治疗与代谢综合征相关的病症的制作方法
【专利摘要】一种用于治疗与代谢综合征相关的病症或用于治疗痛性肥胖症(AD)的方法，包括将来自患者或受试者的外周血施加于载有固体载体的成分血分离柱（apheresis?column），该载体包含能够特异性地结合于趋化因子受体的一种或多种结合试剂，可选地直接或间接固定在载体上的趋化因子受体CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5，从而由患者或受试者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体，可选地CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞。还描述了各种伴随诊断方法以及有用的结合试剂。
【专利说明】治疗与代谢综合征相关的病症
【技术领域】
[0001]本发明的各种实施方式涉及用于治疗炎性病症的产品和方法，如与代谢综合征相关的病症，尤其是糖尿病、肥胖症、胰岛素抗性、增加的血清三酰基甘油浓度和高血压。本发明还涉及用于治疗痛性肥胖症的产品和方法。还描述了伴随诊断。
【背景技术】
[0002]国际糖尿病基金会(IDF)定义代谢综合征如下:
[0003]对于被定义为患有代谢综合征的人员而言，他们必须具有:
[0004]中心性肥胖(对于欧洲男性(Europid man)定义为腰围≥94cm,以及对于欧洲女性(Europid woman) ≥80cm,并且针对其他组为种族特异性数值)
[0005]加上以下4种因素的任何两种:
[0006]?升高的甘油三酯(TG)水平:≥150mg/dL(l.7mmol/L)，或针对这种脂质异常的特异性治疗
[0007].降低的高密度脂蛋白(HDL)胆固醇:在男性中<40mg/dL(l.03mmol/L*)，以及在女性中<50mg/dL(l.29mmol/L*)，或针对这种脂质异常的特异性治疗
[0008].升高的血压(BP):收缩BP≥130或舒张BP≥85mm Hg,或先前诊断的高血压的治疗
[0009].升高的空腹血糖(FPG)≥100mg/dL(5.6mmol/L)，或先前诊断的2型糖尿病
[0010]如果高于5.6mmol/L或100mg/dL，则强烈推荐口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，但并不必须限定所述综合征的存在。
[0011]虽然代谢综合征的发病机制及其元件的每一种是复杂的并且并未很好地了解，但中心性肥胖和胰岛素抗性被认为是重要的致病因素。
[0012]痛性肥胖症或德卡姆病是罕见的进行性病症，其特征在于通常发生于肥胖的、绝经后妇女的多发性、痛性、皮下脂肪瘤(Dercum FX.Three cases of a hithertounclassified affection resembling in its grosser aspects obesity, but associatedwith special symptoms:adiposis dolorosa.Am J Med Scil892; 104:521-35，全部内容以引用方式结合于本文)。
[0013]成分血分离(apheresis)是用于清除血液成分,如抗体、低密度脂蛋白(LDL)和血细胞的治疗方法。白细胞去除法是成分血分离治疗方法，其用于除去白细胞(white bloodcell)(白血球，leukocyte)。将患者连接于体外血液循环系统，从一个臂的静脉抽取血液，通过柱装置，然后返回至患者的另一个臂。W02010/029317描述了成分血分离柱，其可用于治疗炎性病症，包括固定在固体载体上的趋化因子。
【发明内容】
[0014]趋化因子是一类细胞因子分子，其涉及在炎症中的细胞募集和激活。趋化因子引起在免疫系统中细胞的各种亚群的趋化性和激活。主要通过紧密结合于它们在白细胞表面上的受体来介导趋化因子的活性。在某些实施方式中，本发明是基于认识到，在趋化因子和表达它们的受体的细胞之间的相互作用可以用来治疗与代谢综合征相关的特定炎性病症。尤其是，与代谢综合相关征的各种病症，如糖尿病，尤其是2型糖尿病，、肥胖症、胰岛素抗性、增加的血清三酰基甘油浓度和高血压包括炎性成分。本发明的发明人已确定,将增加募集的特定的趋化因子受体表达细胞靶向炎症部位可以提供新的治疗方式来治疗所述疾病。此外，在所述疾病中，可以增加每种细胞上的趋化因子受体表达，从而再次提供用来治疗所述疾病的治疗方式。痛性肥胖症(AD)或德卡姆病(Dercum’s disease)是罕见的进行性病症，其特征在于多发性、痛性、皮下脂肪瘤，其通常发生于肥胖的、绝经后妇女(DercumFX.Three cases of a hitherto unclassified affection resembling in its grosseraspects obesity, but associated with special symptoms: adiposis dolorosa.Am J MedScil892; 104:521-35，全部内容以引用方式结合于本文)。按照本发明，可以治疗和诊断AD，可选地作为与代谢综合征相关的病症。本文中表明，在AD患者中，CCR2表达白细胞尤其是B淋巴细胞的水平增加。本文中表明，在AD患者中，CCRl表达单核细胞的水平增加。按照本发明，这提供了用于白细胞去除法治疗和诊断的靶。 [0015]本文还表明，利用适宜的趋化因子如MCP-1 (CCL2)，尤其是生物素化MCP-1，可以从糖尿病患者体内清除促炎性CCR2表达单核细胞(如巨噬细胞)。这为发炎组织，如脂肪组织和肝组织，提供了机会来治愈和帮助防止胰岛素抗性的发展。此外，本文中表明，在糖尿病患者中，CCR4和CCR5表达白细胞尤其是T淋巴细胞的水平增加，并且可以根据本发明的各种实施方式加以清除。
[0016]因此，在某些实施方式中，本发明用来降低炎性白细胞(其以增加的水平表达特征性趋化因子受体，以及有可能表达特征性趋化因子受体)募集到与疾病相关联的炎症部位，如糖尿病，尤其是2型糖尿病、肥胖症、胰岛素抗性、增加的血清三酰基甘油浓度、高血压和AD。这是利用特异性结合试剂从患者中捕捉特定的趋化因子受体表达炎性白细胞来实现。因此，在某些实施方式中，在第一方面，本发明提供了用于治疗与代谢综合征相关病症的方法，该方法包括将来自患者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在载体上的一种或多种趋化因子受体，尤其是趋化因子受体CCR2、CCRU CCR3、CCR4和/或CCR5的一种或多种结合试剂，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体，尤其是一种或多种CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞。然后可以将从其中已除去趋化因子受体表达细胞的外周血返回至患者以完成治疗。因此，在一些实施方式中，本发明可以依靠连续体外回路。可替换地，在某些实施方式中，本发明可以包括以下步骤:从患者体内获得外周血，将外周血施加于柱，随后将从其中已除去趋化因子受体表达细胞的外周血返回至患者。
[0017]在某些实施方式中，本发明还提供了用于治疗痛性肥胖症(AD)的方法，该方法包括将来自患者的外周血施加于加载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在载体上的一种或多种趋化因子受体，尤其是趋化因子受体CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和/或CCR5的一种或多种结合试剂，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体，尤其是一种或多种0^2、0^1、0^3、0^4和0^5表达细胞的。然后可以将从其中已除去趋化因子受体表达细胞的外周血返回至患者以完成治疗。因此，在一些实施方式中，本发明可以依靠连续体外回路。可替换地，在某些实施方式中，本发明可以包括以下步骤:从患者体内获得外周血，将外周血施加于柱，随后将从其中已除去趋化因子受体表达细胞的外周血返回至患者。【具体实施方式】靶向CCR2表达细胞，尤其是CCR2表达B细胞。
[0018]如本文所述，可以直接或间接地，将适宜的结合试剂固定在固体载体上，以产生适用于捕捉相关趋化因子受体表达细胞的成分血分离柱。在观测到增加水平的趋化因子受体表达的情况下，可以利用本发明的各种实施方式的柱，从外周血中优选地除去所述细胞。因此，本发明的各种实施方式的方法可以优选靶向如本文定义的一种或多种CCR2h1、CCRlhi,CCR3h1、CCR4hi和CCR5hi细胞，以从外周血中除去。可以按照标准流式细胞术技术来确定“高”表达。可以相对于在取自健康受试者的细胞中的趋化因子受体的表达水平来测量所述水平。附图15提供了选通策略的一个实例。
[0019]在其他实施方式中，本发明进一步提供了结合试剂，其能够特异性地结合于一种或多种趋化因子受体，尤其是特异性地结合于趋化因子受体/趋化因子受体CCR2、CCRUCCR3、CCR4和/或CCR5，用于治疗与代谢综合征相关的病症，其中将一种或多种结合试剂直接或间接地固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对所述载体施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体/CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和/或CCR5表达细胞。在某些实施方式中，本发明还提供了一种或多种结合试剂的应用，所述结合试剂能够特异性地结合于趋化因子受体/趋化因子受体CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和/或CCR5，用于制造成分血分离柱，用于治疗与代谢综合征相关的病症，其中将一种或多种结合试剂固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对其施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体/CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和/或CCR5表达细胞。
