1)丙氨酸㈧、丝氨酸⑶、苏氨酸⑴；2)天冬氨酸`⑶、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K) ；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。
[0058]可以通过各种各样的化学技术来修饰肽，如趋化因子及其片段，以产生这样的衍生物，其具有和未修饰肽基本相同的活性或功能，如结合于同源受体，以及可选地具有其他所期望的性能。例如，蛋白质的羧酸基团，不管是羧基末端或侧链，能够以药用阳离子盐形式来提供，或被酯化以形成C1-C16酯，或被转化为化学式NR1R2的酰胺，其中Rl和R2各自独立地是H或C1-C16烷基，或被结合以形成杂环，如5或6元环。肽的氨基，不管是氨基末端或侧链，可以为药用酸加成盐的形式，如HCl盐、HBr盐、乙酸盐、苯甲酸盐、甲苯磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐和其他有机盐，或可以被修饰成C1-C16烷基或二烷基氨基，或进一步被转化为酰胺。
[0059]利用公认的技术，可以将肽侧链的羟基转化为C1-C16烷氧基或转化为C1-C16酯。可以由一种或多种卤素原子，如F、Cl、Br或I，或由C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸和其酯、或所述羧酸的酰胺，来取代肽侧链的苯基和苯酚环。可以将肽侧链的亚甲基延伸成同系C2-C4亚烷基。可以用许多公认的保护基团中的任何一种，如乙酰胺基团，来保护巯基。本领域技术人员还将认识到用于将环状结构引入本公开肽的方法，以选择和提供对结构的构象限制，这导致增强的稳定性。例如，可以将C-或N-端半胱氨酸加入肽，以致当被氧化时，肽将包含二硫键，从而产生环肽。其他肽环化方法包括形成硫醚以及羧基末端和氨基末端酰胺和酯。
[0060]肽模拟物和有机模拟物实施方式也在本发明的范围内，由此，该肽模拟物和有机模拟物的化学成分的三维排列模拟肽主链和组分氨基酸侧链的三维排列，从而导致本发明的蛋白质的该肽模拟物和有机模拟物。对于计算机建模应用，药效团是用于生物活性的结构要求的理想化的三维定义。肽模拟物和有机模拟物可以用目前的计算机建模软件(利用计算机辅助药物设计或CADD)设计成适合每种药效团。参见Walters,“Computer-AssistedModeling of Drugs”，in Klegerman&Groves, eds., 1993, PharmaceuticalBiotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove,IL, pp.165174and Principles ofPharmacology Munson(ed.) 1995, Ch.102,for descriptions of techniques used inCADD。在本发明的范围内还包括利用所述技术制备的模拟物。
[0061]通过酰胺键(CONH)，通常将在肽、多肽、或蛋白质中的氨基酸化学结合在一起。另外，可以通过其他化学键，将氨基酸结合在一起。例如，用于氨基酸或氨基酸类似物的键可以包括 CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(顺式和反式)、-C0CH2-、-CH(OH)CH2-、和-CHH2S0-(这些和其他键可以参见 Spatola, in Chemistry and Biochemistryof Amino Acids, Peptides, and Proteins,B.Weinstein, eds., Marcel Dekker, NewYork, p.267 (1983) ; Spatola, A.F., Vega Data (Mar chi 98 3) ,Vol.1, I ssue3, PeptideBackbone Modifications (综论)；Morley, Trends Pharm Sci pp.463-468，1980;Hudson, eta 1., Int J Pept Prot Resl4: 177-185, 1979; Spatola et a 1.LifeSci38:1243-1249，1986;Harm J.Chem.Soc Perkin Trans.1307-314, 1982;Almquistet al.J.Med.Chem.23:1392-1398，1980;Jennings-White et al.TetrahedronLett23:2533, 1982;Holladay et al.Tetrahedron.Lett24:4401-4404, 1983 ；以及 HrubyLife Sci31:189-199, 1982)。`
[0062]CCL20是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体20的基因符号，还称为ΜΙΡ_3α。该基因的HGNC ID是10619。该基因位于染色体位置2q33_q37处。该基因的先前的符号和名称是SCYA20，〃小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员20〃。该基因的同义词包括 CKb4、exodus-l、LARC、MIP-3a、ST38。CCL20 的 Genbank 参考序列是如于2011年6月13日可获得的D86955.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0063]CCL19是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体19的基因符号，还称为MIP-3b。该基因的HGNC ID是10617。该基因位于染色体位置9pl3处。该基因的先前的符号和名称是SCYA19，〃小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员19〃。该基因的同义词包括〃β趋化因子exodus-3〃、"CC趋化因子配体19"、"CKP -11"、CKblU〃ΕΒΙ1-配体趋化因子〃、ELC、exodus-3、〃巨噬细胞炎性蛋白3_β 〃、MIP_3b。CCL19的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的AB000887.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0064]CCL21是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体21的基因符号。该基因的HGNC ID是10620。该基因位于染色体位置9pl3处。该基因的先前的符号和名称是SCYA21，〃小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员21〃。该基因的同义词包括6Ckine、〃 β趋化因子exodus-2〃、CKb9、ECL, 〃淋巴细胞的高效的化学吸引物〃、exodus-2、〃次级淋巴样组织趋化因子〃、SLC、TCA4。CCL21的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的AB002409.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0065]CCLl是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体I的基因符号。该基因的HGNC ID是10609。该基因位于染色体位置17qll.2处。该基因的先前的符号和名称是SCYA1，〃小的可诱导的细胞因子Al (1-309，与小鼠Tca_3同源)"。该基因的同义词包括1-309、〃炎性细胞因子1-309〃、P500、SISe、〃T淋巴细胞分泌蛋白I_309〃、TCA3。CCLl的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的M57506.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0066]CXCLll是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_X_C基序)配体11的基因符号。该基因的HGNC ID是10638。该基因位于染色体位置4q21处。该基因的先前的符号和名称是SCYB9B、SCYBlU 〃小的可诱导的细胞因子亚家族B (Cys-X-Cys)，成员11〃。该基因的同义词包括b-Rl、H174、1-TAC、IP-9。CXCLll的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的U66096.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0067]CXCL12是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_X_C基序)配体12的基因符号。该基因的HGNC ID是10672。该基因位于染色体位置IOqll.1处。该基因的先前的符号和名称是SDF1、SDF1A、SDF1B、〃基质细胞衍生因子1〃。该基因的同义词包括PBSF、SCYB12、SDF-la、SDF-lb、TLSF-a、TLSF-b、TPARl。CXCL12 的 Genbank 参考序列是如于 2011年6月13日可获得的L36033.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0068]SELE是由HUGO基因命名委员会批准的用于选择素E的基因符号，还称为ELAM-1。该基因的HGNC ID是10718。该基因`位于染色体位置Iq22_q25处。该基因的同义词包括CD26E、ESEL。SELE的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的M30640.