利用羊膜来源的贴壁细胞治疗辐射损伤的制作方法

利用羊膜来源的贴壁细胞治疗辐射损伤的制作方法
【专利摘要】本发明提供了通过向个体施用来自羊膜的生血管细胞（称为羊膜来源的贴壁细胞）或这些细胞的群体和包含这些细胞的组合物来治疗已暴露于辐射的个体（例如，患有辐射损伤的个体）的方法。
【专利说明】利用羊膜来源的贴壁细胞治疗辐射损伤
[0001] 本发明申请主张美国临时专利申请No. 61/508, 553的优先权，该专利申请的公开 内容以其全部内容作为参考并入本文。 1.

【技术领域】
[0002] 本文提供了治疗患有辐射损伤的个体的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的 来自羊膜的生血管细胞，在本文中称为"羊膜来源的贴壁细胞"（AMDAC)。羊膜来源的贴壁 细胞不同于先前所述的组织培养表面贴壁胎盘干细胞。 2.

【背景技术】
[0003] 对可以改善或缓和暴露于辐射的生理学影响（包括由于暴露于辐射所引起的身体 损伤)的疗法存在需要。本文提供了治疗已暴露于辐射的个体的方法，包括施用治疗有效量 (数目）的AMDAC。 3.


【发明内容】

[0004] 在一个方面，本文提供了治疗已暴露于辐射的个体(例如，患有辐射损伤的个体） 的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的分离的羊膜来源的贴壁细胞(AMDAC)，其中所 述细胞贴壁至组织培养表面，并且其中所述细胞是OCT-f (八聚物结合蛋白4)，如可通过 RT-PCR确定的。在某些实施方式中，所述AMDAC是0CT-4_和⑶49f+。在某些实施方式中， 所述辐射是电离辐射。在一种具体的实施方式中，所述电离辐射是β辐射、Y幅射或X射 线。在另一种实施方式中，所述辐射是α-辐射。在另一种实施方式中，所述辐射是中子辐 射。
[0005] 在具体的实施方式中，所述辐射是急性的，例如，0. 01毫西弗特（mSv)至0. ImSv (0· OOlrem至0· Olrem之间）的单一剂量；是急性的,例如，ImSv至10mSv(0· Irem至I. Orem 之间)(0. 001戈瑞（Gy)至0. OlGy之间）的单一剂量；是急性的，例如，IOmSv至100mSv( Irem 至IOrem之间）（0· OlGy至0· IGy之间）的单一剂量；是急性的，例如，IOOmSv至IOOOmSv (IOrem至IOOrem之间）（0· IGy至I. OGy之间）的单一剂量；是急性的，例如，IOOOmSv至 2000mSv (IOOrem至200rem之间）（IGy至2Gy之间）的单一剂量；是急性的，例如，2000mSv 至3000mSv (200rem至300rem之间）（2Gy至3Gy之间）的单一剂量；是急性的，例如， 3000mSv至4000mSv (300rem至400rem之间）（3Gy至4Gy之间）的单一剂量；是急性的，例 如，4000mSv至5000mSv(400rem至500rem之间）的单一剂量。或者是急性的，例如，5000mSv 至 IOOOOmSv (500rem 至 IOOOrem 之间）（5Gy 至 IOGy 之间）的单一剂量。
[0006] 在其他的【具体实施方式】中，所述福射是0. OlmSv至0. lmSv(0. OOlrem至0. Olrem) 之间的慢性暴露或者基本慢性暴露；ImSv至IOmSv (0· Irem至I. Orem之间）（0· OOlGy至 〇· OlGy 之间）的慢性暴露；IOmSv 至 IOOmSv (Irem 至 IOrem 之间）（0· OlGy 至 0· IGy 之间） 的慢性暴露；IOOmSv至IOOOmSv (IOrem至IOOrem之间）（0· IGy至I. OGy之间）的慢性暴 露；IOOOmSv 至 2000mSv (IOOrem 至 200rem 之间）（IGy 至 2Gy 之间）的慢性暴露；2000mSv 至 3000mSv (200rem 至 300rem 之间）（2Gy 至 3Gy 之间）的慢性暴露；3000mSv 至 4000mSv (300rem 至 400rem 之间）（3Gy 至 4Gy 之间）的慢性暴露；4000mSv 至 5000mSv (400rem 至 500rem 之间）（4Gy 至 5Gy 之间）的慢性暴露；5000mSv 至 IOOOOmSv (500rem 至 IOOOrem 之 间）（5Gy 至 IOGy 之间）的慢性暴露；或者 IOOOOmSv 至 lOOOOOmSv (IOOOrem 至 IOOOOrem 之间）（IOGy至IOOGy之间）的慢性暴露。在某些具体的实施方式中，所述慢性暴露为1-6 天；7-13天；14-27天；28-56天或者超过56天。"基本慢性暴露"可以包括(例如）在数天、 数周或数月的一段持续时间内暴露，在此期间暴露是不连续的但是慢性的，例如，在特定地 点随辐射源风向转变暴露。
[0007] 在具体的实施方式中，个体在医学环境中暴露于所述辐射。在一种更具体的实施 方式中，所述个体由于脊髓抑制（myeloablation)的目的暴露于所述福射。在更具体的实 施方式中，所述脊髓抑制是部分的（即，所述个体的至少一些骨髓细胞在辐射处理中存活， 或者计算所述剂量以达到该目的）或完全的（即，辐射暴露旨在杀死所述个体的基本所有骨 髓细胞；或者辐射暴露是干细胞移植(例如，骨髓移植)必需的，以保持所述个体的生命)。在 其他实施方式中，所述个体在非医学环境(例如，工作场所）中暴露。
[0008] 在某些实施方式中，在所述施用时所述个体尚未发展急性辐射综合征的一种或多 种症状。在其他实施方式中，由于所述对辐射的暴露，所述个体已发展或有可能发展急性辐 射综合征或急性辐射综合征的症状。在具体的实施方式中，所述一种或多种症状包括恶心、 呕吐、腹泻、发烧和/或头痛中的一种或多种。在其他具体的实施方式中，所述一种或多种 症状包括紫癜、虚弱、疲劳、感染、脱发、暴露组织的水泡或坏死、和/或出血。在其他的具体 实施方式中，所述一种或多种症状包括神经功能缺损、认知损害、共济失调、震颤和/或癫 痫。在另一种具体的实施方式中，所述一种或多种症状包括白细胞减少。
[0009] 在另一种实施方式中，所述个体暴露于来自未接触所述个体身体的源的辐射。在 另一种实施方式中，所述个体由于接触所述个体身体的放射源而暴露于辐射。在具体的实 施方式中，所述个体由于所述个体吸入或摄入放射源而暴露于辐射。
[0010] 在某些具体的实施方式中，所述施用在所述暴露96小时内进行；在所述暴露72小 时内进行；在所述暴露48小时内进行；或在所述暴露24小时内进行。
[0011] 在另一个方面，本文提供了在对其有需要的受试者中诱导造血重建 (hematopoietic reconsititution)(例如，部分或完全造血重建)的方法，包括向所述受试 者施用治疗有效量的分离的AMDAC。因此，AMDAC能够被用于将受益于造血重建的疾病/病 症的治疗方法中。
[0012] 如本文所使用的，造血重建是指其中受试者中造血谱系的一种或多种细胞(例如， 一种或多种造血干细胞）的数目和/或类型增加的现象，例如，相对于未用这种治疗中的数 目和/或类型，由于使用AMDAC治疗而引起的增加。不希望受到理论束缚，由于使用AMDAC 治疗，造血谱系细胞的数目和/或类型的增加可以是由AMDAC对这些细胞的直接或间接作 用所导致的。可以使用本领域技术人员已知的方法评价造血重建现象，例如，FACS分析和 血液学分析，例如，红细胞计数、血细胞比容和血红蛋白水平(参见，例如，下文实施例4)。
[0013] 在一种具体的实施方式中，进行造血重建的受试者已暴露于辐射(例如，致死或次 致死剂量的辐射)。在另一种具体的实施方式中，受试者未暴露于辐射。在某些实施方式中， 受试者经历了脊髓抑制，例如，作为癌症治疗(例如，化疗、免疫疗法）或另一种治疗的一部 分的脊髓抑制。
[0014] 在一种具体的实施方式中，AMDAC能够用于重建骨髓衰竭或一种或多种主要造血 谱系的产生遗传性或先天性减少的受试者的造血系统。根据该实施方式能够治疗的与骨髓 衰竭有关的病症非限制性地包括再生障碍性贫血，例如，遗传性再生障碍性贫血(如，范科 尼贫血（Fanconi 's anemia)和脊髓发育不良综合征)和获得性再生障碍性贫血，例如由于 暴露于辐射、药物和/或化学物质(例如，苯）所造成的贫血。在一种具体的实施方式中，所 述获得性贫血不是由于暴露于辐射造成的。
[0015] 在另一种具体的实施方式中，AMDAC能够用于重建患有贫血的受试者的造血系统， 所述贫血包括但不限于慢性疾病（如慢性肾病或肝病）贫血；自身免疫性溶血性贫血；血红 蛋白病和地中海贫血，如镰刀形红细胞病，或α_地中海贫血或者β_地中海贫血。
[0016] 在另一种具体的实施方式中，AMDAC能够用于重建受试者的造血系统，所述受试者 患有单纯红细胞再生障碍性贫血，例如，作为原发性病症存在的单纯红细胞再生障碍性贫 血，所述原发性病症如自身免疫性红细胞再生障碍性贫血或白血病前期红细胞再生障碍性 贫血；或作为与以下疾病有关的继发性病症存在的单纯红细胞再生障碍性贫血，所述疾病 如恶性血液病，例如，慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、 慢性粒细胞性白血病、骨髓纤维化、原发性血小板增多症或急性淋巴母细胞性白血病；实体 瘤，例如，胃癌、乳腺癌或胆管腺癌、肺鳞状细胞癌、甲状腺癌、肾细胞癌或卡波西肉瘤；慢性 淋巴细胞性贫血；药物和化学物质，例如，别嘌醇、咪唑硫嘌呤、头孢噻吩、雌激素、非诺洛 芬、氟烷、异烟肼、苯巴比妥、磺胺噻唑或利福平；或严重肾衰竭。
[0017] 在某些实施方式中，所述0CT-4_AMDAC是HLA-G_，如可通过RT-PCR确定的。在 某些其他【具体实施方式】中，所述AMDAC另外是CD49f+，如可通过免疫定位确定的，S卩，所述 AMDAC是OCT-4' CD49f+。在某些其他【具体实施方式】中，所述AMDAC是OCT-4' HLA-GjP ⑶49f+。在其他具体的实施方式中，所述AMDAC是⑶90+、⑶105+或⑶117 _，如可通过免疫定 位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC是⑶90+、⑶105+和⑶117 _，如可通过 流式细胞术确定的。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是OCT-4IPHLA-G _，如通过 RT-PCR确定的，和⑶49f+、⑶90+、⑶105+和⑶117 _，如可通过免疫定位确定的。在另一种具 体的实施方式中，所述AMDAC是VEGFRl/Flt-Γ (血管内皮生长因子受体1)和VEGFR2/KDR+ (血管内皮生长因子受体2)，如可通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述 AMDAC是⑶9+、⑶10+、⑶44+、⑶54+、⑶98+、Tie-2+ (血管生成素受体)、TEM-7+ (肿瘤血管内 皮标志物 7)、CD31' CD34' CD45' CD133' CD143-(血管紧张素 I 转化酶，ACE)、CD146-(黑素瘤细胞粘附分子)或CXCRf (趋化因子（C-X-C基序)受体4)中的一种或多种，如可通 过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC是⑶9 +、⑶10+、⑶44+、⑶54+、 CD98+、Tie-2+ (血管生成素受体)、TEM-7+ (肿瘤血管内皮标志物7)、CD31' CD34' CD45' ⑶133 _、⑶143 _、⑶146 _和CXCR4 _，如可通过免疫定位确定的。在任何上述实施方式的另 一种【具体实施方式】中，AMDAC是"VE-钙粘素"，如可通过免疫定位确定的。在另一种具体的 实施方式中，所述AMDAC另外对⑶105+和⑶200 +是阳性的，如可通过免疫定位确定的。在 另一种具体的实施方式中，在暴露于50ng/mL VEGF7天后，所述AMDAC不表达⑶34,如可通 过免疫定位确定的。