[0020]类似地，本发明的各种实施方式进一步提供了结合试剂，其能够特异性地结合于一种或多种趋化因子受体，尤其是特异性地结合于趋化因子受体/趋化因子受体CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和/或CCR5，用于治疗AD，其中将一种或多种结合试剂直接或间接固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对其施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体/CCR2、CCRU CCR3、CCR4和/或CCR5表达细胞。本发明还提供了一种或多种结合试剂的应用，所述结合试剂能够特异性地结合于趋化因子受体/趋化因子受体CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和/或CCR5，用于制造成分血分离柱，用于治疗AD，其中将一种或多种结合试剂固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对其施加来自患者的外周血，从而从患者的外周血中除去一种或多种趋化因子受体/CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和/或CCR5表达细胞。
[0021]针对本发明的各种实施方式的治疗方法所讨论的所有实施方式适用于这些方面(在细节上作必要的修改)并且为简洁起见并不再重`复。因此，参照治疗方法进行的以下讨论也适用于本发明的各种实施方式的医疗应用方面。
[0022]在某些实施方式中，本发明旨在治疗与代谢综合征相关的各种特定病症。代谢综合征表示一组危险因素，其一起发生并增加冠状动脉病、卒中、和2型糖尿病的风险。通常，综合征的风险因素与肥胖症相关。两个最重要的风险因素是中心性肥胖和胰岛素抗性。在这种情况下，根据本发明，脂肪组织炎症和其他炎性损伤，如针对器官，是治疗的中心靶。按照本发明的方法，可以治疗包括炎性成分的任何相关病症。包括炎性成分的特定病症可以选自糖尿病，尤其是2型糖尿病、肥胖症、胰岛素抗性、增加的血清三酰基甘油浓度和高血压。还可以治疗AD，如本文讨论的。
[0023]治疗是指，在患者的外周血中减少特定的趋化因子受体表达细胞。减少可以包括减少细胞，在患者中其以增加的水平表达趋化因子受体，尤其是一种或多种CCR2、CCRUCCR3、CCR4和CCR5。患者通常是人类患者，但术语患者可以包括人和非人动物受试者(在一些实施方式中)。在本发明的各种实施方式的情况下，这通常涉及在患者的外周血中减少一种或多种 CCR2、CCR1、CCR3、CCR4 和 CCR5 表达细胞的，如一种或多种“CCR2h1、CCRlh1、CCR3h1、CCR4hi和CCR5hi “表达细胞。在某些实施方式中CCR2、CCRl、CCR3、CCR4或CCR5表达细胞包含单核细胞、巨噬细胞和/或淋巴细胞，尤其是T淋巴细胞、基本上由其组成或由其组成。可以特异性地靶向CCR2表达单核细胞，如巨噬细胞，用于治疗糖尿病。可以特异性地靶向CCR4和CCR5表达白细胞尤其是T淋巴细胞，用于治疗糖尿病患者。在AD治疗的情况下，B淋巴细胞减少可以尤其是相关的。可以靶向CCR2表达B细胞。通过靶向CCRl表达单核细胞,还可以治疗AD。
[0024]单核细胞是通过骨髓由造血干细胞前体产生，称作成单核细胞。单核细胞可以分化成巨噬细胞或树状细胞。单核细胞以及它们的巨噬细胞和树状细胞子代在免疫系统中担任许多功能，包括吞噬作用、抗原呈递和细胞因子生产。可以参照细胞表面标志物⑶14的表达，可选地连同⑶16—起，来表征单核细胞。可以通过⑶14细胞表面受体(⑶14++⑶16-单核细胞)的高水平表达来表征经典的单核细胞。可以通过⑶14的低水平表达和⑶16受体(⑶14+⑶16++单核细胞)的另外的同时表达来表征非经典的单核细胞。可以通过⑶14的高水平表达和⑶16 (⑶14++⑶16+单核细胞)的低水平表达来表征中间单核细胞。巨噬细胞源自单核细胞并且负责保护组织免受外来物质。它们的这样的细胞，其具有较大的光滑核、大面积的细胞质和用于处理外来物质内部囊泡。术语“巨噬细胞”可以指单核细胞衍生的细胞，其表达以下细胞表面标志的一种或多种:⑶14、⑶lib、溶菌酶M、MAC-1/MAC-3和⑶68。术语巨噬细胞包括活化和未活化巨噬细胞。可以通过一种或多种CD69、ENG、FCER2和IL2RA、HLA-DR、CD86的表达来表征活化巨噬细胞。未活化巨噬细胞还未收到激活信号，通过例如TLR受体，因而它们在细胞表面上表达较少激活标志，这与较少成熟相关。可以通过一种或多种CD16+C`D32+CD64+和分泌物主要为IL-23和IL_1、TNF、IL_6的表达以及IL-12和另外效应分子如iNOS和ROI的高水平，来表征Ml巨噬细胞。相对于M2巨噬细胞，Ml巨噬细胞具有细胞毒性特征。可以通过一种或多种SRA/B+CD163+MR+⑶14+的表达来表征M2巨噬细胞并表达TGFP、IL-10和IL_lRa。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和M2巨噬细胞共享许多特征并且被认为是M2极化巨噬细胞。在单核细胞亚群中也可以发现MVM2形式，其中⑶14+CD16TXC3R1低单核细胞被认为是“炎性，，亚群以及⑶14低⑶16+CXC3R1高是“常驻(resident)”单核细胞。
[0025]淋巴细胞的三种主要类型是T细胞、B细胞和天然杀伤(NK)细胞。术语“T淋巴细胞”包括CD4+T细胞如辅助T细胞(Thl细胞和Th2细胞)，和CD8+T细胞如细胞毒性T细胞。可以通过CCR5的表达和/或通过IFN-Y的生产来表征Thl细胞。可以通过CCR3的表达和/或IL-4的生产来表征Th2细胞。
[0026]表达在这些上述细胞上的CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5结合于趋化因子如单核细胞化学吸引物蛋白质-1 (MCP-1、CCL2)或CCL5。MCP-1是单核细胞和记忆T细胞的主要化学吸引物，通过它们结合于它的特异性细胞表面受体，CC-趋化因子受体-2。CCL5是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C-C基序)配体5的基因符号，还称为RANTES。该基因的HGNC ID是10632。该基因位于染色体位置17qll.2_ql2处。该基因的先前的符号和名称是D17S136E、SCYA5、〃小的可诱导的细胞因子A5 (RANTES) 〃。该基因的同义词包括〃 β -趋化因子RANTES"、MGC17164、RANTES、〃激活后调节的、正常T表达的、和推测分泌的〃、"SIS- δ 〃、SISd、〃小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员5〃、〃T细胞特异性蛋白ρ288〃、〃Τ细胞特异性RANTES蛋白质〃、和TCP228。CCL5的Genbank参考序列是AF043341.1。RANTES 结合于 CCR1、CCR3 或 CCR5。
[0027]CCRl是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)受体I的基因符号。该基因的HGNC ID是1602。该基因位于染色体位置3p21处。先前的符号和名称是CMKBRl、SCYARl。该基因的同义词包括 CD191、CKR_1、MIP1 a R。CCRl 的 Entrez Gene 参考序列是如于2011年6月13日可获得的1230，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0028]CCR2是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)受体2的基因符号。该基因的HGNC ID是1603。该基因位于染色体位置3p21处。该基因的先前的符号和名称是 CMKBR2。该基因的同义词包括 CC-CKR-2、CD192、CKR2、FLJ78302、MCP-1-R。NCBI参考序列是如于2011年6月13日可获得的NM_001123041.2，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0029]CCR3是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)受体3的基因符号。该基因的HGNC ID是1604。该基因位于染色体位置3p21.3处。该基因的先前的符号和名称是CMKBR3。该基因的同义词包括CC-CKR-3、CD193和CKR3。CCR3的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的AF247361.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0030]CCR5是由HUGO基 因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)受体5的基因符号。该基因的HGNC ID是1605。该基因位于染色体位置3p21处。该基因的先前的符号和名称是CMKBR5。该基因的同义词包括CC-CKR-5、CD195CKR-5、IDDM22和CKR5。CCR5的Entrez Gene参考序列是如于2011年6月13日可获得的1234，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0031]CCR4是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)受体4的基因符号。该基因的HGNC ID是1605。该基因位于染色体位置3p24_p21.3处。该基因的同义词包括 CC-CKR-4、CD194、ChemRl3, CKR4、CMKBR4、k5_5。CCR4 的 Genbank 参考序列是如于2011年6月13日可获得的X85740.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0032]除基于结合于CCR2、CCRU CCR3、CCR4或CCR5的除去以外，本发明的方法的各种实施方式还可以涉及与这些另外的细胞表面标志物的任何一种或多种的特异性结合相互作用。可以制备适宜的结合试剂以特异性地结合于这些细胞表面标志。因此，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5特异性结合试剂的论述是适用的(在细节上作必要的修改)。