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0069]CCL17是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体17的基因符号。该基因的HGNC ID是10615。该基因位于染色体位置16ql3处。该基因的先前的符号和名称是SCYA17、〃小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员17"。该基因的同义词包括AB⑶-2、TARC。CCL17的Genbank参考序列是如于2012年4月4日可获得的D43767.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0070]CCL22是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体22的基因符号。该基因的HGNC ID是10621。该基因位于染色体位置16ql3处。该基因的先前的符号和名称是SCYA22、"小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员22〃。该基因的同义词包括 A-152E5.1、ABCD-1、DC/B-CK、MDC、MGC34554、STCP-1。CCL22 的 Genbank 参考序列是如于2012年4月4日可获得的U83171.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0071]CCL25是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体25的基因符号。该基因的HGNC ID是10624。该基因位于染色体位置19pl3.2处。该基因的先前的符号和名称是SCYA25、"小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员25〃。该基因的同义词包括“CkP -15〃、Ckbl5、TECK、〃TECKvar〃、〃 胸腺表达的趋化因子 〃。CCL25 的 Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的U86358.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0072]CCL27是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体27的基因符号。该基因的HGNC ID是10626。该基因的先前的符号和名称是SCYA27、〃小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员27〃。该基因位于染色体位置9pl3处。该基因的同义词包括ALP、〃CC趋化因子ILC〃、CTACK, CTAK, 〃皮肤T细胞吸引趋化因子〃、ESkine,"IL-1lRa-基因座趋化因子〃、ILC、PESKY、skinkine。CCL27的Genbank参考序列是如于2012年5月29日可获得的AJ2433542.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0073]CCL28是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体28的基因符号，还称为MEC和CCKl。该基因的HGNC ID是17700。该基因位于染色体位置5pl2处。该基因的同义词包括〃CC趋化因子CCL28 〃、CCK1、MEC、〃粘膜相关上皮趋化因子〃、SCYA28、〃小的可诱导的细胞因子A28〃、〃小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员28〃。CCL28的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的AF110384.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0074]CXCL9是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_X_C基序)配体9的基因符号。该基因的HGNC ID是7098。该基因位于染色体位置4q21处。该基因的先前的符号和名称是CMK、MIG、〃由Y干扰素诱导的单核因子〃。该基因的同义词包括crg-10、Humig、SCYB9。CXCLlO的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的X72755.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0075]CXCLlO是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_X_C基序)配体10的基因符号。该基因的HGNC ID是10637。该基因位于染色体位置4q21处。该基因的先前的符号和名称是INP10、SCY·B10、〃小的可诱导的细胞因子亚家族B (Cys-X-Cys)，成员10〃。该基因的同义词包括 C7、crg-2、gIP-10、IFI10、IP-10、mob_l。CXCLlO 的 Genbank 参考序列是如于2011年6月13日可获得的X02530.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0076]CXCL13是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_X_C基序)配体13的基因符号。该基因的HGNC ID是10639。该基因位于染色体位置4q21处。该基因的先前的符号和名称是SCYB13、"小的可诱导的细胞因子B亚家族(Cys-X-Cys基序)，成员13 (B细胞化学吸引物)〃。该基因的同义词包括ANGIE、ANGIE2、"B细胞化学吸引物〃、BCA-1、BLC、BLRlL0 CXCL13的Genbank参考序列是如于2012年5月29日可获得的AJ002211.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0077]本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的实例(参见以下实施例3)。修饰CCL8(MCP-2)对应于全长成熟蛋白的残基I至76 (并且缺少被切割掉的23个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠。在生理条件下，在蛋白质的N端处的Gln经历pyroGlu形成。因此，序列的Glnl由焦谷氨酰胺取代，以防止产生N端Gln和pyroGlu的混合物质(SEQ ID N0:1)。通过柱制造和使用，这提高了合成产量并确保均匀趋化因子制备。结合FmocLys (ivDde)-OH作为残基75，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID N0:2)。通过生物素化来修饰在位置75处的自然发生的赖氨酸。可以在ε-氨基官能团和生物素之间结合PEG间隔物(SEQ ID Ν0:3)。[0078]因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含以下SEQ IDNO:1的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成:XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVC ADPKERffVRDSMKHLDQIFQNLXP
[0079]Xl=PyroGlu(但在一些实施方式中可以保持为Gln)
[0080]X75=可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化,可选地通过间隔分子如PEG，例如K (PEG-生物素)被生物素化。
[0081]或SEQIDN0:3
[0082]XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKERWVRDSMKHLDQIFQNLXP
[0083]Xl=PyroGlu(但在一些实施方式中可以保持为Gln)
[0084]X75=K (PEG-生物素)。
[0085]本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实施例(参见以下实施例4)。修饰CCL5 (RANTES)对应于全长成熟蛋白的残基I至68 (并且缺少被切割掉的23个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠。在序列内的单个甲硫氨酸(Met67)被突变为赖氨酸，以便在链装配期间减轻该残基的氧化(SEQ ID NO:4) ο该Met至Lys的替代提供了在位置67处的赖氨酸，其可以通过生物素化来修饰。结合FmocLys (ivDde) -OH作为残基67,以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:5)。生物素化形式包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0086]因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰`的趋化因子，其包含以下SEQ IDNO:6的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成:
[0087]SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKN RQVCANPEKKffVREYINSLEXS