[0018] 在其他具体的实施方式中，对治疗辐射损伤或者治疗患有辐射损伤的个体有用， 和/或在造血重建方法中有用（例如，在治疗将受益于造血重建的疾病中有用）的AMDAC 贴壁至组织培养表面；其中所述AMDAC是0CT-4 _，如可通过RT-PCR确定的，和⑶49f+、 HLA-G'⑶90+、⑶105+和⑶117 '如可通过免疫定位确定的；并且其中所述AMDAC : (a)表达 CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFRl/Flt-l 或 VEGFR2/KDR (CD309)中 的一种或多种，如可通过免疫定位确定的；（b)缺乏⑶31、⑶34、⑶38、⑶45、⑶133、⑶143、 ⑶144、⑶146、⑶271、CXCR4、HLA-G或VE-钙粘素的表达，如通过免疫定位可确定的，或缺 乏 SOX2 的表达，如可通过 RT-PCR 确定的；（c)表达 ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、 ANGPT2、ANGPTLI、ANGPTL2、ANGPTL4、BAII、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COLl5A1、COLl8A1、 C0L4A1、C0L4A2、C0L4A3、CSF3、CTGF、CXCLl2、CXCL2、DNMT3B、ECGFl、EDGl、EDIL3、ENPP2、 EPHB2、FBLN5、F2、FGFl、FGF2、FIGF、FLT4、FNl、FST、F0XC2、GRN、HGF、HEYl、HSPG2、IFNBl、 IL8、ILl2A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MY0Z2、NRPl、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、 PECAM1、PF4、PGK1、PR0X1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、HMP2、HMP3、TGFA、 TGFBl、THBSl、THBS2、TIEl、TIE2/TEK、TNF、TNNII、TNFSF15、VASHl、VEGF、VEGFB、VEGFC、 VEGFR1/FLT1 或VEGFR2/KDR的mRNA ;(d)表达蛋白质CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β 2-微 球蛋白、⑶349、⑶318、H)L1、⑶106、半乳凝素-1、ADAM17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、 α -辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、 Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C或肌球蛋白重链，非 肌A型中的一种或多种；（e)向培养AMDAC的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、 卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-I、PDGF-BB、--ΜΡ-2、uPAR 或半乳凝素 -I ; (f)以高于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA :miR-17-3p、miR-18a、 miR-18b、miR-19b、miR-92或miR-296 ;(g)以低于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平 表达下述微小 RNA :miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b 或 miR-16 ; (h)表达下 述 miRNA :miR-17_3p、miR_18a、miR_18b、miR_19b、miR-92、miR_20a、miR_20b、miR-296、 miR-221、miR-222、miR-15b 或 miR-16 ;和 / 或（i)与在 21%02条件下 CD202b、IL-8 或 VEGF 的表达相比，当在低于约5%02中培养时，表达较高水平的⑶202b、IL-8或VEGF。
[0019] 本文所提供的治疗暴露于辐射(例如，患有辐射损伤）的个体和/或治疗将受益于 造血重建的疾病的方法可以使用包含本文所述的任何AMDAC的细胞群体，其中所述群体中 至少50%的细胞，所述群体中至少80%的细胞或所述群体中至少90%的细胞是所述AMDAC。 在具体的实施方式中，所述群体还包含分离的第二类型细胞，并且其中所述群体不是羊膜、 羊膜的一部分或羊膜匀浆。在具体的实施方式中，所述第二类型细胞是造血干细胞或祖细 胞，例如，CD34+细胞。在其他更具体的实施方式中，所述第二类型细胞是胚胎干细胞、血细 胞、分离自周围血的干细胞、分离自胎盘血的干细胞、分离自胎盘灌流液的干细胞、分离自 胎盘组织的干细胞、分离自脐带血的干细胞、脐带干细胞、骨髓源间质干细胞、骨髓源间充 质基质细胞、造血干细胞、成体干细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌肉细胞（muscle cell)、内 皮细胞、成血管细胞、内皮祖细胞、外膜细胞、心肌细胞、肌细胞（myocyte)、心肌成肌细胞、 成肌细胞或操纵以类似于胚胎干细胞的细胞。在某些更具体的实施方式中，在所述群体中 所述第二类型细胞包含至少10%或至少25%的细胞。
[0020] 本文所提供的分离的羊膜来源的贴壁细胞和细胞群体不是美国专利 No. 7, 255, 879或美国专利申请公开No. 2007/0275362中所述的分离的胎盘干细胞或细胞 群体。本文所提供的分离的羊膜来源的贴壁细胞也不是内皮祖细胞、羊膜上皮细胞、滋养母 细胞、细胞滋养层、胚胎生殖细胞、胚胎干细胞、获自胚胎内细胞团的细胞或获自胚胎生殖 嵴（gonadal ridge)的细胞。
[0021] 如本文所使用的，术语"约"表示(例如）在所说明的数字或数值的10%内。
[0022] 如本文所使用的，术语"干细胞"定义了在胚胎发育或产后组织置换和修复期间能 够广泛但不必需无限制增殖并且促进多种组织形成的任何给定细胞群体的功能性质。
[0023] 如本文所使用的，术语"祖细胞"定义了在胚胎学发育或产后组织置换和修复期间 能够广泛但不必需无限制增殖并且与干细胞相比能够促进有限类型的多种组织形成的任 何给定细胞群体的功能性质。
[0024] 如本文所使用的，术语"来源于"表示分离自或另外表示纯化自。例如，羊膜来源 的贴壁细胞分离自羊膜。术语"来源于"涵盖了从直接分离自组织(例如，羊膜）的细胞以及 从原代分离细胞培养或扩增的细胞培养的细胞。
[0025] 如本文所使用的，"免疫定位"表示在(例如）流式细胞术、荧光活化细胞分选术、 磁性细胞分选、原位杂交、免疫组织化学等中使用免疫蛋白（例如，抗体或其片段）的化合物 (例如，细胞标志物）的检测。
[0026] 如本文所使用的，术语"分离的细胞"表示与所述分离的细胞来源的组织(例如，羊 膜或胎盘）的其他细胞基本分离的细胞。如果在(例如）细胞收集和/或培养期间从所述细 胞中除去了至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少99%的所述分离的细胞 与之天然相联系的细胞，则细胞是"分离的"。如本文所使用的，术语"分离的细胞群体"表 示与所述细胞群体来源的组织(例如，羊膜）的其他细胞基本分离的细胞群体。
[0027] 如本文所使用的，当所述标志物，例如，通过免疫定位，例如，通过流式细胞术；或 通过RT-PCR是高于背景可检测的，则细胞对特定标志物是"阳性的"。例如，如果⑶105在 细胞上是以可检测大于背景的量可检测的（与(例如）同型对照相比)，则将细胞描述为对 (例如）CD105是阳性的。在(例如）抗体介导的检测的背景中，作为存在特定细胞表面标志 物的指征，"阳性"表示使用对该标志物特异的抗体(例如，荧光标记抗体)，该标志物是可检 测的；"阳性"还表示细胞具有在(例如)流式细胞仪中产生可检测高于背景或高于同型对照 的信号的量的标志物。例如，当用对CD105特异的抗体可检测地标记细胞并且来自该抗体 的信号可检测地高于对照(例如，背景)时，该细胞是"CD105+"。相反，在相同背景中，"阴性" 表示使用对该标志物特异的抗体，与背景相比，细胞表面标志物是不可检测的。例如，当细 胞未用对⑶34特异的抗体可检测地标记时，则细胞是"⑶34 _ "。除非在本文中另作说明， 否则使用抗体检测分化("⑶"）标志物簇。例如，如果使用RT-PCR (例如）30个循环，0CT-4 的mRNA是可检测的，则能够确定0CT-4是存在的，并且细胞是0CT-4+。 4.【专利附图】

【附图说明】
[0028] 图1示出了羊膜来源的贴壁细胞和NTERA-2细胞的干细胞相关基因的表达。
[0029] 图2示出了羊膜来源的贴壁细胞（AMDAC)的细胞表面上的TEM-7的表达。
[0030] 图3示出了通过羊膜来源的贴壁细胞的所选血管生成蛋白的分泌。图3Α:--ΜΡ1、 --ΜΡ2、促血小板生成素、VEGF和VEGF-D的分泌。图3Β :血管生成素、EGF、ENA-78、bFGF和 GRO的分泌。图3C :干扰素 γ、IGF-l、IL-6、IL-8和致轻素的分泌。图3D :MCP-1、PDGF-BB、 P1GF、RANTES和TGFP 1的分泌。P6 :传代6次时的AMDAC。对照：无抗体。多个对照的值 基本为0。密度值：Kodak Gel Logic 2200成像系统上的输出值。
[0031] 图4示出了暴露于辐射并施用载体对照、暴露于辐射并施用AMDAC或Neupogen ? ，或仅施用载体对照的小鼠组的存活曲线。
[0032] 图5示出了仅施用载体对照（A组)、暴露于辐射并施用载体对照（B组）或暴露于 辐射并施用指定剂量的AMDAC (C组和D组）的小鼠组的存活曲线。
[0033] 图6示出了获自仅施用载体对照、暴露于辐射并施用载体对照或暴露于辐射并施 用指定剂量的AMDAC的小鼠的某些血液学分析的比较结果。P值表明暴露于辐射和用载体 对照处理(左数第二条棒）的小鼠之间的显著差异。A :血细胞比容（HCT)的比较。B :血红 蛋白（HGB)的比较。C :红细胞计数（RBC)的比较。
[0034] 图7提供了 FACS分析的结果。A :仅施用载体对照，暴露于辐射并施用载体对照或 暴露于辐射并施用指定剂量的AMDAC的小鼠的骨髓源细胞的c-kit和sca-Ι表达的图。B : 暴露于辐射并施用载体对照或暴露于辐射并施用指定剂量的AMDAC的小鼠中造血干细胞 和祖细胞的频率。
[0035] 5.详细说明
[0036] 5. L辐射损伤的治疗
[0037] 在一个方面，本文提供了治疗已暴露于辐射的个体(例如，患有辐射损伤的个 体）的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的如在本文其他地方所述的分离的羊膜来 源的贴壁细胞(AMDAC)，其中所述细胞贴壁至组织培养表面，并且其中所述细胞是OCT-f (P0U5F1 ;八聚物结合蛋白4)，如可通过RT-PCR确定的。治疗有效量是使得辐射损伤的一 种或多种症状的消除、可检测改善、严重程度的减轻、发展的减缓、出现的减少或出现的防 止的AMDAC的数目。在具体的实施方式中，所述一种或多种症状包括恶心、呕吐、腹泻、发烧 和/或头痛中的一种或多种。在其他具体的实施方式中，所述一种或多种症状包括紫癜、虚 弱、疲劳、感染、脱发、暴露组织的水泡或坏死、和/或出血。在其他的【具体实施方式】中，所述 一种或多种症状包括神经功能缺损、认知损害、共济失调、震颤和/或癫痫。在另一种具体 的实施方式中，所述一种或多种症状包括白细胞减少。
[0038] 所述暴露可能是偶然的，例如，在(例如）核机构、研究机构或医院工作期间的暴 露，在此期间所述暴露不是故意的或者是由于个体处于已被放射性材料污染的区域(例如， 核爆炸或核电站事故周围区域)中所造成的。所述暴露还可能是由军事行动的附属部分(例 如，核武器打击)所造成的。所述暴露还可能是故意的，例如，作为与核事故(例如，核反应堆 事故)相伴的补救或清理活动的一部分的暴露，或作为医学程序的一部分的暴露。在该实施 方式中，医学程序可以是(例如）与头、胸部、胸廓、腹部或其他身体部分有关的一种或多种 X射线程序。所述医学程序也可以是头、胸部、胸廓、腹部或其他身体部分的CT扫描。所述 医学程序也可以是部分或完全辐射诱导的脊髓抑制。在该实施方式中，"部分"脊髓抑制表 示暴露于足够强度和持续时间的辐射以杀死个体中的一些骨髓细胞，但并非全部的骨髓细 胞；相反，"完全"脊髓抑制则表示暴露于足够强度和持续时间的辐射以杀死个体中基本全 部骨髓细胞以保持个体生命，例如，需要医学看护的暴露，例如，干细胞移植，例如，骨髓移 植。
[0039] 对于开始AMDAC治疗，个体不需要确实诊断为辐射病或放射性暴露的任何症状； 个体已暴露于辐射的指示就足够了。
[0040] 个体中的辐射损伤可以是由任何类型的辐射所引起的。在某些实施方式中，所述 辐射是电离辐射。在一种具体的实施方式中，所述电离辐射是β辐射、Y幅射或X射线。 在另一种实施方式中，所述辐射是α-辐射。在另一种实施方式中，所述辐射是中子辐射。 所述个体可以已经历了全身辐射，例如，其中身体的所有部分接受了相同或基本相同的放 射性暴露。所述个体还可以已经历了局部辐射，例如，仅个体身体的一部分的辐射。
[0041] 在某些实施方式中，所述个体经历的导致辐射损伤的放射性暴露是急性的，即，单 次暴露或短时间暴露(例如，小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时)的结果。在某些 实施方式中，所述急性暴露是亚致死的。在其他实施方式中，所述急性暴露是致死的，例如， 如果未经治疗，则会在暴露后 21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或1天内导致所述个体死亡。在某些其他实施方式中，所述个体经历的导致辐射损伤的放 射性暴露是慢性的，即，在例如1-70天或更长时间的过程中的积累。例如，由于在放射区域 中工作延长的时间；在放射区域中生活延长的时间等，所述个体会慢性暴露于辐射。在某些 其他实施方式中，所述暴露是基本慢性的。"基本慢性暴露"可以包括(例如）在数天、数周 或数月的一段持续时间内暴露，在此期间暴露是不连续的但是慢性的，例如，在特定地点随 辐射源风向转变暴露。在某些实施方式中，所述慢性暴露在不进行治疗的情况下不会最终 致死。在其他实施方式中，所述慢性暴露在不进行治疗的情况下是最终致死的。