[0033]已经表明，在糖尿病患者中，在单核细胞上的CCR2表达升高。此外，具有MCP-1的脂肪组织特异性表达的转基因小鼠具有巨噬细胞渗透进入脂肪组织，增加的肝三酰基甘油含量和胰岛素抗性。当与高脂肪喂养的野生型小鼠比较时，高脂肪饮食喂养的MCP-1-敲除小鼠具有显著减少的巨噬细胞累积进入脂肪组织和肝脂肪变性。在db/db小鼠中和在高脂肪喂养野生型小鼠中，通过MCP-1的显性负突变体的急性表达来抑制MCP-1功能会改善胰岛素抗性。此外，增加水平的血清MCP-1与代谢综合征相关的病症相关，包括肥胖症、胰岛素抗性、2型糖尿病、高血压和增加的血清三酰基甘油浓度。本文中表明，在糖尿病受试者中，MCP-1可以用来降低CCR2-表达单核细胞水平。这对发炎组织，如脂肪组织和肝组织，提供了机会，来治愈和帮助防止胰岛素抗性的发展。本文还表明，在患有AD的受试者中，MCP-1可以用来降低CCR2表达B细胞水平。
[0034]根据本发明的各种实施方式的治疗可以导致症状的减轻或改善，进展的预防，病症的消退，完全恢复。成功治疗的可测量参数包括以下一种或多种、多达全部:中心性肥胖的减小(其可以参照腰围加以定义)，糖化/糖基化血红蛋白(HbAlC)的降低，甘油三酯的降低，葡萄糖(例如测得为FPG)的降低，或血的降低。成功治疗的可测量参数还可以包括以下一种或多种、多达全部=HDL胆固醇增加，或改善的葡萄糖耐量，其可以通过OGTT加以测量。AD的成功治疗的可测量参数可以包括疼痛症状的降低和/或皮下脂肪瘤(或脂肪沉积物)的程度和/或大小的降低。
[0035]在【具体实施方式】中，单次治疗足以引起从患者的外周血中清除约10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%、或高达80%、90%、95%或更高、或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围的，一种或多种特定的趋化因子受体，尤其是一种或多种CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞。在【具体实施方式】中，在单次治疗中，实现至少约50%的清除。因此，成功治疗可以参照清除一种或多种CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞加以定义。治疗可以导致清除约100至500百万个CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和/或CCR5表达细胞，如单核细胞(在某些实施方式中)，及更具体地讲约100、150、200、250、300、350、400、450、或500百万个CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和/或CCR5表达细胞。
[0036]通过结合于柱(通过结合试剂-趋化因子受体相互作用)来固定趋化因子受体表达细胞。这些固定的细胞表达另外未偶联的趋化因子受体，其可以具有与用于捕捉的那些趋化因子受体相同或不同的类型。这些另外的趋化因子受体可以允许从外周血中捕捉可以有助于炎性病症的循环趋化因子。因此，循环(特定)趋化因子水平的降低可以提供成功治疗的度量。
[0037]本领域技术人员可以容易确定治疗的持续时间，并且其将取决于多种因素如外周血的流速。可以将治疗的持续时间结合于监测治疗本身，其中在治疗的可测量参数已达到限定的阈值以后则认为治疗完成。如本文讨论的，可以采用任何适宜的参数。因此，例如，当已实现一种或多种CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5表达细胞减少，如一种或多种CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞减少50%时，可以认为治疗已完成。能够以约10_80mL/分钟的流率，或更具体地约20-70mL/分钟，或约30-60mL/分钟，来操作成分血分离系统。在【具体实施方式】中，进行治疗约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分钟等，或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围。治疗通常并不旨在除去在外周血中的所有表达趋化因子受体的细胞，因为那些细胞的基本水平是健康受试者所需要的。然而，已发现，仅需要将较低血液体积施加于本发明的各种实施方式的柱以实现趋化因子受体表达细胞的有效清除水平。因此，在某些实施方式中，在单次治疗中，将约10-80%或更具体地约
20、30、40或50%、或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围的患者血液施加于柱。循环通过成分血分离柱或系统的血液体积可以为约1000-3000ml，如约1000、1200、1400、1600、1800或2000ml、或在这些数量之间并且包括这些数量的数值的任何范围。在已循环该体积血液以后，可以认为治疗已完成。在每个治疗期以前，可以给予患者抗凝血剂。适宜的溶液，如无菌盐水溶液，可选地包括抗凝血剂如肝素，可以用来起动成分血分离(体外)系统。在每个治疗期开始时，可以将另外体积的抗凝血剂加入回路，例如作为推注剂。
[0038]在某些实施方式中，本发明依赖于能够特异性地结合于趋化因子受体的结合试剂。当血液通过在其上或其内固定有结合试剂的固体载体时，这种特异性结合反应允许从患者的外周血中除去表达趋化因子受体的细胞。感兴趣的特定的趋化因子受体包括CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5，尤其是CCR2。结合试剂可以是能够特异性地结合于所考虑受体的任何结合试剂。“特异性结合”是指这样的结合试剂，其显示足够的结合特异性和适当的结合亲合力/动力学，以允许从外周血中除去表达一种或多种CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的细胞。虽然并不排除结合试剂能够结合于其他分子，如其他趋化因子受体，但结合试剂将优选结合于表达一种或多种CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和CCR5的细胞，以及尤其是优选结合于表达增加水平的一种或多种CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的细胞(如本文中进一步定义的)。能够特异性地结合于CCR2、CCRl、CCR3、CCR4或CCR5的结合试剂可以分别是CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的激动剂或拮抗剂。因为疾病状态依赖于CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的表达上调或通过其发信号，所以在某些实施方式中，能够特异性地结合于CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的结合试剂分别是CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的拮抗剂。趋化因子通常是，虽然不一定单独地是(尤其是在截短或修饰形式的情况下)它们的同源受体的激动剂并且用来激活表达相关受体的细胞，如本领域技术人员应当理解的。针对相关趋化因子受体的抗体一般被认为是拮抗剂，如本领域技术人员应当理解的。结合试剂的具体实例包括蛋白质或多肽，如抗体和受体配体，尤其是趋化因子。在某些实施方式中，结合试剂可以是核酸分子。在一些实施方式中，核酸是适体。核酸适体是长度约15-40个核苷酸的多核苷酸。可以利用SELEX方法(通过指数富集来系统进化配体)或本领域技术人员已知的任何其他方法来制备核酸适体。
[0039]在其他实施方式中，结合试剂可以是肽，以及在某些情况下，为肽适体。肽适体是人工识别分子，其由插入恒定支架蛋白的可变肽序列构成(Baines IC, ColasP.Peptide aptamers as guides for small molecule drug discovery.Drug DiscovToday.2006; 11:334 - 341，以引用方式结合于本文)。许多方法，如噬菌体展示、核糖体展示和酵母菌双杂交筛选系统，可用于筛选基于潜在肽的结合剂的文库。类似地，基于结构域的蛋白质支架如纤连蛋白、锚蛋白重复序列、蛋白A、SH3结构域、脂质运载蛋白、泛素可以用作结合剂。而且，许多技术如噬菌体展示、核糖体展示可用于筛选基于蛋白质的结合剂的文库。类似地，利用本领域中已知的适宜的筛选技术，在某些实施方式中，其可以是高通量筛选，针对特异性结合于相关趋化因子受可以筛选候选化合物的文库体。可以将候选结合剂固定在固体载体上并确定结合剂特异性地保留表达感兴趣的趋化因子受体或标记趋化因子受体的细胞的能力。可以将一系列细胞类型施加于固体载体以证实结合的特异性，或可替换地，可以将混合样品(如外周血)施加于固体载体。可以证实感兴趣的细胞类型(表达适当的趋化因子受体)的保留以确定合适的结合剂。CCR-2的各种小分子拮抗剂描述于Xia M和 Sui Z 的Expert Opin Ther Pat.2009Mar;19(3):295-303-Recent developmentsin CCR2antagonists,并以 引用方式结合于本文。
[0040]在本发明的各种实施方式的情况下，术语“趋化因子”还包括生物素化或以其他方式标记的趋化因子。术语“趋化因子”还包括趋化因子的修饰和截短的形式和趋化因子片段，条件是修饰或截短的形式保留它结合于它的同源受体的能力(并因而在本发明的各种实施方式的情况下保持功能)。趋化因子不一定需要保留生物活性，因为只需要对于CCR2、CCRl、CCR3、CCR4或CCR5的特异性结合亲和力。在某些实施方式中，趋化因子缺乏生物活性，例如就(CCR2、CCRU CCR3、CCR4或CCR5)受体的激活而言。可以进行修饰以改善蛋白质合成，例如产物和产量的均匀性。如本领域技术人员已知的，示例性修饰可以包括对在趋化因子中的一种或多种氨基酸进行氨基酸添加、替代、缺失或其他修饰。修饰可以包括用非天然氨基酸如正亮氨酸(NLeu)和衍生氨基酸如焦谷氨酸(pyroGlu)来替代野生型氨基酸。可以进行所述修饰以在本发明的各种实施方式的柱的储存和使用期间使副产物形成降至最低。可以进行修饰以改善标记，例如包括聚乙二醇(PEG)间隔物以有助于生物素化。以并不显著影响受体结合能力的方式来进行生物素化和/或与荧光染料或趋化因子的其他标记基团结合。位点特异性生物素化或其他标记是优选的，这是因为趋化因子的非选择性标记可以损害受体结合活性。通常优选在蛋白质C端或向着其进行生物素化或其他标记，这是因为本发明人已经发现，在这区域的修饰通常是良好容忍的(就对受体结合能力的最小影响而言)。可以在任何适宜氨基酸处位点特异性地进行生物素化。适宜氨基酸的实例包括赖氨酸、二氨基丙酸和鸟氨酸。通常，可以参见Natarajan S et al, Int.J.Pept.ProteinRes., 1992, 40, 567-74; Baumeister B, Int.J.Peptide Res.And Therapeutics, 2005, 11, 139-141;Bioconjugate techniques2nd edition, Greg T.Hermanson,全部内容以引用方式结合于本文。