[0088]X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG(例如K(生物素))被生物素化。
[0089]本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例5)。修饰CCL20(MIP-3a )对应于全长成熟蛋白的残基I至70 (并且缺少被切割掉的26个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠(SEQID NO: 7)。结合FmocLys (ivDde)-OH作为残基68，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO:8) ο通过生物素化来修饰在位置68处的自然发生的赖氨酸。可以将PEG间隔物结合在ε -氨基官能团和生物素之间。因此最终蛋白质可以包含SEQ ID Ν0:9的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0090]因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含以下SEQ IDNO:9的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成:
[0091 ] A SNFD CCLGYTD R I LHPKF I VGFT RQLANEGCD I NA I I FHTKKKL SVCANPKQTWVKYIVRLLSKKVXNM
[0092]X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K (PEG-生物素)被生物素化。
[0093]本文中详细描述包含截短和修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例6)。截短的CXCL12 (SDF-1 a )对应于全长成熟蛋白的残基I至67 (并且缺少由总长度为93个氨基酸的不成熟蛋白质切割掉的21个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠(SEQ ID N0:10)。结合FmocLys (ivDde)-OH作为残基64，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO: 11)。通过生物素化来修饰在位置64处的自然发生的赖氨酸。因而最终蛋白质可以包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0094]因此，在某些实施方式中，本发明还涉及截短/修饰的趋化因子，其包含以下SEQID NO: 12的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成:
[0095]KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNN NRQVCIDPKLKffIQEYLEXALN
[0096]X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG,，尤其是K(生物素)被生物素化
[0097]或SEQ ID NO: 10:
[0098]KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNN NRQVCIDPKLKffIQEYLEKALN
[0099]本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例7)。修饰CCL22(MDC)对应于全长成熟蛋白的残基I至69 (并且缺少被切割掉的24个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠(SEQ IDNO: 13)。结合FmocLys (ivDde)-OH作为残基66,以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO: 14)。通过生物素化来修饰在位置66处的自然发生的赖氨酸。可以将PEG间隔物结合在ε -氨基官能团和生物素之间。因此最终蛋白质可以包含SEQ ID Ν0:15的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0100]因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含以下SEQ IDNO: 15的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成:`[0101]GPYGANMEDSVCCRDYVRYRLP LRVVKHFYffT SD S CP RPGVVLLTFRDKEICADPRVPffVKMILNXLSQ
[0102]X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K (PEG-生物素)被生物素化。
[0103]本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例8)。修饰CCL17 (TARC)对应于全长成熟蛋白的残基I至71 (并且缺少被切割掉的23个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠。在C端，在位置72处，可以插入另外的赖氨酸或等效残基。因而，趋化因子可以包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。结合FmocLys (ivDde)-OH作为残基72，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO: 17)。通过生物素化来修饰Lys (72)的ε_氨基侧链官能团。可以将PEG间隔物结合在氨基官能团和生物素之间。因此，最终蛋白质可以包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0104]因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含SEQ ID NO: 16或18的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成:
[0105]SEQ ID NO: 16
[0106]ARGTNVGRECCLEYFKGAIPLRKLKTWYQTSEDCSRDAIVFVTVQGRAICSDPNNKRVKNAVKYLQSLERSX
[0107]X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化(例如K-生物素)，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K (PEG-生物素)
[0108]SEQ ID NO: 18
[0109]ARGTNVGRECCLEYFKGAIPLRKLKTWYQTSEDCSRDAIVFVTV QGRAICSDPNNKRVKNAVKYLQSLERSK (PEG-生物素)
[0110]本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例9)。修饰CCL19 (ΜΙΡ-3 β )对应于全长成熟蛋白的残基I至77 (并且缺少被切割掉的21个氨基酸的N端信号肽)，因此保留趋化因子折叠。在C端，在位置78处，插入另外的赖氨酸。因此，趋化因子可以包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。结合FmocLys (ivDde)-OH作为残基78,以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO: 20)。通过生物素化来修饰Lys (78)的ε-氨基侧链官能团。因而，最终蛋白质可以包含SEQ ID NO:21的氣基酸序列,基本上由其组成或由其组成。
[0111]因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含SEQ ID NO: 19或21的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成:
[0112]SEQ ID NO: 19
[0113]GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRG RQLCAPPDQPffVERIIQRLQRTSA謂KRRSSX
[0114]X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化(例如，K-生物素)，可选地通过间隔分子如PEG，尤其是K (PEG-生物素)
[0115]SEQ ID NO:21·
[0116]GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRG RQLCAPPDQPffVERIIQRLQRTSA謂KRRSSX
[0117]X是K (生物素)
[0118]本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例10)。修饰CXCLll (ITAC)对应于全长成熟蛋白的残基I至73 (并且缺少被切割掉的21个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠(SEQID NO: 22)。在C端，可选地通过PEG间隔物，在位置74处，插入另外的赖氨酸。因此，趋化因子可以包含SEQ ID N0:23的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0119]SEQ ID NO:23:
[0120]FPMFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLK ENKGQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNFX
[0121]X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG被生物素化。可以通过间隔分子如PEG来添加氨基酸残基，因而可以是“PEG-K”。
[0122]结合FmocLys (ivDde) -0H,接着Fmoc_12-氨基_4，7, 10-三氧杂十二烧酸,作为残基74，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID NO: 24)。通过生物素化来修饰另外的Lys(74)的ε-氨基侧链官能团。因此，最终蛋白质可以包含SEQ ID Ν0:25的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0123]SEQ ID NO:25:[0124]FPMFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLK ENKGQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNFX
[0125]X 是 PEG-K (生物素)。
[0126]因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含SEQ ID NO:23或25的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0127]本文中详细描述包含截短和修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例11)。人CCL25 (TECK)的截短形式对应于成熟蛋白的残基1-74，其包括对应于趋化因子折叠的序列。全长成熟蛋白是127个氨基酸(信号肽是在150个氨基酸不成熟蛋白质中的23个氨基酸)。在序列内的单个甲硫氨酸被改变为正亮氨酸，以便在链装配期间减轻该残基的氧化，这在自然序列衍生物的合成过程中被观测到。在生理条件下，在蛋白质的N端的Gln经历pyroGlu形成。因此，序列的Glnl由焦谷氨酰胺取代，以防止产生N端Gln和pyroGlu的混合物质。通过柱制造和使用，这提高了合成产量并确保均匀趋化因子制备。通过在树脂上生物素化来修饰在位置72处的自然发生的赖氨酸。将PEG间隔物结合在ε-氨基官能团和生物素之间。
[0128]因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰的趋化因子，其包含以下SEQ IDNO:26的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成:
[0129]XGVFEDCCLAYHYPIGWAVLRRAWTYRIQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGNPKSREVQRAXKLLDARNXVF
[0130]Xl=pyroGlu 或 Gln
[0131]Χ64=正亮氨酸
·[0132]Χ72=可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化,可选地通过间隔分子如PEG，例如K (PEG-生物素)被生物素化
[0133]XGVFEDCCLAYHYPIGWAVLRRAWTYRIQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGNPKSREVQRAXKLLDARNXVF
[0134]Xl=pyroGlu 或 Gln
[0135]X64=正亮氨酸
[0136]X72=K (ivDde)
[0137]可以结合FmocLys (ivDde)-OH作为残基72,以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID N0:27)。如在一般性方案部分中描述的，可以随后除去ivDde保护基团，接着偶联PEG间隔物和生物素。因此，所期望的活性趋化因子可以包含以下SEQ ID N0:28的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成:
[0138]XGVFEDCCLAYHYPIGWAVLRRAWTYRIQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGNPKSREVQRAXKLLDARNXVF
[0139]Xl=pyroGlu 或 Gln
[0140]X64=正亮氨酸
[0141]X72 是!((PEG-生物素)
[0142]本文中详细描述包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例12)。对应于残基1-88的人CCL27 (CTAC)最初表达为包含趋化因子折叠的112个氨基酸，以及被切割掉的24个氨基酸信号肽。在序列内的Met (87)被突变为赖氨酸，以提供在位置87处的赖氨酸，通过在树脂上生物素化对其进行修饰。将PEG间隔物结合在ε -氨基官能团和生物素之间。
[0143]因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰趋化因子，其包含以下SEQ ID NO:29的氨基酸序列，基本上由其构成或由其构成:
[0144]FLLPPSTACCTQLYRKPLSDKLLRKVIQVELQEAD⑶CHLQAFVL HLAQRSICIHPQNPSLSQWFEHQERKLHGTLPKLNFGMLRKXG
[0145]X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化,可选地通过间隔分子如PEG，例如K (PEG-生物素)被生物素化
[0146]FLLPPSTACCTQLYRKPLSDKLLRKVIQVELQEAD⑶CHLQAFVL HLAQRSICIHPQNPSLSQWFEHQERKLHGTLPKLNFGMLRKXG
[0147]X=K (ivDde)
[0148]结合FmocLys (ivDde)-OH作为残基87,以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID N0:30)。如在一般性方案部分中描述的，随后除去ivDde保护基团，接着偶联PEG间隔物和生物素。因此，所期望的活性趋化因子可以包含以下SEQ ID N0:31的氨基酸序列，基本上由其构成或由其构成:
[0149]FLLPPSTACCTQLYRKPLSDKLLRKVIQVELQEAD⑶CHLQAFVL HLAQRSICIHPQNPSLSQWFEHQERKLHGTLPKLNFGMLRKXG
[0150]X=K (PEG-生物素)
[0151]本文中详细描述包含修饰并且特别适用`于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的进一步实例(参见以下实施例13)。修饰CXCLlO (IP-1O)对应于全长成熟蛋白的残基I至78 (并且缺少被切割掉的21个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠。例如，可以插入能够生物素化的氨基酸，如赖氨酸或鸟氨酸，作为残基78。插入可以通过间隔物，如PEG间隔物。示出线性氨基酸序列(SEQ ID N0:32)，在连接PEG间隔物、另外的赖氨酸和生物素分子之前:
[0152]VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEI IATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP
[0153]因此，可以通过生物素化来修饰位置78。可以结合FmocLys (ivDde)-OH作为残基78，以促进在蛋白质的该位置处位点特异性标记(SEQ ID N0:33)。可以将合适的间隔物，如PEG间隔物，结合在ε -氨基官能团和生物素之间。生物素化形式包含SEQ ID Ν0:34的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。
[0154]因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰趋化因子，其包含SEQ IDNO:34 的氨基酸序列:VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSPX，基本上由其组成或由其组成。
[0155]X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，例如K (PEG-生物素)被生物素化，以及可以通过间隔分子，例如PEG-K (生物素)，进行连接
[0156]在某些实施方式中，新合成的用于本发明的各种实施方式的方法的特定趋化因子，包括其衍生物(如本文所描述的)，可以代表本发明单独的方面。生物素化被定位以允许固定同时保持受体结合能力。[0157]可以通过本领域中已知的任何合适的方式来合成可用于本发明的各种实施方式的趋化因子。优选地，化学合成趋化因子，因为这有助于修饰和标记等。然而，根据需要，还可以与适当的标记和修饰技术结合来使用基于重组DNA的方法。因此，在某些实施方式中，本发明还提供了核酸分子，其编码本发明的各种实施方式的趋化因子。在其他实施方式中，本发明还涉及包含该核酸分子的载体以及包含该载体的宿主细胞。载体可以另外包含可操作地连接于核酸分子的适宜的启动子，以促进相应的mRNA分子的转录。通过编码本发明各种实施方式的趋化因子的核酸分子的转录和翻译，宿主细胞可以能够表达蛋白质。