[0042] 在具体的实施方式中，所述辐射是急性的，例如，0· OlmSv (毫西弗）至0· ImSv (0· OOlrem至0· Olrem之间）的单一剂量；是急性的,例如，ImSv至10mSv(0· Irem至I. Orem 之间）（0· OOlGy (戈瑞）至0· OlGy之间，或者0· IcGy (厘戈瑞）至I. OcGy之间）的单一剂 量；是急性的，例如，IOmSv至IOOmSv (Irem至IOrem之间）（0· OlGy至0· IGy之间，或IcGy 至IOcGy之间）的单一剂量；是急性的，例如，IOOmSv至IOOOmSv (IOrem至IOOrem之间） (0· IGy 至 I. OGy 之间，或者 IOcGy 至 IOOcGy 之间）的单一剂量；IOOOmSv 至 2000mSv(100rem 至200rem之间）（IGy至2Gy之间，或者IOOcGy至200cGy之间）的单一剂量；是急性的，例 如，2000mSv 至 3000mSv (200rem 至 300rem 之间）（2Gy 至 3Gy 之间，或者 200cGy 至 300cGy 之间）的单一剂量；是急性的，例如，3000mSv至4000mSv (300rem至400rem之间）（3Gy至 4Gy之间，或者300cGy至400cGy之间）的单一剂量；是急性的，例如，4000mSv至5000mSv (400rem至500rem之间）（4Gy至5Gy之间，或者400cGy至500cGy之间）的单一剂量；或者 5000mSv 至 10000mSv(500rem 至 IOOOrem 之间）（5Gy 至 IOGy 之间，或者 500cGy 至 IOOOcGy 之间）的单一剂量；或者是急性的，例如，IOOOOmSv至lOOOOOmSv (IOOOrem至IOOOOrem之 间）（IOGy至IOOGy之间，或者IOOOcGy至IOOOOcGy之间）的单一剂量。
[0043] 在某些其他实施方式中，所述福射是0. OlmSv至0. ImSv (0. OOlrem至0. Olrem之 间）（0· OOOlGy至0· OOlGy之间，或者0· OlcGy至0· IcGy之间）的慢性暴露；ImSv至IOmSv (0· Irem至I. Orem之间）（0· OOlGy至0· OlGy之间，或者0· IcGy至I. OcGy之间）的慢性暴 露；IOmSv 至 100mSv( Irem 至 IOrem 之间）（0· OlGy 至 0· IGy 之间，或者 IcGy 至 IOcGy 之间） 的慢性暴露；IOOmSv 至 IOOOmSv (IOrem 至 IOOrem 之间）（0. IGy 至 I. OGy 之间，或者 IOcGy 至 IOOcGy 之间）的慢性暴露；IOOOmSv 至 2000mSv (IOOrem 至 200rem 之间）（IGy 至 2Gy 之 间，或者IOOcGy至200cGy之间）的慢性暴露；2000mSv至3000mSv(200rem至300rem之间） (2Gy 至 3Gy 之间，或者 200cGy 至 300cGy 之间）的慢性暴露；3000mSv 至 4000mSv (300rem 至400rem之间）（3Gy至4Gy之间，或者300cGy至400cGy之间）的慢性暴露；4000mSv至 5000mSv (400rem至500rem之间）（4Gy至5Gy之间，或者400cGy至500cGy之间）的慢性 暴露；5000mSv 至 IOOOOmSv (500rem 至 IOOOrem 之间）（5Gy 至 IOGy 之间，或者 500cGy 至 IOOOcGy 之间）的慢性暴露；或者 IOOOOmSv 至 100000mSv( IOOOrem 至 IOOOOrem 之间)（IOGy 至IOOGy之间，或者IOOOcGy至IOOOOcGy之间）的慢性暴露。
[0044] 在某些具体的实施方式中，所述慢性辐射为1-6天；7-13天；14-27天；28-56天或 者超过56天。在某些其他实施方式中，所述暴露为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。
[0045] 可以预防性施用AMDAC，以改善、降低或预防辐射暴露的一种或多种症状的发展， 例如，辐射病的一种或多种症状。因此，在所述方法的某些实施方式中，在所述施用时，所述 个体已暴露于辐射，但尚未发展急性放射性综合征的一种或多种症状。或者作为另外一种 选择，还可以在已发展或显示出辐射暴露的一种或多种症状后向所述个体施用AMDAC。
[0046] 在具体的实施方式中，个体在医学环境中暴露于所述辐射。在一种更具体的实施 方式中，所述个体由于脊髓抑制（myeloablation)的目的暴露于所述福射。在更具体的实 施方式中，所述脊髓抑制是部分的（即，所述个体的至少一些骨髓细胞在辐射处理中存活， 或者计算所述剂量以达到该目的）或完全的（即，辐射暴露旨在杀死所述个体基本所有的骨 髓细胞；或者辐射暴露需要干细胞移植，例如，骨髓移植，以保持所述个体的生命)。在其他 具体的实施方式中，出于另外的医学目的(例如，身体的一个或多个部位的成像)，所述个体 已暴露于福射。
[0047] 在其他实施方式中，所述个体已在非医学环境(例如，在工作场所，例如，核动力机 构、研究机构或核武器机构）中暴露。
[0048] 在另一种实施方式中，所述个体暴露于来自未接触所述个体身体的源的辐射。在 另一种实施方式中，所述个体由于接触所述个体身体的放射源而暴露于辐射。在一种具体 的实施方式中，由于所述个体吸入或摄入放射源，例如，摄入(例如）放射性水、食品、灰尘、 空气等中的放射性磷、硫、锶、碘、铯、铀、钚等，而使得所述个体暴露于辐射。
[0049] 在某些具体的实施方式中，所述施用在所述暴露的96小时内；在所述暴露的72小 时内；在所述暴露的48小时内；在所述暴露的24小时内；在所述暴露的12小时内；在所述 暴露的6小时内；或在所述暴露的3小时内发生。在某些其他【具体实施方式】中，所述施用在 所述暴露检测的96小时内；在所述暴露检测的72小时内；在所述暴露检测的48小时内； 在所述暴露检测的24小时内；在所述暴露检测的12小时内；在所述暴露检测的6小时内； 或在所述暴露检测的3小时内发生。在某些实施方式中，在暴露的个体中一显示出辐射暴 露的一种或多种症状本身，例如，恶心、呕吐、腹泻、头痛、身体的暴露部分中的烧灼感等，就 施用AMDAC。
[0050] 在某些实施方式中，在所述施用时所述个体尚未发展急性辐射综合征的一种或多 种症状。在其他实施方式中，由于所述对辐射的暴露，所述个体已发展或有可能发展急性辐 射综合征或急性辐射综合征的症状。在某些实施方式中，将AMDAC治疗性施用于所述个体； 艮P，在暴露已经发生后，例如辐射损伤已经发生后。在某些具体的实施方式中，所述施用在 所述暴露96小时内进行；在所述暴露72小时内进行；在所述暴露48小时内进行；或在所 述暴露24小时内进行。在某些其他实施方式中，例如，在预期暴露于辐射之前约12、11、10、 9、8、7、6、5、4、3、2或1小时内，预防性施用AMDAC。当预期暴露于辐射，例如，所述暴露是医 学程序的一部分或者是在污染区域(例如，核反应堆事故）中或周围工作的一部分时，可以 在暴露前施用AMDAC-次或多次，例如，所述暴露前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时 施用。
[0051] 在某些实施方式中，暴露于辐射的个体的治疗包括AMDAC的单次施用。在其他实 施方式中，暴露于辐射的个体的治疗包括所述AMDAC的多于一次，例如，2、3、4、5、6、7、8、9 或10次施用。
[0052] 在某些实施方式中，本文所提供的治疗方法包括细胞群体的施用，所述细胞群体 包含通过上述标志物组合描述的任何AMDAC，其中所述群体中至少50%的细胞，所述群体中 至少80%的细胞，或所述群体中至少90%的细胞是所述AMDAC。然而，所述细胞群体不是分 离的羊膜或其部分。
[0053] 在一种具体的实施方式中，包含AMDAC的细胞群体还包含分离的第二类型细胞， 例如，对于辐射损伤可以是治疗性的细胞，例如，以足够的量可以重建所述个体的造血系统 的细胞。在某些实施方式中，例如，所述第二类型细胞是造血干细胞，例如，CD34+细胞、间 质干细胞(例如，骨髓源间质干细胞)、骨髓源基质细胞、粗制骨髓（crude bone marrow)等。 在其他具体的实施方式中，所述第二类型细胞是胚胎干细胞、血细胞、分离自周围血的干细 胞、分离自胎盘血的干细胞、分离自胎盘灌流液的干细胞、分离自胎盘组织的干细胞、分离 自脐带血的干细胞、脐带干细胞、成体干细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、内皮细胞、 成血管细胞、内皮祖细胞、外膜细胞、心肌细胞、肌细胞、心肌成肌细胞、成肌细胞或操纵以 类似于胚胎干细胞的细胞，例如，iPS细胞。在某些更具体的实施方式中，在所述群体中所 述第二类型细胞包含至少10%或至少25%的细胞。
[0054] 在某些实施方式中，所述分离的第二类型细胞是干细胞，例如，组织培养表面贴壁 多能细胞，其获自胎盘组织，例如，胎盘干细胞，如美国专利No. 7, 045, 148 ;7, 255, 879 ;和 7, 311，905以及美国专利申请公开No. 2007/0275362中所述的，以上每篇专利的公开内容 以其全部作为参考并入本文。在具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是CD10+、CD341 口 0)105+;0)10+、0)34'0)105+和0)200 +;0)10+、0)34'0)45'0)90+、0)105+和 0)200+;或者 CD10+、CD34'CD45 'CD8(T、CD86 'CD90+、CD105+和 CD200 +。在其他具体的实施方式中，所 述胎盘干细胞是 CD200+和 HLA-G +;CD73 +、CD105+和 CD200 +;CD200 + 和 OCT-4 +;CD73 +、CD105+ 和HLA-G+;0)73 +和⑶105 +，并且当所述群体在允许胚状体样体（embryoid-like body)形 成的条件下培养时，有利于在包含所述干细胞的胎盘细胞群体中形成一种或多种胚状体样 体；或者0CT-4+，并且当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，有利于在包含所 述干细胞的胎盘细胞群体中形成一种或多种胚状体样体；或它们的任意组合。在一种更具 体的实施方式中，所述⑶200+、HLA-G +干细胞是⑶34 '⑶38 '⑶45 '⑶73+和⑶105 +。在 另一种更具体的实施方式中，所述⑶73+、⑶105+和⑶200 +干细胞是⑶34 -、⑶38 -、⑶45 -和 HLA-G+。在另一种更具体的实施方式中，所述CD200+、0CT-4+干细胞是CD34 -、CD38 -、CD45 -、 ⑶73+、⑶105+和HLA-G +。在另一种更具体的实施方式中，所述⑶73+、⑶105+和HLA-G +干细 胞是CD34-、CD45-、0CT-4+和CD200 +。在另一种更具体的实施方式中，所述CD73+和CD105 + 干细胞是0CT-4+、⑶34_、⑶38_和⑶45 _。在另一种更具体的实施方式中，所述0CT-4+干 细胞是⑶73+、⑶105+、⑶200+、⑶34'⑶38-和⑶45 '在另一种更具体的实施方式中，所 述胎盘干细胞是母体来源的（即具有母体基因型)。在另一种更具体的实施方式中，所述胎 盘干细胞是胎儿来源的（即具有胎儿基因型)。
[0055] 与每个群体中总有核细胞的数目相比，AMDAC可以以约100, 000, 000:1、 50, 000, 000:1、20, 000, 000:1、10, 000, 000:1、5, 000, 000:1、2, 000, 000:1、1，000, 000:1、 500, 000:1、200, 000:1、100, 000:1、50, 000:1、20, 000:1、10, 000:1、5, 000:1、2, 000:1、 1，000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1;1:2 ;1:5 ;1:10 ;1:100 ; 1:200 ；1:500 ；1:1, 000 ；1:2, 000 ；1:5, 000 ；1:10, 000 ；1:20, 000 ；1:50, 000 ；1:100, 000 ； 1:500,000 ；1:1,000, 000 ；1:2,000, 000 ；1:5, 000, 000 ； 1:10, 000, 000 ；1: 20, 000, 000 ； 1:50, 000, 000或约1:100, 000, 000的比率与多个另一种类型的细胞组合，例如，与干细胞 群体组合。