[0041 ] 截短可以涉及N或C端氨基酸的缺失(在适当的情况下)，或两者。通常，截短形式将保留趋化因子进行正确折叠所需要的残基，例如保留趋化因子折叠结构，其与以下要求一致:截短形式必须保留结合于相关受体(由白细胞(在表面上)表达的)的能力。趋化因子分子通常包括分别在第I和第3以及第2和第4半胱氨酸残基之间的二硫键，如本领域技术人员将理解的。在本 文中提供序列的情况下，假设这些二硫键将在折叠的蛋白质中形成(除非另有说明)。在某些实施方式中，截短形式可以包含比野生型氨基酸序列少I至100个氨基酸，如1、2、3、4、5个氨基酸等。当然，截短形式可以包含进一步的修饰(如本文详述的)。在某些实施方式中，相对于全长野生型趋化因子，修饰或截短的形式可以具有40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更大总体氨基酸序列一致性(其中，缺失被算作氨基酸序列的差异)。在某些实施方式中，针对在分子之间的共同序列(即，没有被删除的氨基酸),可以存在 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 氨基酸序列一致性。可以利用可免费获得的已知算法，如BLAST或GAP分析(GCG程序)(采用默认设置)，来确定序列一致性。趋化因子可以缺少在体内合成过程中被切割掉的N端信号肽。
[0042]可用于本发明的各种实施方式用于结合于CCR2的特定趋化因子包括MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5。MCP-1和MCP-5仅结合于趋化因子受体CCR2，所以在一些实施方式中这些趋化因子可以是优选的。每种趋化因子能够结合于涉及代谢综合征相关疾病或病症的趋化因子受体。更具体地，MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5各自用于从患者血液中除去CCR2表达细胞。在本发明中用于结合于CCR1、CCR3和/或CCR5的特定趋化因子包括RANTES。RANTES能够结合于涉及代谢综合征相关疾病或病症的趋化因子受体。更具体地，RANTES可用于从患者血液中除去CCR1、CCR3和/或CCR5表达细胞。根据本发明的各种实施方式，可以各自应用在本文中更详细描述的趋化因子(参照相关的图和氨基酸序列，如在SEQ ID NO中提出的)。CCL17 (TARC)和CCL22 (MDC)仅结合CCR4并且可以用于本发明的某些实施方式中。
[0043]根据本发明，可以各自应用在本文中更详细描述的修饰和截短的趋化因子(参考相关的氨基酸序列，如在SEQ ID NO和伴随的实验性实施例中提出的)。这样的修饰形式可以指导技术人员关于可以适用于本发明的相同和其他趋化因子的另外的修饰形式。趋化因子显示可变的序列同源性(小于20%至90%以上)，但均共享非常类似的三级结构，其由以下各项组成:无序的N端、接着长环(N环)，其终止于310螺旋、3链β折叠和C端螺旋。通过二硫键来稳定总体拓扑结构。这种共同三级结构是趋化因子蛋白家族的共同特征(Fernandez EJ annd Lolis E., Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol., 202, 42, 469-99;Allen SJet al, Annu.Rev.Tmmunol., 2007, 25, 787-820,以引用方式结合于本文)。
[0044]在该N端区内的截短可以保持结合于受体，但可以导致功能的改变或丧失(例如，Zhang YJ et al, J.Biol.Chem., 1994, 269, 15918, ; Gong J-H and Clark-Lewis 1., J.Exp.Med., 1995, 181, 631-640 ; Fernandez EJ annd Lolis E., Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol., 202, 42, 469-99; Allen SJ et al, Annu.Rev.1mmunol.，2007，25，787-820,其各自以引用方式结合于本文)。还可以制备在趋化因子C端处的截短，并保持受体结合活性(Treating Inflammatory Disorders, Ola Winqvist and Graham Cotton, W02010/029317,全部内容以引用方式结合于本文)。
[0045]在其他实施方式中，趋化因子的片段和变体用于如本文公开的装置和方法。更具体地讲，所述片段和变体保留特异性地结合于它们的同源趋化因子受体的能力。本领域技术人员已知，趋化因子共享特定的受体结合域，包括类似的单体折叠，例如其特征在于无序的氨基末端结构域，接着保守核心区，其由所谓的“N环”、三个反向平行β-链、和羧基末端α-螺旋组成。虽然不受理论限制，但认为，趋化因子-趋化因子受体相互作用是两步机制，其中趋化因子的核心首先与由受体的胞外域形成的结合位点相互作用，同时在趋化因子N端和在受体上的第二结合位 点之间形成另一种相互作用，从而触发受体激活。因此，“片段”，如趋化因子的功能片段，是指蛋白质的氨基酸序列的一部分，其保留针对它的同源受体的结合。片段可以包括，例如，单体折叠区、或其部分，如氨基末端结构域、保守核心区和/或“N环”、反向平行β链、和/或羧基末端α-螺旋、或它们的组合和部分
[0046]另外，认识到，可以显著突变多肽，而没有显著改变多肽功能的一种或多种，例如，没有改变蛋白质的特异性结合和/或折叠。众所周知，遗传密码是简并的，因此不同的密码子编码相同的氨基酸。甚至在引入氨基酸替代的情况下，突变也可以是保守的并且对蛋白质的基本功能没有重大影响(参见例如，Stryer, Biochemistry4th Ed., W.Freeman&C0., New York, NY, 1995)。这包括,例如，蛋白质与其他蛋白质结合和相互作用的能力，如截短的趋化因子结合于它的同源受体。
[0047]在一些实施例中，可以删除多肽链的一部分而没有损害或消除所有它的功能。例如,在C和/或N端，约I至约20个氨基酸的缺失，如在C和/或N端，约1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个氨基酸的缺失，可以导致这样的趋化因子，其保留功能，如特异性结合它的同源受体。这样的截短可以保留整个蛋白质的全部功能，和/或可以允许保留功能如蛋白质-蛋白质相互作用，如在配体-受体相互作用的情况下。缺失少量氨基酸，例如，小于约20%(如小于约18%、小于约15%、小于约10%、小于约8%、小于约5%、小于约2%、或小于约1%)野生型趋化因子氨基酸总数，的趋化因子也可以用于本文公开的方法和装置。此外，可以在多肽链中进行插入或添加，例如，添加表位标签，而没有损害或消除它的功能(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, GreenePubl.Assoc, and ffiley-1ntersciences, 1998)。在没有显著损害多妝的一种或多种功能的情况下，可以进行的其他修饰包括，例如，体内或体外化学和生化修饰或掺入稀有氨基酸。在一些实施例中，趋化因子的功能片段可以由趋化因子氨基酸序列的约10或更多、约25或更多、约50或更多、约75或更多、约100或更多、约125或更多、约150、约175或更多、或约更多、或200或更多个氨基酸残基组成。
[0048]在一些实施例中，趋化因子或其功能片段具有这样的氨基酸，相比于参考序列，如本文详细描述的那些(例如，利用NCBI Blast2.0gapped BLAST设定为默认参数)，在它的全长上具有至少约60%或65%序列一致性，约70%或75%序列一致性，约80%或85%序列一致性，约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。还可以通过检查来手工进行比对。还可以在趋化因子氨基酸序列中进行一种或多种保守氨基酸修饰，不管是添加、缺失或修饰，其并不显著改变多肽的三维结构或它结合于同源受体的能力。例如，保守氨基酸替代并不影响趋化因子特异性地结合它的同源受体的能力。提供功能类似氨基酸的保守替代表是本领域中众所周知的。以下六组各自包含彼此是保守替代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸⑴；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K) ；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。
[0049]可以通过各种各样的化学技术来修饰肽，如趋化因子及其片段，以产生这样的衍生物，其具有与未修饰肽基本相同的活性或功能，如结合于同源受体，以及可选地具有其他所期望的性能。例如，蛋白质的羧酸基团，不管是羧基末端或侧链，能够以药用阳离子的盐形式提供，或被酯化以形成C1-C16酯，或被转化为化学式NR1R2的酰胺，其中Rl和R2各自独立地是H或C1-C16烷基，或被结合以形成杂环，如5或6元环。肽的氨基，不管是氨基末端或侧链，可以为药用酸加成盐的形式，如HCl盐、HBr盐、乙酸盐、苯甲酸盐、甲苯磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐和其他有机盐，或可以被修饰至C1-C16烷基或二烷基氨基，或进一步被转化为酰胺。
[0050]利用公认的技术，可以将肽侧链的羟基转化为C1-C16烷氧基或转化为C1-C16酯。可以用一种或多种卤素原子，如F、Cl、Br或I，或用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸和其酯、或所述羧酸的酰胺，来取代肽侧链的苯基和苯酚环。可以将肽侧链的亚甲基延伸成同系C2-C4亚烷基。可以用许多公认的保护基团的任何一种，如乙酰胺基团，来保护巯基。本领域技术人员还将认识到用于将环状结构引入本公开肽的方法，以选择和提供对结构的构象限制，其导致增强的稳定性。例如，可以将C或N端半胱氨酸加入肽，从而当被氧化时，肽将包含二硫键，从而产生环肽。其他肽环化方法包括形成硫醚以及羧基末端和氨基末端酰胺和酯。