[0158]可以通过本领域中已知的方法(如W000/50088A2所述，其全部内容以引用方式结合于本文)，来生物素化可用于本发明的各种实施方式的趋化因子。如上面所指出的，本发明的各种实施方式的趋化因子的位点特异性标记是优选的，虽然可以采用并不显著影响趋化因子的受体结合能力的任何标记技术。各种位点特异性地生物素化趋化因子和天然趋化因子是市售的，例如来自Almac, Craigavon, UK。在【具体实施方式】中,通过间隔基团来生物素化一种或多种趋化因子。可以使用间隔物来防止生物素基团影响趋化因子的活性，尤其是趋化因子与其同源受体结合。在本发明的各种实施方式中，可以采用任何适宜的间隔物，其促进趋化因子的受体结合性能的保留。因此，在以上描述的【具体实施方式】中，在适当的情况下，可以采用不同于PEG间隔物的间隔物。在【具体实施方式】中，间隔物是聚乙二醇(PEG)间隔物。已表明，PEG是有效间隔物，其允许生物素连接于趋化因子(然后可以通过与链霉亲合素相互作用，将其固定在固体载体上)而没有损害受体结合能力。
[0159]在本发明的各种实施方式的情况下，术语“抗体”包括所有免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，其对于相关的趋化因子受体具有特异性结合亲和力(包括例如但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、它们的组合、以及在任何脊椎动物，例如，在哺乳动物如人类、山羊、兔和小鼠中的免疫反应期间产生的类似分子)。可用于本发明的各种实施方式的具体免疫球蛋白包括IgG同种型。可用于本发明的各种实施方式的抗体可以是单克隆或多克隆来源，但通常是单克隆抗体。抗体可以是人抗体、非人抗体、非人抗体的人源化形式、或嵌合抗体。用于抗体人源化的各种技术是众所周知的并且可以采用任何适宜的技术。术语“抗体”还指多肽配体，该多·肽配体至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区，其特异性地识别和结合抗原的表位，并且它延伸到保留特异性地结合于相关趋化因子受体能力的所有抗体衍生物和片段。这些衍生物和片段可以包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、单链抗体、单域抗体、Fe片段等。术语抗体包括这样的抗体，其包括重链和轻链，但还有(仅)重链抗体。在【具体实施方式】中，可以设计抗体，以对于一种以上的趋化因子受体具有特异性，例如双特异性，以允许结合于两种不同的趋化因子受体。结合于感兴趣的趋化因子受体的合适的市售抗体列于以下表1中。它们可以被标记或未标记。一般性参考文献可以参见“Antibodies a laboratory manual:By E Harlow and D Lane.pp726.Cold Spring HarborLaboratory.1988 ”,其全部内容以引用方式结合于本文。
[0160]
m-ptl [?I
CCR5PEBiolegend
【权利要求】
1.一种用于治疗癌症的方法，包括将来自患者或受试者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述固体载体包含能够特异性地结合于趋化因子受体，可选地为直接或间接固定在所述载体上的趋化因子受体CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3或CXCR5的一种或多种结合试剂，因而从所述患者或受试者的所述外周血中除去一种或多种趋化因子受体,可选地为CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3 或 CXCR5 表达细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述癌症治疗用来降低循环肿瘤细胞的水平。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述癌症治疗用来降低肿瘤转移的发生率。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述癌症是白血病。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述白血病选自慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病、AML、ALL和淋巴瘤的白血病期。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，能够特异性地结合于CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的所述结合试剂分别是 CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的激动剂或拮抗剂。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，能够特异性地结合于CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的所述结合试剂选自抗体和趋化因子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述趋化因子选自MIP-3a(CCL20)、CCL19、CCL21、CCLU CXCLlU CXCLl2, CCL25 (TECK)、CCL27 (CTACK)、CCL28 (MEC)、CXCL9 (MIG)、CXCLlO(IPlO)、CXCL13(BCA-1)、CCL17(TARC)和 CCL22(MDC)。·
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述趋化因子是MIP-3ci(CCL20)，可选地其中所述趋化因子受体是CCR6。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述趋化因子是CCL19(MIP-3b)或CCL21(SLC)。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述趋化因子受体是CCR7。
12.根据权利要求8所述的方法，其中，所述趋化因子是CXCL12(SDF-1a)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述趋化因子受体是CXCR4。
14.根据权利要求8所述的方法，其中，所述趋化因子是CCLl(1-309)，可选地其中所述趋化因子受体是CCR8。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述趋化因子受体是CCR4，可选地其中所述趋化因子是MDC。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述癌症是白血病以及所述细胞是CCR7表达B细胞，或其中所述癌症可选地是PC或UBC以及所述细胞是CCR4表达调节性T细胞，或其中所述 CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3 或 CXCR5表达细胞选自肿瘤细胞、中央记忆T淋巴细胞和调节性T淋巴细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述CCR5、CCR6或CXCR4表达细胞是肿瘤细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述CXCR4表达细胞是肺肿瘤细胞。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述CCR7表达细胞是中央记忆T淋巴细胞。
20.根据权利要求16所述的方法，其中，所述CCR8或CCR4表达细胞是调节性T淋巴细胞。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，基于在获自所述患者或受试者的样品中检测到 CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5表达细胞中的一种或多种的水平增加，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5中的一种或多种的表达水平增加，和/或具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3或CXCR5中的一种或多种的高表达的细胞水平增加，选择所述患者或受试者以进行治疗。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在单次治疗中，将约20-90%所述患者的血液施加于所述柱。
23.—种结合试剂，能够特异性地结合于趋化因子受体，可选地为趋化因子受体CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5，用于治疗癌症，其中所述结合试剂固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对所述柱施加来自患者的外周血，从而从所述患者的所述外周血中除去趋化因子受体，可选地为CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 表达细胞。
24.根据权利要求23所述的结合试剂，其中，所述癌症治疗用来降低循环肿瘤细胞的水平。
25.根据权利要求23或24所述的结合试剂，其中，所述癌症治疗用来降低肿瘤转移的发生率。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的结合试剂，其中，所述癌症是白血病。