[0056] 5. 2.造血重建
[0057] 在另一个方面，本文提供了在对其有需要的受试者中（例如，在已遭受造血干细胞 部分或全部丧失的受试者中）诱导造血重建(例如，部分或完全造血重建）的方法，包括向所 述受试者施用治疗有效量的分离的AMDAC。因此，AMDAC可以用于治疗将受益于造血重建的 疾病/病症的方法中。
[0058] 如本文所使用的，造血重建是指其中受试者中造血谱系的一种或多种细胞(例如， 一种或多种造血干细胞）的数目和/或类型增加的现象，例如，相对于未用这种治疗中的数 目和/或类型，由于使用AMDAC治疗而引起的增加。不希望受到理论束缚，由于使用AMDAC 治疗，造血谱系细胞的数目和/或类型的增加可以是由AMDAC对这些细胞的直接或间接作 用所导致的。可以使用本领域技术人员已知的方法，例如，FACS分析和血液学分析，例如，红 细胞计数、血细胞比容和血红蛋白水平(参见，例如，以下实施例4)，来评价造血重建现象。
[0059] 在一种具体的实施方式中，指明进行造血重建的遭受部分或完全造血干细胞损失 的受试者已暴露于辐射(例如，致死或次致死剂量的辐射)。在另一种具体的实施方式中，受 试者未暴露于辐射。在某些实施方式中，受试者经历了脊髓抑制，例如，作为癌症疗法(例 如，化疗、免疫疗法）或其他疗法的一部分的脊髓抑制。
[0060] 在一种具体的实施方式中，AMDAC可用于重建骨髓衰竭或一种或多种主要造血系 的产生遗传性或先天性减少的受试者的造血系统。根据该实施方式可以治疗的与骨髓衰竭 有关的病症非限制性地包括再生障碍性贫血，例如，遗传性再生障碍性贫血(如，范科尼贫 血和脊髓发育不良综合征）和获得性再生障碍性贫血，如由于暴露于辐射、药物和/或化学 物质(例如，苯)所造成的贫血。在一种具体的实施方式中，所述获得性贫血不是由于暴露于 福射所造成的。
[0061] 在另一种具体的实施方式中,AMDAC可用于重建患有贫血的受试者的造血系统，所 述贫血包括但不限于慢性疾病（如慢性肾病或肝病）贫血；自身免疫性溶血性贫血；血红蛋 白病和地中海贫血，如镰刀形红细胞病，或α-地中海贫血或者β-地中海贫血。
[0062] 在另一种具体的实施方式中，AMDAC可用于重建受试者的造血系统，所述受试者 患有单纯红细胞再生障碍性贫血，例如，作为原发性病症存在的单纯红细胞再生障碍性贫 血，所述原发性病症如自身免疫性红细胞再生障碍性贫血或白血病前期红细胞再生障碍性 贫血；或作为与以下疾病有关的继发性病症存在的单纯红细胞再生障碍性贫血，所述疾病 如恶性血液病，例如，慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、 慢性粒细胞性白血病、骨髓纤维化、原发性血小板增多症或急性淋巴母细胞性白血病；实体 瘤，例如，胃癌、乳腺癌或胆管腺癌、肺鳞状细胞癌、甲状腺癌、肾细胞癌或卡波西肉瘤；慢性 淋巴细胞性贫血；药物和化学物质，例如，别嘌醇、咪唑硫嘌呤、头孢噻吩、雌激素、非诺洛 芬、氟烷、异烟肼、苯巴比妥、磺胺噻唑或利福平；或严重肾衰竭。
[0063] 在某些实施方式中，已暴露于导致受试者中造血系细胞数目和/或类型减少的条 件(例如，辐射或脊髓抑制）的受试者中的造血重建是指，相对于用AMDAC治疗前所述受试 者中这些细胞的数目和/或类型和/或如果所述受试者不暴露于导致造血谱系细胞数目减 少的条件，则将预期在所述受试者中存在的这些细胞的数目和/或类型，所述受试者中的 造血系细胞的数目和/或类型增加。在某些实施方式中，遭受将受益于造血重建的疾病或 病症的受试者中的造血重建是指相对于用AMDAC治疗前所述受试者中这些细胞的数目和/ 或类型和/或如果所述受试者未遭受导致造血系细胞数目减少的疾病或病症，则将预期在 所述受试者中存在的这些细胞的数目和/或类型，所述受试者中的造血谱系细胞的数目和 /或类型增加。
[0064] 5. 3.羊膜来源贴壁细胞的特征
[0065] 在本文所提供的治疗辐射损伤和造血重建的方法中有用的AMDAC可通过如下 所述的两步分离程序获自羊膜，贴壁至细胞培养表面，例如，贴壁至组织培养塑料，其是 〇CT-4_ (八聚物结合蛋白4)，如通过RT-PCR可确定的，并且显示出下列一些或全部特征。 [0066] AMDAC显示出将它们与其他羊膜来源或胎盘来源的细胞相区分的细胞标志物。例 如，在一种实施方式中，〇CT-4_AMDAC另外还是⑶49f+，如可通过免疫定位确定的。在另一 种具体的实施方式中，所述AMDAC是HLA-G_，如通过RT-PCR确定的。在另一种具体的实施 方式中，所述0CT-4-AMDAC是VEGFRl/Flt-Γ (血管内皮生长因子受体1)和/或VEGFR2/ KDR+ (血管内皮生长因子受体2)，如可通过免疫定位确定的。在一种具体的实施方式中，所 述OCT-f AMDAC表达的0CT-4的(例如)20个循环的PCR扩增的mRNA比相同数目的NTERA-2 细胞在相同数目的RNA扩增循环时少至少21og。在另一种具体的实施方式中，所述0CT-4_ AMDAC是⑶90+、⑶105+或⑶117 '在一种更具体的实施方式中，所述OCT-f AMDAC是 ⑶90+、⑶105+和⑶117 _，例如，如可通过免疫定位确定的。在一种更具体的实施方式中，所 述八10^(：是0(：1'-^和/或!11^-6'并且另外还是0)49广0)90 +、0)105+和/或0)117'例 如，如可通过免疫定位确定的。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是0CT-4_、HLA-G_、 ⑶49f+、⑶90+、⑶105+和⑶117 _，例如，如可通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方 式中，所述〇CT-4_AMDAC不表达S0X2,例如，如可通过RT-PCR30个循环确定的。因此，在一 种具体的实施方式中，所述细胞是〇CT-4_、⑶49f+、⑶90+、⑶105+和⑶117 _，如可通过免疫 定位确定的，和S0X2-，如可通过RT-PCR (例如）30个循环确定的。
[0067] 在另一种实施方式中，所述0(：1'-4110^(：是0)29+、0)73+、48(：-? +和0)38-中的一 种或多种，如通过免疫定位所确定的。
[0068] 在另一种具体的实施方式中，例如，所述OCT-4 _ AMDAC另外还是⑶9+、⑶10+、 CD44+、CD54+、CD98+、TEM-7+ (肿瘤血管内皮标志物 7 )、CD31' CD34 ' CD45 ' CD 133 ' CD 143-(血管紧张素 I转化酶，ACE)、⑶146_ (黑素瘤细胞粘附分子）或CXCR4-(趋化因子（C-X-C 基序）受体4)中的一种或多种，如通过免疫定位确定的，或HLA-G_，如通过RT-PCR确定 的。在一种更具体的实施方式中，所述细胞是⑶9 +、⑶10+、⑶44+、⑶54+、⑶98+、Tie-2+、 TEM-7+、CD31' CD34' CD45 ' CD133 ' CD143 ' CD146-和 CXCR4 ' 如通过免疫定位确定的， 和HLA-G'如通过RT-PCR确定的。在一种实施方式中，本文提供的羊膜来源的贴壁细胞是 ⑶31 _、⑶34_、⑶45_和/或⑶133 -中的一种或多种。在一种具体的实施方式中，所述羊 膜来源的贴壁细胞是0CT-4-，如通过RT-PCR确定的；VEGFRl/Flt-Γ和/或VEGFR2/KDR +， 如通过免疫定位确定的；和⑶31 _、⑶34_、⑶45_和/或⑶133 -中的一种或多种或全部。 [0069] 在另一种具体的实施方式中，所述细胞另外还是VE-钙粘素 '如通过免疫定位确 定的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞另外还对⑶105+和⑶200+呈阳性，如通过免疫 定位确定的。在另一种具体的实施方式中，在暴露于1至l〇〇ng/mL VEGF4至21天后，所述 细胞不表达⑶34,如通过免疫定位所检测的。在更具体的实施方式中，在暴露于25至75ng/ mLVEGF4至21天后，或暴露于50ng/mL VEGF4至21天后，所述细胞不表达⑶34,如通过免 疫定位所检测的。在更加具体的实施方式中，在暴露于1、2. 5、5、10、25、50、75或lOOng/mL VEGF4至21天后，所述细胞不表达⑶34,如通过免疫定位所检测的。在更加具体的实施方 式中，在暴露于1至100ng/mL VEGF7至14天(例如，7天)后，所述细胞不表达⑶34,如通过 免疫定位所检测的。
[0070] 在具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞是0CT-4_，如通过RT-PCR确定 的，和 VE-钙粘素 ' VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+和 / 或 CD200 + 中的一种或多种，如 通过免疫定位确定的。在一种具体的实施方式中，所述羊膜来源的细胞是0CT-4'如通过 RT-PCR确定的，和VE-钙粘素'VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105 +和/或CD200 +，如通过免 疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，例如，在暴露于1至100ng/mLVEGF4至21天 后，所述细胞不表达CD34,如通过免疫定位所检测的。
[0071] 在另一种实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞是0CT-4_、⑶49f+、HLA-G' ⑶90+、⑶105+和⑶117 '在一种更具体的实施方式中，所述细胞是⑶9+、⑶10+、⑶44+、⑶54+、 CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31'CD34'CD45'CD133、CD143'CD146 -或CXCR4-中的一种或 多种，如通过免疫定位确定的。在一种更具体的实施方式中，所述细胞是CD9 +、CD10+、CD44+、 CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31' CD34 ' CD45 ' CD133、CD143、CD146-和 CXCR4、如 通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞另外还是VEGFRl/Flt-Γ和 /或VEGFR2/KDR+，如通过免疫定位确定的；和CD31' CD34 ' CD45 ' CD133 -和/或Tie-2 -中的一种或多种，如通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞另外还是 VEGFRl/Flt-Γ、VEGFR2/KDR+、CD31、CD34、CD45、CD133-和 Tie-2、如通过免疫定位确 定的。
[0072] 在另一种实施方式中，所述0(^-4_羊膜来源的贴壁细胞另外是⑶9+、⑶10+、 CD44+、CD49f+、CD54+、CD90+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFRl/Flt-Γ和 / 或VEGFR2/KDR+ (⑶309+)中的一种或多种或者全部，如通过免疫定位确定的；或者另外是 CD31' CD34 ' CD38 ' CD45 ' CD 117 ' CD 133 ' CD 143 ' CD 144 ' CD 146 ' CD271' CXCR4 _、 HLA-GlP /或VE-钙粘素_中的一种或多种或者全部，如通过免疫定位确定的，或者是 S0X2 '如通过RT-PCR确定的。
[0073] 在某些实施方式中，所述分离的组织培养塑料贴壁的羊膜来源的贴壁细胞是 ⑶49f+。在一种具体的实施方式中，所述⑶49f +细胞另外还是⑶9+、⑶10+、⑶44+、⑶54+、 CD90+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2 +、TEM-7+、VEGFRl/Flt-llP/*VEGFR2/KDR + (CD309+)* 的一种或多种或者全部，如通过免疫定位确定的；或者另外是⑶31 _、⑶34_、⑶38_、⑶45_、 CD 117、CD 133、CD 143、CD 144、CD 146、CD271、CXCR4 ' HLA-G ' 0CT-4-和 / 或 VE-钙 粘素+中的一种或多种或者全部，如通过免疫定位确定的，或者是S0X2 '如通过RT-PCR确 定的。