[0051]肽模拟物和有机模拟物实施方式也在本发明的范围内，由此所述肽模拟物和有机模拟物的化学成分的三维排列模拟肽主链和成分氨基酸侧链的三维排列，从而导致本发明蛋白质的所述肽模拟物和有机模拟物。对于计算机建模应用，药效团是针对生物活性的结构要求的理想化的三维定义。可以使用目前的计算机建模软件(利用计算机辅助药物设计或CADD)设计肽模拟物和有机模拟物以配合每种药效团。参见Walters, “Computer-Assisted Modeling of Drugs，，，in Klegerman&Groves, eds., 1993,Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove,IL, pp.165174andPrinciples of Pharmacology Munson(ed.) 1995，Ch.102，for descriptions oftechniques used in CADD。在本发明的范围内还包括利用所述技术制备的模拟物。
[0052]通过酰胺键(CONH)，通常将在肽、多肽、或蛋白质中的氨基酸化学结合在一起。另外，可以通过其他化学键，将氨基酸结合在一起。例如，用于氨基酸或氨基酸类似物的键可以包括 CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(顺式和反式)、-C0CH2-、-CH (OH)CH2-、和-CHH2S0-(这些和其他键可以参见 Spatola, in Chemistry and Biochemistryof Amino Acids, Peptides, and Proteins,B.Weinstein, eds., Marcel Dekker,NewYork, p.267 (1983) ; Spatola, A.F., Vega Data (March 1983), Vol.1, Issue3, PeptideBackbone Modifications (综论)；Morley, Trends Pharm Sci pp.463-468，1980; Hudson, eta 1., Int J Pept Prot Resl4: 177-185, 1979; Spatola et a 1.LifeSci38:1243-1249，1986;Harm J.Chem.Soc Perkin Trans.1307-314, 1982;Almquistet al.J.Med.Chem.23:1392-1398, 1980;Jennings-ffhite et al.TetrahedronLett23:2533, 1982;Holladay et al.Tetrahedron.Lett24:4401-4404, 1983 ；以及 HrubyLife Sci31:189-199, 1982)。
[0053]CCL2是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体2的基因符号，还称为MCP-1。该基因的HGNC ID是10618。该基因位于染色体位置17qll.2_q21.1处。该基因的先前的符号和名称是SCYA2、“小的可诱导的细胞因子A2(单核细胞趋化蛋白1，与小鼠Sig-je同源)”。该基因的同义词包括⑶CF-2、HC11、MCP1、MGC9434、SMC-CF、“单核细胞化学吸引物蛋白质-1"、"单核细胞趋化和激活因子"、"单核细胞趋化蛋白1，与小鼠Sig-je同源〃、〃单核细胞分泌性蛋白JE〃、〃小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员2〃。CCL2的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的BC009716.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0054]CCL8是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体8的基因符号，还称为MCP-2。该基因的HGNC ID是10635。该基因位于染色体位置17qll.2处。该基因的先前的符号和名称是SCYA8、〃小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员8(单核细胞趋化蛋白2)"。该基因的另一种同义词是HC14。CCL8的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的X99886.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0055]CCL7是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体7的基因符号，还称为MCP-3。该基因的HGNC ID是10634。该基因位于染色体位置17qll.2_ql2处。该基因的先前的符号和名称是SCYA6、SCYA7、〃小的可诱导的细胞因子A7 (单核细胞趋化蛋白3)〃。该基因的同义词包括？1(:、嫩1^、103-3、1033、从:28、〃单核细胞化学吸引物蛋白质3"、"单核细胞趋化蛋白3"。CCL7的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的AF043338，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0056]CCL13是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体13的基因符号，还称为MCP-4。该基因的HGNC ID是10611。该基因位于染色体位置17qll.2处。该基因的先前的符号和名称是SCYA13、〃小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员13〃。该基因的同义词包括 CKblO、MCP-4、MGC17134、NCC-l、SCYLl。CCL13 的 Genbank 参考序列是如于2011年6月13日可获得的AJ001634，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0057]MCP-5是CC趋化因子家族中的小鼠趋化因子。它还被称为趋化因子(C_C基序)配体12 (CCL12)，并且，由于它与人趋化因子MCP-1的相似性，有时它被称为MCP-1相关趋化因子。MCP-5的基因存在于在小鼠染色体11上的一组CC趋化因子中。CCL12的NCBI参考序列是NC_000077.5。MCP-5的先前的符号是SCYA12。CCL12的NCBI参考序列是如于2011年6月13日可获得的NC_000077.5，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0058]CCL5是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体5的基因符号，还称为RANTES。该基因的HGNC ID是10632。该基因位于染色体位置17qll.2_ql2处。该基因的先前的符号和名称是D17S136E、SCYA5、〃小的可诱导的细胞因子A5 (RANTES)"。该基因的同义词包括〃 β -趋化因子RANTES"、MGC17164、RANTES、〃激活后调节的，正常T表达的，和推测分泌的〃、"SIS- δ 〃、SISd、〃小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员5〃、〃T细胞特异性蛋白ρ288〃、〃Τ细胞特异性RANTES蛋白质〃、TCP228。CCL5的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的AF043341.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0059]CCL17是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体17的基因符号。该基因的HGNC ID是10615。该基因位于染色体位置16ql3处。该基因的先前的符号和名称是SCYA17、〃小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员17"。该基因的同义词包括AB⑶-2、TARC。CCL17的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的D43767.1，其全部内容以引 用方式结合于本文。
[0060]CCL21是由HUGO基因命名委员会批准的用于趋化因子(C_C基序)配体21的基因符号。该基因的HGNC ID是10620。该基因位于染色体位置9pl3处。该基因的先前的符号和名称是SCYA21、"小的可诱导的细胞因子亚家族A(Cys-Cys)，成员21〃。该基因的同义词包括6Ckine、〃 β趋化因子exodus-2〃、CKb9、ECL, 〃用于淋巴细胞的高效的化学吸引物〃、exodus-2、〃次级淋巴样组织趋化因子〃、SLC、TCA4。CCL21的Genbank参考序列是如于2011年6月13日可获得的AB002409.1，其全部内容以引用方式结合于本文。
[0061]包含修饰和/或截短并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的适宜的修饰趋化因子的实例详细描述于本文。MCP-1已被产生为具有残基75，其可以是赖氨酸，作为在趋化因子上的生物素化位点(编号是基于具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的成熟蛋白)。生物素化允许将MCP-1固定在载体上(通过生物素-亲和素相互作用)。MCP-1的基本氨基酸序列，包括23个氨基酸前导序列，被提出为SEQ ID NO:1。成熟蛋白的氨基酸序列被提出为SEQ ID N0:2。本发明的发明人已确定了，趋化因子可以显示改善的结合性能，其中趋化因子通过间隔基团被生物素化。间隔物可以防止生物素基团影响趋化因子的结合亲合力。可以采用任何适宜的间隔基团。进一步的修饰可以为分子提供有利的性能。本发明还涉及截短MCP-1趋化因子的衍生物。截短形式的氨基酸序列被提出为SED ID N0:3。
[0062]因此，在某些实施方式中，本发明还提供了修饰的MCP-1趋化因子，其包含提出为SEQ ID NOiUSEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成，其中已进行一种或多种以下修饰:
[0063]a) SEQ ID NO: 2的谷氨酰胺残基I已被焦谷氨酰胺替换
[0064]b)C端被产生为酰胺衍生物(这可以通过在酰胺接头上的合成来实现)
[0065]c)在 SEQ ID NO:1 的位置 98 或 SEQ ID NO: 2 的位置 75 或 SEQ ID NO: 3 位置 67处的(C端区)残基，其可以是赖氨酸或鸟氨酸残基，被生物素化，可选地通过间隔基团被生物素化，以允许将趋化因子固定在固体载体上；和/或
[0066]d)在 SEQ ID NO:1 的位置 87 或 SEQ ID NO: 2 的位置 64 或 SEQ ID NO: 3 的位置
56处的甲硫氨酸残基 已被正亮氨酸替换。
[0067]在SEQ ID NO:1 的位置 98 或 SEQ ID NO: 2 的位置 75 或 SEQ ID NO: 3 的位置 67处的(C端区)氨基酸，其可以是赖氨酸残基或功能等效物，可以通过适宜的间隔基团，如聚乙二醇(PEG)间隔基团进行生物素化，以允许将趋化因子固定在固体载体上。在【具体实施方式】中，PEG间隔物是3，6- 二氧氨基辛酸。本发明的修饰MCP-1趋化因子的序列和生物素化分别示于图7至9。修饰的MCP-1趋化因子可以是CCR2活性的激动剂或拮抗剂。可以在适宜的测定，如基于细胞的测定中测试它们的活性。尤其是，可以在针对人CCR2受体基于功能细胞的测定中确定激动剂和拮抗剂性能。
[0068]MCP-5仅结合CCR2，因而将选择性地除去CCR2表达细胞。全长氨基酸序列，包括信号肽，被提出为SEQ ID N0:4。N端加工的MCP-5趋化因子的氨基酸序列的长度是82个氨基酸，并且被提出为SEQ ID N0:5。氨基酸序列比对表明，当与MCP-1的氨基酸序列相比时，MCP-5具有C端延伸部分。这种比对的结果示于图10。因此可以合成MCP-5的C端截短形式。这种截短形式将包含提出为SEQ ID N0:6的MCP-5残基1-76、基本上由其组成或由其组成。
[0069]因此，在某些实施方式中，本发明还提供了修饰的MCP-5趋化因子，其包含提出为SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 或 SEQ ID N0:6 的氨基酸序列，其中在 SEQ ID N0:4 的位置 97处的、或在SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:6的位置75处的异亮氨酸残基已被赖氨酸替换。在某些实施方式中，修饰的MCP-5趋化因子包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。在SEQ ID NO:4的位置97、或SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6的位置75处的赖氨酸(或功能等效物)残基处，修饰的MCP-5趋化因子可以被生物素化。生物素化可以通过适宜的间隔基团。间隔基团的具体实例包括PEG间隔物，可选地3，6-二氧氨基辛酸。在一些实施方式中，C端被产生为酰胺衍生物。这可以通过在酰胺接头上合成来实现。在某些实施方式中，修饰的MCP-5趋化因子包含图11所示的序列和生物素化、基本上由其组成或由其组成。修饰的MCP-5趋化因子可以是CCR2活性的激动剂或拮抗剂。可以在适宜的测定，如基于细胞的测定中，测试它们的活性。尤其是，可以在针对人CCR2受体的基于功能细胞的测定中确定激动剂和拮抗剂性能。
[0070]包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的另外的实例详细描述于本文(参见以下实施例)。修饰CCL2(MCP-1)对应于全长成熟蛋白的残基I至76 (并且缺少被切割掉的23个氨基酸的N端信号肽)，因此保留趋化因子折叠。在蛋白质的N端处的Gln(Glnl)由焦谷氨酰胺取代以防止产生N端Gln和pyroGlu的混合物质。通过柱制造和使用，这提高了合成产量并确保均匀趋化因子制备。加入FmocLys (ivDde) -OH作为残基75，以促进在蛋白质(SEQ ID NO: 10)的该位置处位点特异性标记。可以将合适的间隔物，如PEG间隔物，加入在ε_氨基官能团和生物素之间。生物素化形式包含SEQ IDNO: 11的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
[0071]因此，在某些实施方式中，本发明还涉及修饰趋化因子，其包含以下的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成:
[0072]SEQ ID NO:9:
[0073]XPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKffVQDSMDHLDKQTQTPKT
[0074]X=pyroGlu 或 Gln
[0075]和/ 或 SEQ ID NO: 11:
[0076]XPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKffVQDSMDHLDKQTQTPXT
[0077]Xl=pyroGlu 或 Gln
[0078]Χ75是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG，可选地K (PEG-生物素)被生物素化
[0079]包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的另外的实例详细描述于本文(参见以下实施例4)。修饰CCL5 (RANTES)对应于全长成熟蛋白的残基I至68 (并且缺少被切割掉的23个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠。在该序列内的单个甲硫氨酸(Met67)被突变为赖氨酸，以在链装配(SEQ ID NO: 12)期间减轻该残基的氧化。这种Met至Lys的替代可以提供在位置67处的赖氨酸，其可以通过生物素化来修饰。加入FmocLys (ivDde)-OH作为残基67以促进在蛋白质(SEQ ID NO: 13)的该位置处位点特异性标记。生物素化形式包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成:
[0080]因此，在其他实施方式中，本发明还涉及修饰趋化因子，其包含以下SEQ ID NO: 14的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成:
[0081] SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKN RQVCANPEKKffVREYINSLEXS
[0082]X是可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化，可选地通过间隔分子如PEG(例如K(生物素))被生物素化
[0083]包含修饰并且特别适用于本发明的本发明的各种实施方式的趋化因子的另外的实例详细描述于本文(参见以下实施例3)。修饰的CCL8(MCP-2)对应于全长成熟蛋白的残基I至76 (以及缺少被切割掉的23个氨基酸的N端信号肽)，因而保留趋化因子折叠。在生理条件下，在蛋白质的N端处的Gln经历pyroGlu形成。因此，序列Glnl由焦谷氨酰胺取代以防止产生N端Gln和pyroGlu的混合物质(SEQ ID NO: 15)。通过柱制造和使用，这提高了合成产量并确保均匀趋化因子制备。加入FmocLys (ivDde)-OH作为残基75以促进在蛋白质(SEQ ID NO: 16)的该位置处位点特异性标记。通过生物素来修饰在位置75处的自然发生的赖氨酸。可以将合适的间隔物，如PEG间隔物，加入在ε-氨基官能团和生物素(SEQ ID NO: 17)之间:
[0084]因此，在其他实施方式中，本发明还涉及修饰趋化因子，其包含以下SEQ ID NO: 17的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成:
[0085]XPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKERWVRDSMKHLDQIFQNLXP
[0086]Xl=pyroGlu(但在一些实施方式中可以保持为Gln)
[0087]X75=可以被生物素化的氨基酸残基，如赖氨酸、鸟氨酸或二氨基丙酸，以及可选地被生物素化,可选地通过间隔物分子如PEG，例如K (PEG-生物素)被生物素化。
[0088]可以通过本领域中已知的任何合适的方式来合成可用于本发明的各种实施方式的趋化因子。优选地，化学合成趋化因子，因为这有助于修饰和标记等。然而，还可以采用基于重组DNA的方式，与适当的标记和修饰技术结合(根据需要)。因此，在某些实施方式中，本发明还提供了核酸分子，其编码本发明的各种实施方式的趋化因子。在某些实施方式中，本发明还涉及包含所述核酸分子的载体以及包含所述载体的宿主细胞。载体可以另外包含适宜的启动子，其可操作地连接于核酸分子，以促进相应的mRNA分子转录。通过编码本发明的各种实施方式的趋化因子的核酸分子的转录和翻译，宿主细胞可以能够表达蛋白质。
[0089]可以通过本领域中已知的方法(如描述于W000/50088A2，其全部内容以引用方式结合于本文)来生物素化可用于本发明的各种实施方式的趋化因子。如上面所指出的，本发明的各种实施方式的趋化因子的位点特异性标记是优选的，虽然可以采用并不显著影响趋化因子的受体结合能力的任何标记技术。各种位点特异性地生物素化趋化因子和天然趋化因子是市售的，例如来自Almac, Craigavon, UK。在【具体实施方式】中,通过间隔基团,来生物素化一种或多种趋化因子。可以使用间隔物来防止生物素基团影响趋化因子的活性，尤其是趋化因子与它的同源受体的结合。在本发明的各种实施方式中，可以采用有助于保留趋化因子的受体结合性能的任何适宜的间隔物。因此，在以上描述的【具体实施方式】中，在适当的情况下，可以采用不同于PEG间隔物的间隔物。在【具体实施方式】中，间隔物是聚乙二醇(PEG)间隔物。PEG已被表明是有效间隔物，其允许将生物素连接于趋化因子(然后通过与链霉亲合素的相互作用，可以将其固在固体载体上)而没有损害受体结合能力。