27.根据权利要求26所述的结合试剂，其中，所述白血病选自慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病、AML、ALL和淋巴瘤的白血病期。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的结合试剂，其中，能够特异性地结合于CCR7、CCR5、 CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的所述结合试剂分别是所述 CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3 或 CXCR5 的激动剂或拮抗剂。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的结合试剂，其中，能够特异性地结合于CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的所述结合试剂选自抗体和趋化因子。
30.根据权利要求29所述的结合试剂，其中，所述趋化因子选自MIP-3a(CCL20)、CCL19、CCL21、CCLU CXCLlU CXCL12、CCL25 (TECK)、CCL27 (CTACK)、CCL28 (MEC)、CXCL9(MIG)、CXCLlO(IPlO)、CXCL13(BCA-1)、CCL17(TARC)和 CCL22(MDC)。
31.根据权利要求30所述的结合试剂，其中，所述趋化因子是MIP-3ci(CCL20)，以及可选地所述趋化因子受体是CCR6。
32.根据权利要求29所述的结合试剂，其中，所述趋化因子是CCL19(MIP-3b)或CCL21(SLC)。
33.根据权利要求32所述的结合试剂，其中，所述趋化因子受体是CCR7。
34.根据权利要求29所述的结合试剂，其中，所述趋化因子是CXCL12(SDF-1a)。
35.根据权利要求23至29中任一项所述的结合试剂，其中，所述趋化因子受体是CXCR4。
36.根据权利要求29所述的结合试剂，其中，所述趋化因子是CCLl(1-309)，可选地其中所述趋化因子受体是CCR8。
37.根据权利要求23至29中任一项所述的结合试剂，其中，所述趋化因子受体是CCR4，可选地其中所述趋化因子是MDC。
38.根据权利要求23至27中任一项所述的结合试剂，其中，所述癌症可选地是PC或UBC以及所述细胞是CCR4表达调节性T细胞，或其中所述CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3或CXCR5表达细胞选自肿瘤细胞、中央记忆T淋巴细胞和调节淋巴细胞。
39.根据权利要求38所述的结合试剂，其中，所述CCR5、CCR6或CXCR4表达细胞是肿瘤细胞。
40.根据权利要求39所述的结合试剂，其中，所述CXCR4表达细胞是肺肿瘤细胞。
41.根据权利要求38所述的结合试剂，其中，所述CCR7表达细胞是中央记忆T淋巴细胞。
42.根据权利要求38所述的结合试剂，其中，所述CCR8或CCR4表达细胞是调节性T淋巴细胞。
43.根据权利要求23至42中任一项所述的结合试剂，其中，基于在获自所述患者的样品中检测到 CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3 或 CXCR5 表达细胞的水平增加，CCR7、CC·R5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5的表达水平增加，和 / 或具有 CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的高表达的细胞水平增加，选择所述患者以进行治疗。
44.根据权利要求23至43中任一项所述的结合试剂，其中，在单次治疗中，将20-90%所述患者的血液施加于所述柱。
45.一种用于诊断、监测癌症的进展、或监测癌症治疗的方法，包括在获自受试者的样品中确定: a)趋化因子受体CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或CXCR5表达细胞的一种或多种的水平； b)CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的一种或多种的表达水平；和/或 c)具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的一种或多种的高表达的细胞水平，
其中，(:0?7、(:0?5、(:0?6、(:0?8、0父0?4、0父0?7、(:0?4、(:0?9、(:0?10、0父0?3 或 CXCR5 表达细胞的一种或多种的高水平，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达水平，或具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的高水平，或与对照相比CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 表达细胞的一种或多种的增加水平，与对照相比 CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或CXCR5的一种或多种的增加的表达水平，或与对照相比具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的增加水平，表明癌症的存在或进展。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述癌症或癌症治疗选自降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从所述外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及治疗淋巴瘤的白血病期。
47.根据权利要求45或46中任一项所述的方法，其中，所述样品是外周血样品，可选地其中所述细胞是CCR7表达B细胞或CCR4表达调节性T细胞。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的较高水平，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的一种或多种的较高表达水平，和 / 或具有 CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的较高水平，与更活动性的疾病相关。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的方法，其中，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的较低水平，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的一种或多种的较低表达水平，和 / 或具有 CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的较低水平，与缺少活动性疾病或较低活动性疾病相关。
50.根据权利要求45至49中任一项所述的方法，其中，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的降低水平，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的一种或多种的降低表达水平，和 / 或具有 CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5的闻表达的细胞的降低水平，与成功治疗相关。·
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述治疗如在权利要求1至22中任一项所述。
52.根据权利要求45至51中任一项所述的方法，其中，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5表达细胞的一种或多种的增加水平，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的一种或多种的增加表达水平，和 / 或具有 CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的增加水平，表示疾病的进展。
53.一种用于选择癌症的适当治疗的方法，包括在获自受试者的样品中确定 a)趋化因子受体CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或CXCR5表达细胞的一种或多种的水平 b)CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的一种或多种的表达水平；和/或 c)具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 的一种或多种的高表达的细胞水平， 其中，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3 或 CXCR5 表达细胞的一种或多种的高水平，CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCRlO、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达水平，或具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的高水平，或与对照相比CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3 或 CXCR5 表达细胞的一种或多种的增加水平，与对照相比 CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的增加表达水平，或与对照相比具有CCR7、CCR5、CCR6、CCR8、CXCR4、CXCR7、CCR4、CCR9、CCR10、CXCR3或CXCR5的一种或多种的高表达的细胞的增加水平，导致选择如在权利要求1至22中任一项所限定的治疗，用于治疗所述癌症。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述治疗包括降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从所述外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于急性髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及用于治疗淋巴瘤的白血病期。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述样品是外周血样品，可选地其中所述细胞是CCR7表达B细胞或CCR4表达调节性T细胞。