[0074] 在某些其他实施方式中，所述分离的组织培养塑料贴壁的羊膜来源的贴壁细胞是 HLA-G'⑶90+和⑶117 '在一种具体的实施方式中，所述HLA-G-、⑶90+和⑶117 _细胞 另外还是 CD9+、CD10+、CD44+、CD49f+、CD54+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFRl/ Flt-Γ和/或VEGFR2/KDR + (⑶309+)中的一种或多种或者全部，如通过免疫定位确定的；或 者另外是 CD31' CD34' CD38 ' CD45 ' CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4' 0CT-41P /或VE-钙粘素_中的一种或多种或者全部，如通过免疫定位确定的，或者是 S0X2 '如通过RT-PCR确定的。
[0075] 在另一种实施方式中，所述分离的羊膜来源的贴壁细胞或羊膜来源的生血管细胞 群体不会组成性地表达成纤维细胞生长因子4(FGF4)、干扰素 γ (IFNG)、趋化因子（C-X-C 基序)配体10(CXCL10)、血管生成素4(ANGPT4)、血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)、纤维蛋白 原α链（FGA)、致轻素（LEP)、促乳泌素（PRL)、激动素原蛋白I (PR0K1)、腱调蛋白（TNMD)、 FMS样酪氨酸激酶3 (FLT3)、含胞外连接域蛋白I (XLKD1)、2型钙粘素5 (⑶Η5)、白血球 细胞来源的化学吸引素 I (LECT1)、纤溶酶原（PLG)、末端酶反转录酶（TERT)、（性别决定区 Y)-框蛋白2(S0X2)、NAN0G、基质金属蛋白酶13(MMP-13)、远端较小的同源异形盒5(DLX5) 和/或骨Y羧基谷氨酸盐（gla)蛋白（BGLAP)的mRNA，如在标准培养条件下通过RT-PCR (例如）30个循环确定的。在其他实施方式中，分离的羊膜来源的贴壁细胞或羊膜来源的生 血管细胞群体表达（ARNT2)、神经生长因子（NGF)、脑源性神经营养因子（BDNF)、胶质源性 神经营养因子（⑶NF)、神经营养蛋白3 (NT-3)、NT-5、缺氧诱导因子la (HIF1A)、缺氧诱导 因子2 (HIG2)、血红素加氧酶(解环）1 (HM0X1)、胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn] (S0D3)、过 氧化氢酶（CAT)、转化生长因子β? (TGFB1)、转化生长因子β?受体（TGFBlR)和肝细胞生 长因子受体（HGFR/c-met)的mRNA。
[0076] 在另一个方面，本文提供了包含本文所述的羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群 体。所述细胞群体可以是同源（homogeneous)群体，例如，至少约90%、95%、98%或99%是羊 膜来源的贴壁细胞的细胞群体。所述细胞群体可以是异源（hetergeneous)的，例如，其中 所述群体中至多约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的细胞是羊膜来源的贴壁细胞的 细胞群体。然而，所述分离的细胞群体不是组织，即羊膜。
[0077] 在一种实施方式中，本文提供了包含AMDAC的分离的细胞群体，例如，对于AMDAC 基本同源的细胞群体，其中所述AMDAC贴壁至组织培养塑料，并且其中所述AMDAC是 0CT-4 _，如通过RT-PCR确定的。在一种具体的实施方式中，所述AMDAC是⑶49f+或HLA-G +， 例如，如通过免疫定位或RT-PCR确定的。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC群体是 VEGFRl/Flt-Γ和/或VEGFR2/KDR+，如通过免疫定位确定的，其中所述分离的细胞群体不 是羊膜（amnion)或羊膜（amniotic membrane)。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC 是 0CT-4-和 / 或 HLA-G ' 如通过 RT-PCR 确定的，和 VEGFRl/Flt-Γ和 / 或 VEGFR2/KDR +， 如通过免疫定位确定的。在一种具体的实施方式中，所述群体中至少约50%、60%、70%、80%、 90%、95%、98%或99%的细胞是所述羊膜来源的贴壁细胞。在另一种具体的实施方式中，所 述AMDAC是⑶90+、⑶105+或⑶117 '在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是⑶90+、 ⑶105+和⑶117 '在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是0CT-4'⑶49f+、⑶90+、⑶105+ 和⑶117_。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC不表达SOX2,例如，如通过RT-PCR30 个循环可确定的。在一种更加具体的实施方式中，所述群体包含AMDAC，其中所述AMDAC是 OCT-4 'HLA-G '⑶49f+、⑶90+、⑶105+和⑶117 '如通过免疫定位或流式细胞术确定的，和 SOX2 -，例如，如可通过RT-PCR30个循环确定的。
[0078] 在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体中的所述AMDAC是⑶90+、⑶105+或 CDl 17 '如通过免疫定位或流式细胞术确定的。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是 ⑶90+、⑶105+和⑶117 _，如通过免疫定位或流式细胞术确定的。在一种更具体的实施方式 中，所述AMDAC是0CT-4 -或HLA-G -，例如，如通过RT-PCR确定的，并且另外还是CD49f+、 ⑶90+、⑶105+或⑶117 _，如通过免疫定位或流式细胞术确定的。在一种更具体的实施方式 中，所述细胞群体中的八10^(：是0(：1'-4'!11^-6'0)49浐、0)90 +、0)105+和0)117'在另一 种具体的实施方式中，所述AMDAC不表达S0X2,例如，如可通过RT-PCR30个循环确定的。因 此，在更具体的实施方式中，所述细胞是〇CT-4_、⑶49f+、⑶90+、⑶105+和⑶117 _，如通过免 疫定位或流式细胞术可确定的，和S0X2_，如通过RT-PCR (例如）30个循环可确定的。在一 种更加具体的实施方式中，所述AMDAC是0CT-4_*HLA-G _，并且另外还是⑶49f+、⑶90+、 ⑶105+或⑶117 '在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是OCT-4' HLA-G'⑶49f+、 CD90+、CD105+和 CD117 '
[0079] 在另一种实施方式中，所述细胞群体中的羊膜来源的贴壁细胞贴壁至组织培养塑 料，是0CT-4-，如通过RT-PCR确定的，并且是VEGFRl/Flt-Γ和/或VEGFR2/KDR +，如通过 免疫定位确定的，并且另外还是⑶9+、⑶10+、⑶44+、⑶54+、⑶98+、Tie-2+、TEM-7+、⑶31' ⑶34'⑶45'⑶133'⑶143'⑶146-或CXCR4 _中的一种或多种，如通过免疫定位确定 的，或者是HLA-G'如通过RT-PCR确定的，并且其中所述分离的细胞群体不是羊膜。在另一 种实施方式中，本文提供了包含羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群体，其中所述细胞贴 壁至组织培养塑料，其中所述细胞是〇CT-4_，如通过RT-PCR确定的，并且是VEGFRl/Flt-Γ 和/或VEGFR2/KDR+，如通过免疫定位确定的，其中所述细胞不表达⑶34,如在暴露于1至 100ng/mLVEGF4至21天后通过免疫定位检测的，并且其中所述分离的细胞群体不是羊膜。 在任何上述实施方式的一种【具体实施方式】中，所述群体中至少约50%、60%、70%、80%、90%、 95%、98%或99%的细胞是所述羊膜来源的贴壁细胞。
[0080] 在另一种实施方式中，当在存在胞外基质蛋白（例如，如I型和IV型胶原）或血 管生成因子(例如，如血管内皮生长因子（VEGF)、表皮生长因子（EGF)、血小板源性生长因 子（PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF))的情况下(例如）在基质(如胎盘胶原，例如 MATRIGEL?)中或上培养至少4天并且多至14天时，包含羊膜来源的贴壁细胞的任何上述 细胞群体形成芽（sprout)样或管（tube)样结构。
[0081] 羊膜来源的贴壁细胞和羊膜来源的贴壁细胞群体显示出与血管生成相关或心肌 发生相关基因有关的蛋白质的特征表达。在某些实施方式中，本文提供了表达以下蛋白 中的一种或多种或者全部的RNA的细胞或者其中所述分离的细胞群体中至少约50%、60%、 70%、80%、90%、95%或98%的细胞是表达所述RNA的羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体，所述 蛋白如ACTA2 (肌动蛋白，α 2,平滑肌，主动脉)、ADAMTS1 (具有1型血小板反应蛋白基序的 ADAM金属肽酶1)、AM0T (血管动蛋白）、ANG (血管生成素)、ANGPT1 (血管生成素1)、ANGPT2、 八如?111(血管生成素样蛋白1)、4如?112、4如?114、8411(脑特异性血管生成抑制剂1)、 ⑶44、⑶200、CEACAM1 (癌胚抗原相关细胞粘附分子1)、CHGA (嗜铬粒蛋白A)、C0L15A1 (胶 J|C,XVM, a 1)>C0L18A1 (1?, XVIII Μ, α 1)>C0L4A1 (1?, IV Μ, α 1)>C0L4A2 (|$J|C, IV型，a2)、C0L4A3 (胶原，IV型，a3)、CSF3 (集落刺激因子3 (粒性白细胞)）、CTGF (结 缔组织生长因子)、CXCL12 (趋化因子（CXC基序）配体12 (基质细胞衍生因子1))、CXCL2、 DNMT3B (DNA (胞嘧啶-5)-甲基转移酶3β )、ECGFl (胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶)、EDGl (内皮细胞分化基因1)、EDIL3 (EGF-样重复和盘蛋白I-样结构域3)、ΕΝΡΡ2 (核苷酸内焦 磷酸酶/磷酸二酯酶2)、ΕΡΗΒ2 (ΕΡΗ受体B2)、FBLN5 (腓骨蛋白5)、F2 (稳定因子II (凝 血酶)）、FGF1 (酸性成纤维细胞生长因子)、FGF2 (碱性成纤维细胞生长因子)、FIGF (c-fos 诱导生长因子(血管内皮生长因子D))、FLT4 (fms相关酪氨酸激酶4)、FN1 (纤连蛋白1)、 FST (卵泡抑素)、F0XC2 (叉头框蛋白C2 (MFH-1，间充质叉头蛋白1))、GRN (颗粒体蛋白）、 HGF (肝细胞生长因子)、HEY1 (YRPW基序相关多毛或增强子断裂蛋白1)、HSPG2 (硫酸乙酰 肝素蛋白聚糖2)、正他1(干扰素，0 1，成纤维细胞)、11^8(白介素8)、11^12六、几6六4(整合 素，a4;CD49d)、ITGAV (整合素，aV)、ITGB3 (整合素，P3)、MDK (中期因子)、MMP2 (基质 金属蛋白酶2)、MY0Z2 (肌原调节蛋白2)、NRP1 (神经纤毛蛋白1)、NRP2、PDGFB (血小板源 性生长因子β )、H)GFRA (血小板源性生长因子受体a )、TOGFRB、PECAM1 (血小板/内皮细 胞粘附分子)、PF4 (血小板因子4)、PGK1 (磷酸甘油酸激酶1)、PR0X1 (Prospero同源框蛋 白1)、PTN (多效蛋白）、SEMA3F (臂板蛋白3F)、SERPINB5 (丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制 齐[J，分支乙（卵清蛋白），成员5)、SERPINC1、SERPINF1、--ΜΡ2 (组织金属蛋白酶2组织抑制 剂)、HMP3、TGFA (转化生长因子，a)、TGFBl、THBSl (血小板反应蛋白1)、THBS2、TIE1 (免 疫球蛋白样酪氨酸激酶和EGF样结构域1)、TIE2/TEK、TNF (肿瘤坏死因子)、TNNI1 (肌钙 蛋白1，1型)、TNFSF15 (肿瘤坏死因子(配体）超家族，成员15)、VASH1 (血管抑制蛋白1)、 VEGF (血管内皮生长因子)、VEGFB、VEGFC、VEGFRl/FLTl(血管内皮生长因子受体l)和/或 VEGFR2/KDR。
[0082] 当使用人细胞时，全部基因标记是指人序列，并且如本领域技术人员公知的，可 以在文献中或在GenBank中查找到代表性序列。可以通过公开可用的序列或通过商业来 源确定针对序列的探针，所述商业来源例如特异性TAQMAN探针或TAQMAN血管生成阵列 (Applied Biosystems，部件号 No. 4378710)。