[0090]在本发明的各种实`施方式的上下文下，术语“抗体”包括所有免疫球蛋白或对于相关的趋化因子受体具有特异性结合亲和力的免疫球蛋白样分子(通过举例方式，但非限制性地包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、它们的组合、以及在任何脊椎动物中在免疫反应期间产生的类似分子，例如，在哺乳动物中如人类、山羊、兔和小鼠)。可用于本发明的各种实施方式的具体的免疫球蛋白包括IgG同种型。可用于本发明的各种实施方式的抗体可以是单克隆或多克隆起源，但通常是单克隆抗体。抗体可以是人抗体、非人抗体、或非人抗体的人源化形式、或嵌合抗体。用于抗体人源化的各种技术是众所周知的并且可以采用任何适宜的技术。术语“抗体”还指多肽配体，该多肽配体至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区，其特异性地识别和结合抗原的表位，并且它延伸到保留特异性地结合于相关趋化因子受体能力的所有抗体衍生物和片段。这些衍生物和片段可以包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、单链抗体、单域抗体、Fe片段等。术语抗体包括这样的抗体，其包括重链和轻链，但还包括(仅)重链抗体。在【具体实施方式】中，可以设计抗体以对一种以上的趋化因子受体具有特异性，例如双特异性以允许结合于两种不同的趋化因子受体。在以下表1中列出结合于感兴趣的趋化因子受体的合适的市售抗体。它们可以标记或未标记。一般性参考可以参见“Antibodies a laboratory manual:By E Harlow and D Lane.pp726.Cold SpringHarbor Laboratory.1988”,其全部内容以引用方式结合于本文。抗CCR2抗体例如描述于W02010/021697,以引用方式结合于本文。潜在有用的抗体的进一步的实例包括MLN-1202，一种抗CCR2单克隆抗体，其目前正进行临床试验(Millennium Pharmaceuticals)。
[0091]
【权利要求】
1.一种用于治疗与代谢综合征相关的病症或用于治疗痛性肥胖症(AD)的方法，包括将来自患者或受试者的外周血施加于载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于趋化因子受体的一种或多种结合试剂，可选地为直接或间接固定在所述载体上的趋化因子受体CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5，从而由所述患者或受试者的所述外周血中除去一种或多种趋化因子受体，可选地为CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述与代谢综合征相关的病症选自糖尿病、肥胖症、胰岛素抗性、增加的血清三酰基甘油浓度和高血压。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，能够特异性地结合于CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的所述结合试剂分别是CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的激动剂或拮抗剂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，能够特异性地结合于CCR2、CCRUCCR3、CCR4或CCR5的所述结合试剂选自抗体和趋化因子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述趋化因子选自MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5以及可选地所述趋化因子受体是CCR2，或其中所述趋化因子是RANTES以及可选地所述趋化因子受体选自CCR1、CCR3和CCR5，或其中所述趋化因子选自CCL17(TARC)和CCL22 (MDC)以及所述趋化因子受体是CCR4。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述趋化因子是MCP-1或MCP-5。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5表达细胞是用于治疗与代谢综合征相关的病症的单核细胞，可选地为CCR2表达单核细胞，其中治疗糖尿病；或用于治疗AD的(CCR2表达)B淋巴细胞，或CCRl表达单核细胞，其中治疗AD，或CCR4或CCR5表达T细胞，其中治疗糖尿病。`
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，基于在获自所述患者或受试者的样品中检测CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞的一种或多种的水平增加，CCR2、CCRUCCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的表达水平增加，和/或具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的高表达的细胞水平增加，来选择所述患者或受试者以进行治疗。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在单次治疗中，将约20-50%的所述患者的血液施加于所述柱。
10.一种结合试剂，能够特异性地结合于趋化因子受体，可选地趋化因子受体CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5用于治疗与代谢综合征相关的病症或用于治疗痛性肥胖症(AD)，其中，将所述结合试剂固定在包含在成分血分离柱内的固体载体上，对所述成分血分离柱施加来自患者的外周血，从而由所述患者的所述外周血中除去趋化因子受体，可选地为CCR2、CCR1、CCR3、CCR4 或 CCR5 表达细胞。
11.根据权利要求10所述的结合试剂，其中，所述与代谢综合征相关的病症选自糖尿病、肥胖症、胰岛素抗性、增加的血清三酰基甘油浓度和高血压。
12.根据权利要求10或11所述的结合试剂，其中，能够特异性地结合于CCR2、CCRUCCR3、CCR4或CCR5的所述结合试剂分别是CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的拮抗剂。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的结合试剂，其中，能够特异性地结合于CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的所述结合试剂选自抗体和趋化因子。
14.根据权利要求13所述的结合试剂，其中，所述趋化因子选自MCP-l、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5以及可选地所述趋化因子受体是CCR2，或其中所述趋化因子是RANTES以及可选地所述趋化因子受体选自CCR1、CCR3或CCR5，或其中所述趋化因子选自CCL17 (TARC)和CCL22 (MDC)以及所述趋化因子受体是CCR4。
15.根据权利要求14所述的结合试剂，其中，所述趋化因子是MCP-1或MCP-5。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的结合试剂，其中，所述CCR2、CCRUCCR3、CCR4或CCR5表达细胞是用于治疗与代谢综合征相关的病症的单核细胞，可选地为CCR2表达单核细胞，其中治疗糖尿病；或用于治疗AD的(CCR2-表达)B淋巴细胞，或CCRl表达单核细胞，其中治疗AD，或CCR4或CCR5表达T细胞，其中治疗糖尿病。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的结合试剂，其中，基于在获自所述患者的样品中检测CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5表达细胞的水平增加，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4或CCR5的表达水平增加，和/或具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4或CCR5的高表达的细胞水平增加，来选择所述患者或受试者以进行治疗。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的结合试剂，其中，在单次治疗中，将20-50%的所述患者的血液施加于所述柱。
19.一种用于诊断、监测与代谢综合征相关的病症或痛性肥胖症(AD)的进展、或用于监测与代谢综合征相关的病症或痛性肥胖症(AD)的治疗的方法，包括在获自受试者的样品中确定 a)趋化因子受体CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞的一种或多种的水平 b)CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的表达水平；和/或 c)具有CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的高表达的细胞水平 其中CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5表达细胞的一种或多种的高水平，CCR2、CCRUCCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的高表达水平，或具有CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的高表达的细胞的高水平，或与对照相比较CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞的一种或多种的增加的水平，或与对照相比较CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的增加的表达水平，或与对照相比较具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的高表达的细胞的增加的水平，表明与代谢综合征相关的病症或痛性肥胖症(AD)的存在或进展。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述与代谢综合征相关的病症选自糖尿病、肥胖症、胰岛素抗性、增加的血清三酰基甘油浓度和高血压。