56.一种用于治疗癌症的方法，包括将来自患者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述固体载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在所述载体上的一种或多种调节性T细胞受体，尤其是皮肤淋巴细胞抗原(CLA)受体的一种或多种结合试剂，从而从所述患者的所述外周血中除去一种或多种调节性T细胞受体-表达细胞(Tregs)。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述一种或多种受体包括趋化因子受体，可选地其中所述趋化因子受体包括CCR4和/或CCR8。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述癌症是胰腺癌或膀胱癌，可选地其中从所述患者的所述外周血中除去CCR4表达Tregs。
59.根据权利要求56至58中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种结合试剂选自CCL17 和 CCL22 (结合于· CCR4)或 CCLl (结合于 CCR8)。
60.一种用于治疗白血病的方法，包括将来自患者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述固体载体包含能够特异性地结合于一种或多种趋化因子受体的一种或多种结合试剂，所述趋化因子受体已被确定为连接于白血病，例如在白血病中被上调，直接或间接固定在所述载体上，因而从所述患者的所述外周血中除去一种或多种趋化因子受体表达细胞。
61.根据权利要求56至60中任一项所述的方法，进一步结合根据权利要求1至55中任一项所述的特征。
62.—种加载有固体载体的成分血分离柱，所述固体载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在所述载体上的趋化因子受体的结合试剂，以允许从患者的所述外周血中除去表达所述趋化因子受体的细胞，其中所述结合试剂不是趋化因子。
63.根据权利要求62所述的柱，其中，能够特异性地结合于所述趋化因子受体的所述结合试剂是所述趋化因子受体的激动剂或拮抗剂。
64.根据前述权利要求中任一项所述的柱，其中，能够特异性地结合于所述趋化因子受体的所述结合试剂选自抗体和化合物。
65.根据前述权利要求中任一项所述的柱,如由权利要求1至61中的任何一个或多个特征所进一步限定。
66.—种用于治疗炎性病症的方法，包括将来自患者的外周血施加于如在权利要求62至65中任一项所限定的成分血分离柱，从而从所述患者的所述外周血中除去趋化因子受体表达细胞。
67.根据权利要求66所述的方法，如由权利要求1至61中的任何一个或多个特征所进一步限定。
68.一种能够特异性地结合于趋化因子受体用于治疗炎性病症的结合试剂，其中，所述结合试剂固定在包含如在权利要求62至65中任一项所述的成分血分离柱内的固体载体上，对所述成分血分离柱施加来自患者的外周血，从而从所述患者的所述外周血中除去趋化因子受体表达细胞。
69.根据权利要求68所述的结合试剂，如由权利要求1至61中的任何一个或多个特征所进一步限定。
70.一种修饰CCL8 (MCP-2)趋化因子，包含提出为SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
71.根据权利要求70所述的修饰CCL8趋化因子，其中，在SEQID NO:1的位置75处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
72.根据权利要求71所述的修饰CCL8趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3，6-二氧氨基辛酸。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的修饰CCL8趋化因子，包含SEQID NO:3的氨基酸序列。
74.根据权利要求·70至73中任一项所述的修饰CCL8趋化因子，其是CCR5活性的激动剂或拮抗剂。
75.一种修饰CCL5趋化因子，包含提出为SEQ ID NO:6或4的氨基酸序列。
76.根据权利要求75所述的修饰CCL5趋化因子，其中，在位置67处的残基被生物素化。
77.根据权利要求75或76所述的修饰CCL5趋化因子，其包含SEQIDNO:6的氨基酸序列。
78.根据权利要求75至77中任一项所述的修饰CCL5趋化因子，其是CCR5活性的激动剂或拮抗剂。
79.一种修饰CCL20趋化因子，包含提出为SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
80.根据权利要求79所述的修饰CCL20趋化因子，其中，在位置68处的氨基酸残基被生物素化，可选地通过间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
81.根据权利要求80所述的修饰CCL20趋化因子，其中，在SEQID NO:9的位置68处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
82.根据权利要求81所述的修饰CCL20趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3，6-二氧氨基辛酸。
83.根据权利要求79至82中任一项所述的修饰CCL20趋化因子，其是CCR6活性的激动剂或拮抗剂。
84.一种截短的CXCL12趋化因子，包含提出为SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。
85.根据权利要求84所述的截短的CXCL12趋化因子，其中，在位置64处的残基被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
86.根据权利要求85所述的截短的CXCL12趋化因子，其中，在位置64处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化。
87.根据权利要求84至86中任一项所述的截短的CXCL12趋化因子，其是CXCR4和/或CXCR7活性的激动剂或拮抗剂。
88.一种修饰CCL22趋化因子，包含提出为SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。
89.根据权利要求88所述的修饰CCL22趋化因子，其中，在位置66处的氨基酸残基被生物素化，可选地通过间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
90.根据权利要求89所述的修饰CCL22趋化因子，其中，在位置66处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
91.根据权利要求90所述的修饰CCL22趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3，6-二氧氨基辛酸。
92.根据权利要求88至91中任一项所述的修饰CCL22趋化因子，其是CCR4活性的激动剂或拮抗剂。
93.一种修饰CCL17趋化因子，包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。
94.根据权利要求93所述的修饰CCL17趋化因子，其中，在SEQID NO: 16的位置72处的氨基酸残基被生物素化，可选地通过间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。·
95.根据权利要求93所述的修饰CCL17趋化因子，其中，在SEQID NO: 16的位置72处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
96.根据权利要求95所述的修饰CCL17趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3，6-二氧氨基辛酸。
97.根据权利要求94至96中任一项所述的修饰CCL17趋化因子，包含SEQID NO: 18的氨基酸序列。
98.根据权利要求94至97中任一项所述的修饰CCL17趋化因子，其是CCR4活性的激动剂或拮抗剂。
99.一种修饰CCL19趋化因子，包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。
100.根据权利要求99所述的修饰CCL19趋化因子，其中，在SEQID NO: 19的位置78处的氨基酸残基被生物素化，可选地通过间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
101.根据权利要求100所述的修饰CCL19趋化因子，其中，在SEQID NO: 19的位置78处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
102.根据权利要求101所述的修饰CCL19趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3，6-二氧氨基辛酸。
103.根据权利要求99至102中任一项所述的修饰CCL19趋化因子，包含SEQID NO:21的氨基酸序列。
104.根据权利要求99至103中任一项所述的修饰CCL19趋化因子，其是CCR7活性的激动剂或拮抗剂。