[0083] 羊膜来源的贴壁细胞和羊膜来源的贴壁细胞群体显示出血管生成相关蛋白的特 征表达。在某些实施方式中，本文提供了表达以下蛋白的细胞或者其中所述分离的细胞群 体中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是表达所述蛋白的羊膜来源的贴壁细 胞的细胞群体，所述蛋白如⑶49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β 2-微球蛋白、⑶349、⑶318、 PDL1、⑶106、半乳凝素 -UADAM17前体（Α脱整联蛋白及金属蛋白酶结构域17) (TNF-a 转化酶）（TNF-a转化酶)、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A (a-细丝蛋白）（细丝蛋白1) (内皮肌动蛋白结合蛋白）（A B F-280)(非肌肉细丝蛋白）、a-辅肌动蛋白I ( a-辅肌 动蛋白细胞骨架同工型）（非肌肉a-辅肌动蛋白I) (F-肌动蛋白交联蛋白）、低密度脂蛋 白受体相关蛋白2前体（巨蛋白）（糖蛋白330) (gp330)、I型和II型巨噬细胞清道夫受体 (巨噬细胞乙酰化LDL受体I和II)、活化素受体IIB型前体（ACTR-IIB)、Wnt-9蛋白、胶质 原纤维酸性蛋白、星形细胞（GFAP)、肌球蛋白-结合蛋白C、心-型(心MyBP-C) (C-蛋白、 心肌同工型）和/或肌球蛋白重链、非肌肉A型(细胞肌球蛋白重链，A型）（非肌肉肌球蛋 白重链-A) (NMMHC-A)。
[0084] 本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞还分泌促进(例如）内皮细胞、内皮祖细胞等中 血管生成的蛋白。在某些实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞、羊膜来源的贴壁细胞群体或者 包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体(例如，其中所述分离的细胞群体中至少约50%、60%、 70%、80%、90%、95%或98%的细胞是羊膜来源的贴壁细胞）向（例如）细胞生长的培养基中分 泌 VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、 TIMP-2、uPAR、半乳凝素-1中的一种或多种或者全部。
[0085] 在另一种实施方式中，包含羊膜来源的贴壁细胞的任何上述细胞群体可以导致在 与所述羊膜来源的贴壁细胞接触的内皮细胞群体中形成芽样或管样结构。在一种具体的实 施方式中，例如，当在存在胞外基质蛋白（如I型和IV型胶原)和/或血管生成因子(如血管 内皮生长因子（VEGF)、表皮生长因子（EGF)、血小板源性生长因子（PDGF)或碱性成纤维细 胞生长因子（bFGF))的情况下(例如）在基质(如胎盘胶原或MATRIGEL)中或上培养至少4 天和/或多至14天时，所述羊膜来源的生血管细胞与人内皮细胞共培养，从而形成芽样或 管样结构或支持内皮细胞出芽。
[0086] 在另一种实施方式中，当在存在胞外基质蛋白（如I型或IV型胶原）的情况下在 (例如）基质(如胎盘胶原或MATRIGEL)中或上培养时，包含羊膜来源的贴壁细胞的任何上述 细胞群体分泌血管生成因子，如血管内皮生长因子（VEGF)、表皮生长因子（EGF)、血小板源 性生长因子（PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)或白介素 -8 (IL-8)并借此可以诱导 人内皮细胞形成芽样或管样结构。
[0087] 在另一种实施方式中，本文提供了细胞群体，例如，羊膜来源的贴壁细胞群体或者 其中所述分离的细胞群体中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是以高于骨髓 源间质干细胞的水平表达血管原微小RNA(miRNA)的羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体，其中 所述 miRNA 包含 miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92 和 / 或 miR-296 中的一种 或多种或者全部。在另一种实施方式中，本文提供了细胞群体，例如，羊膜来源的贴壁细胞 群体或者其中所述分离的细胞群体中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是以 低于骨髓源间质干细胞的水平表达血管原微小RNA (miRNA)中的一种或多种或者全部的羊 膜来源的贴壁细胞的细胞群体，其中所述miRNA包含miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、 miR-15b和/或miR-16中的一种或多种或者全部。在某些实施方式中，AMDAC或AMDAC群体 表达血管原 miRNA miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b (血 管原 miRNA 簇 17-92 的成员）、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b 和 / 或 miR-16 中的一 种或多种或者全部。
[0088] 因此，在一种实施方式中，本文提供了分离的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞 贴壁至组织培养塑料，并且其中所述细胞是〇CT-4_，如通过RT-PCR确定的，并且是⑶49f+、 HLA-G'⑶90+、⑶105+和⑶117 _，如通过免疫定位确定的，并且其中所述细胞：（a)表达 CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFRl/Flt-Ι 或 VEGFR2/KDR (CD309) 中的一种或多种，如通过免疫定位确定的；（b)缺乏⑶31、⑶34、⑶38、⑶45、⑶133、⑶143、 ⑶144、⑶146、⑶271、CXCR4、HLA-G或VE-钙粘素的表达，如通过免疫定位确定的，或缺乏 S0X2 的表达，如通过 RT-PCR 确定的；（c)表达 ACTA2、ADAMTS1、AM0T、ANG、ANGPT1、ANGPT2、 ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAII、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、C0L15A1、C0L18A1、C0L4A1、 C0L4A2、C0L4A3、CSF3、CTGF、CXCLl2、CXCL2、DNMT3B、ECGFl、EDGl、EDIL3、ENPP2、EPHB2、 FBLN5、F2、FGFl、FGF2、FIGF、FLT4、FNl、FST、F0XC2、GRN、HGF、HEYl、HSPG2、IFNBl、IL8、 IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MY0Z2、NRPI、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAMl、 PF4、PGKl、PROXl、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、--ΜΡ2、--ΜΡ3、TGFA、TGFBl、 THBSl、THBS2、TIEl、TIE2/TEK、TNF、TNNII、TNFSF15、VASHl、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFRl/ FLTl 或 VEGFR2/KDR 的 mRNA ; (d)表达蛋白质 CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β 2-微球蛋 白、⑶349、⑶318、H)L1、⑶106、半乳凝素-1、ADAM17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α -辅 肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋 白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C或肌球蛋白重链，非肌A型中 的一种或多种；（e)向细胞生长的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、 G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-I、PDGF-BB、--ΜΡ-2、uPAR 或半乳凝素 -I ; (f)以高于 同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA :miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、 miR-19b、miR-92或miR-296 ; (g)以低于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微 小 RNA :miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b 或 miR-16 ; (h)表达下述 miRNA : miR-17_3p、miR_18a、miR_18b、miR_19b、miR-92、miR_20a、miR_20b、miR-296、miR-221、 miR-222、miR-15b 或 miR-16 ;和 / 或（i)与在 21%02条件下 CD202b、IL-8 或 VEGF 的表达相 t匕，当在低于约5%02中培养时，表达较高水平的⑶202b、IL-8或VEGF。在一种具体的实施 方式中，所述分离的羊膜来源的贴壁细胞是0CT-4'如通过RT-PCR确定的，并且是⑶49f+、 HLA-G'⑶90+、⑶105+和⑶117 '如通过免疫定位确定的，并且（a)表达⑶9、⑶10、⑶44、 CD54、CD90、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFRl/Flt-Ι 和 / 或 VEGFR2/KDR (CD309)，如通 过免疫定位确定的；（b)缺乏 CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、 CXCR4、HLA-G和/或VE-钙粘素的表达，如通过免疫定位确定的，或缺乏S0X2的表达，如通 过 RT-PCR 确定的；（c)表达 ACTA2、ADAMTS1、AM0T、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、 ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、C0L15A1、C0L18A1、C0L4A1、C0L4A2、C0L4A3、 CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGFl、EDGl、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGFl、 FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、F0XC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、 ITGB3、MDK、MMP2、MY0Z2、NRPI、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAMl、PF4、PGKI、PROXI、PTN、 SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、--ΜΡ2、--ΜΡ3、TGFA、TGFBl、THBSl、THBS2、TIEl、 TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1 和 / 或 VEGFR2/ KDR 的 mRNA ;(d)表达 CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β 2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、 ⑶106、半乳凝素-1、ADAM17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、 巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性 蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C或肌球蛋白重链，非肌A型中的一种或多种；（e) 向（例如）细胞生长的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、 ENA-78、GRO、IL-6、MCP-I、PDGF-BB、--ΜΡ-2、uPAR 和 / 或半乳凝素 -I ; (f)以高于同等数 量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA :miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、 miR-92和/或miR-296 ;(g)以低于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小 RNA :miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b 和 / 或 miR-16 ;(h)表达下述 miRNA : miR-17_3p、miR_18a、miR_18b、miR_19b、miR-92、miR_20a、miR_20b、miR-296、miR-221、 miR-222、miR-15b 和 / 或 miR-16 ;和 / 或（i)与在 21%02条件下 CD202b、IL-8 和 / 或 VEGF 的表达相比，当在低于约5%02中培养时，表达较高水平的⑶202b、IL-8和/或VEGF。本文 还提供了包含AMDAC，例如，AMDAC群体的细胞群体，所述AMDAC具有一种或多种上述列举特 征。