21.根据权利要求19或20中任一项所述的方法，其中，所述样品是外周血样品，可选地其中所述细胞是CCR2表达B细胞、CCRl表达单核细胞、或CCR4或CCR5表达T淋巴细胞。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞的一种或多种的较高水平，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的较高表达水平和/或具有CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的高表达的细胞的较高水平，与更加活动性的疾病相关。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞的一种或多种 的较低水平，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的较低表达水平，和/或具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的高表达的细胞的较低水平，与无活动性疾病或较低活动性疾病相关。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞的一种或多种的降低的水平，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的降低的表达水平，和/或具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的高表达的细胞的降低的水平，与成功治疗相关。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述治疗如在权利要求1至9中任一项所述。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞的一种或多种的增加的水平，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的增加的表达水平，和/或具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的高表达的细胞的增加的水平，表示疾病的进展。
27.一种用于选择适合治疗与代谢综合征相关的病症或痛性肥胖症(AD)的方法，包括在犹自受试者的样品中确定 a)趋化因子受体CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞的一种或多种的水平 b)CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的表达水平；和/或 c)具有CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的高表达的细胞水平 其中，CCR2、CCRl、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞的一种或多种的较高水平，CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的较高表达水平，或具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的高表达的细胞的较高水平，或与对照相比较CCR2、CCR1、CCR3、CCR4和CCR5表达细胞的一种或多种的增加的水平，与对照相比较CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的增加的表达水平，或与对照相比较具有CCR2、CCRU CCR3、CCR4和CCR5的一种或多种的高 表达的细胞的增加的水平，导致选择如在权利要求1至9中任一项所限定的治疗，用于治疗所述与代谢综合征相关的病症或痛性肥胖症(AD)。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述与代谢综合征相关的病症选自糖尿病、肥胖症、胰岛素抗性、增加的血清三酰基甘油浓度和高血压。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述样品是外周血样品，可选地其中所述细胞是CCR2表达B细胞、CCRl表达单核细胞、或CCR4或CCR5表达T淋巴细胞。
30.一种修饰的 MCP-1 趋化因子，包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3 所列出的氨基酸序列，其中进行以下修饰的一种或多种: a)在SEQID NO:2的位置I处的谷氨酰胺残基被焦谷氨酰胺替换 b)C端被产生为酰胺衍生物 c)在SEQID NO:1的位置98处或在SEQ ID NO: 2的位置75处或在SEQ ID NO: 3的位置67处的赖氨酸残基，所述赖氨酸残基可以被适宜的可替代的氨基酸如二氨基丙酸或鸟氨酸替换，被生物素化，可选地通过间隔基团被生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上 d)在SEQID NO:1的位置87处或在SEQ ID NO: 2的位置64处或在SEQ ID NO: 3的位置56处的甲硫氨酸残基被正亮氨酸替换。
31.根据权利要求30所述的修饰的MCP-1趋化因子，其中，在SEQID NO:1位置98处或在SEQ ID NO:2的位置75处或在SEQ ID NO:3的位置67处的赖氨酸残基，通过聚乙二醇(PEG)间隔基团来生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
32.根据权利要求31所述的修饰的MCP-1趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3，6-二氧氨基辛酸。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的修饰的MCP-1趋化因子，具有图7至9中任一个所示的结构。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的修饰的MCP-1趋化因子，其是CCR2活性的激动剂或拮抗剂。
35.一种修饰的 MCP-5 趋化因子，包含 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6 所列出的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:4的位置97处或在SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6的位置75处的异亮氨酸残基被赖氨酸或可替代的氨基酸如二氨基丙酸或鸟氨酸替换，这允许生物素化。
36.根据权利要求35所述的修饰的MCP-5趋化因子，其包含SEQID NO: 7的氨基酸序列。
37.根据权利要求35或36所述的修饰的MCP-5趋化因子，其在SEQID NO: 4的位置97处或在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的位置75处的赖氨酸残基，被生物素化。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的修饰的MCP-5趋化因子，其中，生物素化是通过间隔基团。
39.根据权利要求38所述的修饰的MCP-5趋化因子，其中，所述间隔基团是PEG间隔物，可选地为3，6- 二氧氨基辛酸。
40.根据权利要求35至39中任一项所述的修饰的MCP-5趋化因子，其中，C端被产生为酰胺衍生物。
41.根据权利要求35至40中任一项所述的修饰的MCP-5趋化因子，具有图11所示的结构。
42.根据权利要求35至41中任一项所述的修饰的MCP-5趋化因子，其是CCR2活性的激动剂或拮抗剂。
43.一种载有固体载体的成分血分离柱，所述载体包含能够特异性地结合于直接或间接固定在所述载体上的趋化因子受体，以允许由患者的外周血中除去表达所述趋化因子受体的细胞的结合试剂，其中所述结合试剂不是趋化因子。
44.根据权利要求1所述的柱，其中，能够特异性地结合于所述趋化因子受体的所述结合试剂是所述趋化因子受体的激动剂或拮抗剂。
45.根据前述权利要求中任一项所述的柱，其中，能够特异性地结合于所述趋化因子受体的所述结合试剂选自抗体和化合物。
46.根据前述权利要求中任一项所述的柱，如由权利要求1至42中的任何一个或多个特征所进一步限定。
47.一种用于治疗炎性病症的方法，包括将来自患者的外周血施加于如在权利要求43至46中任一项所限定的成分血分离柱，从而由所述患者的所述外周血中除去趋化因子受体表达细胞。
48.根据权利要求6所述的方法，如由权利要求1至42中的任何一个或多个特征所进一步限定。
49.一种结合试剂，能够特异性地结合于趋化因子受体，用于治疗炎性病症，其中将所述结合试剂固定在包含在如在权利要求43至46中任一项所述的成分血分离柱内的固体载体上,对所述成分血分离柱施加来自患者的外周血,从而由所述患者的所述外周血中除去趋化因子受体表达细胞。
50.根据权利要求49所述的结合试剂，如由权利要求1至42中的任何一个或多个特征所进一步限定。
51.一种修饰的CCL8(MCP-2)趋化因子，包含SEQ ID NO: 17所列出的氨基酸序列。
52.根据权利要求51所述的修饰的CCL8趋化因子，其中，在SEQID NO: 17的位置75处的残基通过聚乙二醇(PEG)间隔基团来生物素化，以允许将所述趋化因子固定在固体载体上。
53.根据权利要求51所述的修饰的CCL8趋化因子，其中，所述PEG间隔物是3，6-二氧氨基辛酸。
54.根据权利要求51至53中任一项所述的修饰的CCL8趋化因子，包含SEQID NO: 15的氨基酸序列。
55.根据权利要求51至54中任一项所述的修饰的CCL8趋化因子，其是CCR5活性的激动剂或拮抗剂。
56.一种修饰的CCL5趋化因子，包含SEQ ID NO: 14所列出的氨基酸序列。
57.根据权利要求56所述的修饰的CCL5趋化因子，其中，在位置67处的残基被生物素化。
58.根据权利要求56或`57所述的修饰的CCL5趋化因子，其包含SEQID NO:8或SEQID NO: 12的氨基酸序列。
59.根据权利要求56至58中任一项所述的修饰的CCL5趋化因子，其是CCR5活性的激动剂或拮抗剂。
60.一种修饰的CCL2趋化因子，包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
【文档编号】A61M1/36GK103796693SQ201280039642
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年6月13日 优先权日:2011年6月13日
【发明者】格雷厄姆·科顿, 奥拉·温奎斯特 申请人:Ith免疫治疗控股股份公司