105.一种修饰CXCLll趋化因子，包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
106.根据权利要求105所述的修饰CXCLll趋化因子，其中，通过间隔基团添加在位置74处的残基。
107.根据权利要求105或106所述的修饰趋化因子，其中，通过聚乙二醇(PEG)间隔基团添加在位置74处的残基。
108.一种修饰CXCLll趋化因子，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
109.根据权利要求105至108中任一项所述的修饰CXCLll趋化因子，其中，在位置74处的氨基酸残基被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
110.根据权利要求109所述的修饰CXCLll趋化因子，其中，生物素化是通过间隔基团。
111.根据权利要求105至110中任一项所述的修饰CXCLll趋化因子，其是CXCR7活性的激动剂或拮抗剂。
112.一种用于诊断、监测癌症的进展、或用于监测癌症治疗的方法，包括在获自受试者的样品中确定 a)一种或多种Treg受体表达细胞，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平； b)一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平；和/或 c)具有一种或多 种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8，的高表达的细胞水平， 其中，一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的高水平，一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达水平，或具有一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的高水平，或与对照相比一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的增加水平，与对照相比一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的增加表达水平，或与对照相比具有一种或多种Treg受体尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的增加水平，表明癌症的存在或进展。
113.根据权利要求112所述的方法，其中，所述癌症或癌症治疗选自降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从所述外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病、慢性髓样白血病，用于AML、ALL的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及治疗淋巴瘤的白血病期。
114.根据权利要求112或113所述的方法，其中，所述样品是外周血样品，可选地其中所述细胞是CCR7表达B细胞或CCR4表达调节性T细胞。
115.根据权利要求112至114中任一项所述的方法，其中，0^、0^4和/或0^8表达细胞的一种或多种的较高水平，CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的较高表达水平，和/或具有CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的高表达的细胞的较高水平，与更活动性的疾病相关。
116.根据权利要求112至115中任一项所述的方法，其中，CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的一种或多种的低水平，CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的低表达水平，和/或具有CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的高表达的细胞的低水平，与缺少活动性疾病或较低活动性疾病相关。
117.根据权利要求112至116中任一项所述的方法，其中，CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的一种或多种的降低水平，CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的降低表达水平，和/或具有CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的降低水平，与成功治疗相关。
118.根据权利要求117所述的方法，其中，所述治疗如在权利要求1至22中任一项所述。
119.根据权利要求112至118中任一项所述的方法，其中，CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的一种或多种的增加水平，CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的增加表达水平，和/或具有CLA、CCR4和/或CCR8的一种或多种的高表达的细胞的增加水平，表示疾病的进展。
120.一种用于选择癌症的适当治疗的方法，包括在获自受试者的样品中确定: a)一种或多种Treg受体表达细胞，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的水平 b)一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的表达水平；和/或 c)具有一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞水平， 其中，一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的高水平，一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达水平，或具有一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的高水平，或与对照相比一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8表达细胞的增加水平，与对照相比一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的增加表达水平，或与对照相比具有一种或多种Treg受体，尤其是CLA、CCR4和/或CCR8的高表达的细胞的增加水平，导致选择如在权利要求1至22中任一项所限定的治疗，用于治疗所述癌症。
121.根据权利要求1·20所述的方法，其中，所述治疗包括降低循环肿瘤细胞的水平，降低肿瘤转移的发生率，从所述外周血中除去调节性T淋巴细胞，或治疗白血病如慢性淋巴性白血病，慢性髓样白血病，用于急性髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)的减体治疗，在收获前用于自体骨髓/干细胞移植，以及用于治疗淋巴瘤的白血病期。
122.根据权利要求120或121所述的方法，其中，所述样品是外周血样品，可选地其中所述细胞是CCR7表达B细胞或CCR4表达调节性T细胞。
123.—种修饰CCL27趋化因子，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
124.根据权利要求123所述的修饰CCL27趋化因子，其中，在位置87处的氨基酸残基被生物素化，可选地通过间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
125.根据权利要求124所述的修饰CCL27趋化因子，其中，在位置87处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
126.根据权利要求125所述的修饰CCL27趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3，6-二氧氨基辛酸。
127.根据权利要求123至126中任一项所述的修饰CCL27趋化因子，包含SEQIDNO: 31的氨基酸序列。
128.根据权利要求123至127中任一项所述的修饰CCL27趋化因子，其是CCRlO活性的激动剂或拮抗剂。
129.—种修饰CXCLlO趋化因子，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
130.根据权利要求129所述的修饰CXCLlO趋化因子，其中，通过间隔基团添加在位置78处的残基。
131.根据权利要求129或130所述的修饰趋化因子，其中，通过聚乙二醇(PEG)间隔基团添加在位置78处的残基。
132.根据权利要求131所述的修饰CXCLlO趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3，6-二氧氨基辛酸。
133.根据权利要求129至132中任一项所述的修饰CXCLlO趋化因子，其中，在位置78处的残基被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
134.根据权利要求129至133中任一项所述的修饰CXCLlO趋化因子，其中，在位置78处的残基包括PEG-K-生物素。
135.根据权利要求129至134中任一项所述的修饰CXCLlO趋化因子，其是CXCR3活性的激动剂或拮抗 剂。
【文档编号】A61M1/36GK103857421SQ201280039666
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年6月13日 优先权日:2011年6月13日
【发明者】格雷厄姆·科顿, 奥拉·温奎斯特 申请人:Ith免疫治疗控股股份公司