[0089] 在另一种实施方式中，包含羊膜来源的贴壁细胞的任何上述细胞群体分泌血管生 成因子。在具体的实施方式中，所述细胞群体分泌血管内皮生长因子（VEGF)、表皮生长因 子（EGF)、血小板源性生长因子（PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和/或白介素-8 (IL-8)。在其他具体的实施方式中，包含羊膜来源的生血管细胞的细胞群体分泌一种或多 种血管生成因子并借此诱导人内皮细胞在体外伤口愈合测定中迁移。在其他具体的实施方 式中，包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体诱导人内皮细胞、内皮祖细胞、肌细胞或成肌细 胞成熟、分化或增殖。
[0090] 在另一种实施方式中，当在存在胞外基质蛋白（如I型和IV型胶原）和/或一种 或多种血管生成因子(例如，VEGF、EGF、PDGF或bFGF)的情况下(例如）在基质(如胎盘胶原 或MATRIGEL)上培养时，包含羊膜来源的贴壁细胞的任何上述细胞群体吸收乙酰化的低密 度脂蛋白（LDL)。
[0091] 在另一种实施方式中，本文提供了包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体，其中所 述细胞贴壁至组织培养塑料，并且其中所述细胞是0CT-4_，如通过RT-PCR确定的，并且是 VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200 +或VE-钙粘素 '如通过免疫定位确定的。在具体 的实施方式中，所述细胞群体中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或 99%的细胞是羊膜来源的细胞，所述羊膜来源的细胞是0CT-4 '如通过RT-PCR确定的，并且 是VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+或VE-钙粘素 '如通过免疫定位确定的。在 另一种具体的实施方式中，所述群体中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、 98%或99%的细胞是羊膜来源的细胞，所述羊膜来源的细胞是0CT-4 _，如通过RT-PCR确定 的，并且是VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+或VE-钙粘素 '如通过免疫定位确定 的。在另一种具体的实施方式中，在暴露于1至100ng/mL VEGF4至21天后，所述细胞是 0CT-4' 如通过 RT-PCR 确定的，并且是 VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+或 VE-钙 粘素_，如通过免疫定位确定的，并且不表达CD34,如通过免疫定位检测的。在另一种具体 的实施方式中，所述细胞还是VE-钙粘素'
[0092] 本文所提供的包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体能够形成类似于血管或脉管 系统的芽样或管样结构。在一种实施方式中，当在存在血管原部分(例如，VEGF、EGF、TOGF 或bFGF)的情况下培养时，包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体形成芽样或管样结构。在 一种更具体的实施方式中，所述羊膜来源的细胞是0CT-4'如通过RT-PCR确定的，并且是 VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200 +或VE-钙粘素-，如通过免疫定位确定的，当所述细 胞群体在存在血管内皮生长因子（VEGF)的情况下培养时，所述细胞形成芽样或管样结构。 [0093] 在原代培养中或在适合于干细胞培养的培养基中增殖期间，本文所述的羊膜来源 的贴壁细胞显示出上述特征，例如，细胞表面标志物和/或基因表达谱，和/或血管原效力 和功能的组合。这些培养基包括(例如)包含1至100%DMEM-LG(Gibco)、l至100%MCDB-201 (Sigma)、l 至 10% 胎牛血清（FCS) (Hyclone Laboratories)、。· 1 至 5X 膜岛素-转铁蛋 白-硒（ITS, Sigma)、0. 1至5X亚油酸-牛血清白蛋白（LA-BSA，Sigma)、l(T5至KT15M地塞 米松（Sigma)、KT2至10 h°M抗坏血酸2-磷酸酯（Sigma)、1至50ng/mL表皮生长因子（EGF) (R&D Systems)、1 至 50ng/mL血小板源性生长因子（PDGF-BB)(R&D Systems)和 100U青霉素 /1000U链霉素的培养基。在一种具体的实施方式中，所述培养基包含60%DMEM-LG(Gibco)、 40%MCDB-201 (Sigma)、2% 胎牛血清（FCS) (Hyclone Laboratories)、lX 胰岛素 -转铁蛋 白-硒（ITS)、I X亚麻酸-牛血清白蛋白（LA-BSA)、KT9M地塞米松（Sigma)、KT4M抗坏血酸 2-磷酸酯（Sigma)、10ng/mL表皮生长因子（EGF) (R&D Systems)、10ng/mL血小板源性生长 因子（PDGF-BB) (R&D Systems)和IOOU青霉素 /1000U链霉素。其他适合的培养基如下所 述。
[0094] 例如，在容器中，本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞的分离群体可以包含约、至 少约或不超过约 1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X10 7、1X108、5X108、1X109、 5 X IO9UX 101(l、5 X IOltlUX IO11或更多个羊膜来源的贴壁细胞。在多种实施方式中，在本文 所提供的分离的细胞群体中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的细 胞是羊膜来源的贴壁细胞。也就是说，分离的羊膜来源的贴壁细胞群体可以包含(例如）多 至 1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 的非干细胞。
[0095] 本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞可以在基质上培养。在多种实施方式中，所述 基基质可以是在其上可以完成羊膜来源的贴壁细胞的培养和/或选择的任何表面。通常， 所述基质是塑料，例如，组织培养盘或塑料多孔板。可以用生物分子或合成模拟剂(例如， cellstart?、MesenculttmAcf-基质、鸟氨酸或聚赖氨酸）或者胞外基质蛋白（例如，胶原、层 粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白等）处理、涂覆或印迹组织培养塑料。
[0096] 羊膜来源的细胞(例如，本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞）和这些细胞的群体可 以分离自一种或多种胎盘。例如，本文所提供的分离的羊膜来源的细胞群体可以是包含获 自或包含在破裂的羊膜组织(例如，组织消化物（即通过羊膜的酶促消化所获得的细胞收集 物)）的这些细胞的胎盘细胞群体，其中所述细胞群体对于羊膜来源的细胞是富集的，并且 其中所述组织来自于单个胎盘或者两个或更多个胎盘。可以培养并扩增分离的羊膜来源的 细胞，以产生这些细胞的群体。还可以培养并扩增包含羊膜来源的贴壁细胞的胎盘细胞群 体，以产生羊膜来源的贴壁细胞的群体。
[0097] 在某些实施方式中，显示出任何上述标志物和/或基因表达特征的AMDAC已传代 至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次或者更多次。在某些其 他实施方式中，显示出任何上述标志物和/或基因表达特征的AMDAC已在培养中倍增了至 少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或至少 50 次或者 更多次。
[0098] 5.4.获得羊膜来源的生血管细胞的方法
[0099] 可以（例如）通过特定的羊膜组织消化方法，并且随后可选地评价所得细胞或细 胞群体是否存在标志物或标志物的组合，鉴定羊膜来源的贴壁细胞，或者通过获得羊膜细 胞并根据羊膜来源的贴壁细胞的标志物特征选择，来产生(例如，从其他细胞或细胞群体分 离）羊膜来源的贴壁细胞和包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体。
[0100] 可以通过(例如）羊膜组织的消化并随后选择贴壁细胞来产生本文所提供的羊膜 来源的贴壁细胞以及包含羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群体。在一种实施方式中，例 如，能够通过以下步骤产生分离的羊膜来源的贴壁细胞或包含羊膜来源的贴壁细胞的分离 的细胞群体：（1)用第一种酶消化羊膜组织从而使来自羊膜上皮层的细胞与来自羊膜间充 质层的细胞分离；（2)随后用第二种酶消化羊膜的间充质层以形成单细胞悬液；（3)在组织 培养表面(例如，组织培养塑料)上，在所述单细胞悬液中培养细胞；和（4)在改变培养基后， 选择贴壁至所述表面的细胞，由此产生了包含羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群体。在 一种具体的实施方式中，所述第一种酶是胰蛋白酶。在一种更具体的实施方式中，在每克待 消化的羊膜组织5-20 (例如，10)毫升溶液中，以0. 25%胰蛋白酶浓度（w/v)使用所述胰蛋 白酶。在另一种更具体的实施方式中，允许在37°C进行约15分钟的所述用胰蛋白酶的消化 并重复至多三次。在另一种具体的实施方式中，所述第二种酶是胶原酶。在一种更具体的 实施方式中，在5mL每克待消化的羊膜组织中，以50至500U/L的浓度使用所述胶原酶。在 另一种更具体的实施方式中，允许在37°C进行约45-60分钟的所述用胶原酶的消化。在另 一种具体的实施方式中，在步骤（2)至步骤（3)之间通过(例如）75 μ Μ-150 μ M过滤器过滤 胶原酶消化后所形成的单细胞悬液。在另一种具体的实施方式中，所述第一种酶是胰蛋白 酶，并且所述第二种酶是胶原酶。
[0101] 在另一种实施方式中，可以通过选择显示出羊膜来源的贴壁细胞的一种或多种特 征的来自羊膜的细胞，例如，如在本文其他地方所述的通过消化羊膜组织获得的细胞来获 得包含羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群体。在一种实施方式中，例如，通过以下方法产 生细胞群体，所述方法包括选择（a)对0CT-4是阴性的羊膜细胞，如通过RT-PCR确定的，和 (b)对VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200中的一种或多种是阳性的羊膜细胞，如通过免 疫定位确定的；和从其他细胞分离所述细胞，以形成细胞群体。在一种具体的实施方式中， 所述羊膜细胞另外还是VE-钙粘素 '在一种具体的实施方式中，通过选择（a)对0CT-4 (如通过RT-PCR确定的）和对VE-钙粘素(如通过免疫定位确定的）是阴性的胎盘细胞，和 (b)对VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200中的每一个是阳性的胎盘细胞，如通过免疫定 位确定的；和从其他细胞分离所述细胞，以形成细胞群体来产生细胞群体。在某些实施方式 中，在通过RT-PCR进行选择之前进行通过免疫定位的选择。在另一种具体的实施方式中， 所述选择包括在存在1至l〇〇ng/mL VEGF的条件下培养4至21天后选择不表达细胞标志 物⑶34的细胞。
[0102] 在另一种实施方式中，例如，通过以下方法产生细胞群体，所述方法包括选择贴壁 至组织培养塑料并且是0CT-4-(如通过RT-PCR确定的）和VEGFRl/Flt-Γ和VEGFR2/KDR + (如通过免疫定位确定的）的羊膜细胞，以及从其他细胞分离所述细胞以形成细胞群体。在 一种具体的实施方式中，通过以下方法产生细胞群体，所述方法包括选择是0CT-4飞如通过 RT-PCR确定的）和VEGFRl/Flt-Γ、VEGFR2/KDR+和HLA-G -(如通过免疫定位确定的）的羊 膜细胞。在另一种具体的实施方式中，通过选择另外还是⑶9+、⑶10+、⑶44+、⑶54+、⑶98+、 Tie-2+、TEM-7+、CD31' CD34' CD45' CD133' CD143' CD146-和 / 或 CXCR4 -(趋化因子 (C-X-C基序）受体4)中的一种或多种或者全部的羊膜细胞，和从不显示出这些特征中的一 种或多种的细胞分离所述细胞产生了所述细胞群体。在另一种具体的实施方式中，所述细 胞群体是通过选择另外是VE-钙粘素-(如通过免疫定位确定的）的羊膜细胞，和将所述细 胞与VE-钙粘素+细胞分离产生的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体是通过选 择另外是⑶105+和⑶200 + (如通过免疫定位确定的）的羊膜细胞，和将所述细胞与⑶105_ 或⑶200_细胞分离产生的。在另一种具体的实施方式中，在暴露于1至100ng/mL VEGF4 至21天后，所述细胞不表达⑶34,如通过免疫定位所检测的。
[0103] 在细胞选择中，不必测试整个细胞群体对羊膜来源的贴壁细胞特异的特征。而是 可以测试细胞群体的一个或多个细胞等份(例如，约0. 5%-2%)的这些特征，并且结果可以归 于所述群体中其余的细胞。
[0104] 通过在存在VEGF (例如，约50ng/mL)的情况下在基质(例如，MATRIGEL)上将所述 细胞的样品(例如，约IO4至约10 5个细胞)培养4至14天(例如7天)，并目视检查所述细胞 的芽和/或细胞网络的出现，可以确认所选细胞是本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞。
[0105] 可以使用细胞选择领域中已知的任何方法通过上述标志物选择羊膜来源的贴壁 细胞。例如，可以在(例如）免疫定位，例如，流式细胞术或FACS中，使用抗一种或多种细胞 表面标志物的抗体选择所述贴壁细胞。可以使用与磁珠结合的抗体完成选择。对某些标志 物特异的抗体在本领域中是已知的，并且是可商购的，例如，抗⑶9 (Abeam);⑶54 (Abeam); CD105 (Abeam ;BioDesign International, Saco, ME 等）；CD200 (Abeam);细胞角蛋白 (SigmaAldrich)的抗体。抗其他标志物的抗体也是可商购的，例如，购自（例如）StemCell Technologies 或 BioDesign International 的 CD34、CD38 和 CD45。适合于 RT-PCR 的 0CT-4序列的引物可以从(例如）Millipore或Invitrogen商购获得，或者可以容易地来源 于GenBank登录号No. DQ486513的人序列。
[0106] 下文提供了获得胎盘和羊膜组织以及处理这些组织以获得羊膜来源的贴壁细胞 的详细方法。
[0107] 5. 4. 1细朐收集纟目合物
[0108] -般地，可以使用生理学可用的溶液(例如，细胞收集组合物）从来自哺乳动物胎 盘(例如，人胎盘）的羊膜获得细胞。优选地，所述细胞收集组合物防止或抑制细胞凋亡，防 止或抑制细胞死亡、溶胞、分解等。在标题为"Improved Medium for Collection Placental Stem Cells and Preserving Organs (用于收集胎盘干细胞和保存器官的改善培养基)"的 相关美国专利申请公开No. 2007/0190042中详细描述了细胞收集组合物，该专利的公开内 容以其全部内容作为参考并入本文。
[0109] 细胞收集组合物可以包括适合于羊膜来源的贴壁细胞的收集和/或培养的任何 生理学可用的溶液，例如，盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水、克氏液、改良的克氏液、伊格尔 氏溶液、0. 9%NaCl等)、培养基(例如，DMEM、HDMEM等）等，其添加或未添加缓冲组份，例如， 4-(2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES)。
[0110] 细胞收集组合物可以包含趋于保存细胞(例如，羊膜来源的贴壁细胞）的一种或多 种组份，即在从收集到培养期间防止细胞死亡或延缓细胞死亡、减少细胞群体中死亡细胞 的数目等。这些组份可以是(例如）细胞凋亡抑制剂(例如，半胱氨酸天冬氨酸酶抑制剂或 JNK抑制剂）；血管扩张剂(例如，硫酸镁、抗高血压药、心房钠尿肽（ANP)、促肾上腺皮质激 素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼屈嗪、三磷腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸 二酯酶抑制剂等）；坏死抑制剂(例如，2-(1H-吲哚-3-基）-3-戊基氨基-马来酰亚胺、批 咯烷二硫代氨基甲酸盐或氯硝西泮);TNF-a抑制剂；和/或携氧全氟化碳(例如，全氟辛基 溴化物、全氟癸基溴化物等)。
[0111] 细胞收集组合物可以包含一种或多种组织降解酶，例如，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白 酶、中性蛋白酶、核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶等。这些酶包括但不限于胶原酶(例如，I、 II、III或IV型胶原酶、获自溶组织梭状芽孢杆菌（Clostridium histolyticum)的胶原酶 等);分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性酶、胰蛋白酶、LIBERASE?、玻璃酸酶等。以下更详细地讨论 了包含组织消化酶的细胞收集组合物的使用。
[0112] 细胞收集组合物可以包含杀菌或细菌抑制有效量的抗生素。在某些非限制性实施 方式中，所述抗生素是大环内酯(例如，妥布霉素)、头孢菌素(例如，头孢氨苄、环己烯胺头 孢菌素、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉霉素、红霉素、青霉 素(例如、青霉素 V)或喹诺酮(例如，氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。在 一种特定的实施方式中，所述抗生素对革兰氏（+ )和/或革兰氏（_)细菌是有活性的，例如， 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)等。
[0113] 细胞收集组合物还可以包含下列化合物中的一种或多种：腺苷(约ImM至约 50mM);D-葡萄糖（约20mM至约IOOmM);镁离子（约ImM至约50mM);分子量大于20, 000道尔 顿的大分子，在一种实施方式中，其以足以维持内皮完整性和细胞活力的量存在(例如，合 成或天然存在的胶体，多糖(如葡聚糖)或聚乙二醇，其以约25g/l至约100g/l或者约40g/ 1至约60g/l存在）；抗氧化剂(例如，丁基羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素 C或维生素 E，其以约25 μ M至约100 μ M存在）；还原剂(例如，以约0. ImM至约5mM存在的 N-乙酰半胱氨酸）；防止钙进入细胞的试剂(例如，以约2 μ M至约25 μ M存在的维拉帕米）； 硝酸甘油(例如，约〇. 〇5g/L至约0. 2g/L);抗凝血剂，在一种实施方式中，其以足以帮助防 止残余血液凝结的量存在(例如，以约1，〇〇〇单位/升至约100, 〇〇〇单位/升的浓度存在的 肝素或水蛭素）；或含有阿米洛利的化合物(例如，阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、六亚甲 基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利，其以约1. 〇 μ M至约5 μ M存在)。
[0114] 还可以在(例如）如下所述的消化期间或消化后将本文所述的羊膜来源的贴壁细 胞收集到简单的生理学可用的缓冲液中，例如，磷酸盐缓冲盐水、〇. 9%NaCl溶液、细胞培养 基等。
[0115] 5. 4. 2胎盘的收集和处理
[0116] 通常，在分娩后或在(例如）剖腹产后胎盘去除后不久回收人胎盘。在一种优选的 实施方式中，在知情同意后并且在获得患者的完整病历并且该病历与胎盘有关后从患者回 收胎盘。优选地，在产后继续记录病历。该病历可用于配合胎盘或由此收获的细胞的后续 使用。例如，根据病历，人胎盘细胞(例如，羊膜来源的贴壁细胞）可用于与胎盘有关的婴儿 或近亲属，或婴儿的父母、兄弟姐妹或其他亲属的个体化医学过程。
[0117] 在回收羊膜来源的贴壁细胞前，除去脐带血和胎盘血。在某些实施方式中，产后 回收胎盘中的脐带血。可以对胎盘进行常规脐带血回收过程。通常，借助于重力使用针或 插管对胎盘抽血（参见，例如，Anderson,美国专利No. 5, 372, 581 ;Hessel等人，美国专利 No. 5, 415, 665)。通常将针或插管置于脐静脉中，并且可以轻轻地按摩胎盘以帮助从胎盘 中排出脐带血。可以商业化地进行这种脐带血回收，例如，LifeBank USA、Cedar Knolls、 N.J.，ViaCord、Cord Blood Registry和CryoCell。优选地，将胎盘重力放血而不进行其他 操作，从而使脐带血回收期间的组织破环程度最小。
[0118] 通常，将胎盘从分娩或产房运送到另一个位置(例如，实验室）以通过(例如）灌注 或组织解离用于回收脐带血和收集细胞。优选地，将胎盘在无菌、隔热的输送装置(将胎盘 温度维持在20-28°C之间）中运送，例如，通过将近端脐带夹紧的胎盘置于无菌自封塑料袋 中，然后置于保温容器中。在另一种实施方式中，胎盘在基本如美国专利No. 7, 147, 626中 所述的脐带血收集试剂盒中输送。优选地，在分娩后的4至24小时将胎盘运送到实验室。 在某些实施方式中，在脐带血回收之前将近端脐带夹紧，优选地，在胎盘中插入的4-5cm(厘 米）内。在其他实施方式中，在脐带血回收后但在胎盘的其他处理前将近端脐带夹紧。
[0119] 在细胞收集前，可以将胎盘储存在无菌条件下和(例如）4°C至25°C (摄氏度）的温 度下(例如，在室温下)。在灌注胎盘以除去任何残余脐带血之前，可以将胎盘保存(例如）0 至24小时，多至48小时或长于48小时的一段时间。在一种实施方式中，在娩出后约0小 时至约2小时收获胎盘。胎盘可以在4°C至25°C (摄氏度）的温度下保存在抗凝血剂溶液 中。适合的抗凝剂溶液在本领域中是熟知的。例如，可以使用柠檬酸钠、肝素或华法令钠溶 液。在优选的实施方式中，所述抗凝剂溶液包括肝素溶液(例如，1:1000溶液中的1% (w/ w))。优选地，在收集细胞之前将放血的胎盘保存不超过36小时。
[0120] 5. 4. 3羊腊纟目织的物理破环和酶促消化
[0121] 在一种实施方式中，例如，通过钝器切割(例如使用手指)，将羊膜与其余的胎盘分 离。在酶促消化和贴壁细胞回收前，可以将羊膜切割成(例如）部分或组织碎片。羊膜来源 的贴壁细胞可以获自整个羊膜，或获自羊膜的小碎片，例如，面积为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或约 1000 平方毫 米的羊膜碎片。
[0122] -般地，可以在娩出后约前三天内的任何时间从胎盘羊膜或其部分收集羊膜来源 的贴壁细胞，但优选地在娩出后约〇小时至48小时之间，或者娩出后约8小时至约18小时 之间收集。
[0123] 在一种实施方式中，利用一种或多种组织消化酶通过酶促消化从羊膜组织提取羊 膜来源的贴壁细胞。可以(例如)用溶解或混合于如上所述的细胞收集组合物中的一种或多 种酶消化羊膜或其部分。
[0124] 在某些实施方式中，细胞收集组合物包含一种或多种组织破坏酶。酶促消化优选 地使用（例如）以顺序次序使用的酶的组合，例如，基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合，例 如，分散酶和胶原酶的组合。当使用不止一种蛋白酶时，可以同时使用该蛋白酶以消化羊膜 组织，或者可以顺序使用。在一种实施方式中，例如，用胰蛋白酶消化羊膜组织三次，然后用 胶原酶消化一次。
[0125] 在一种实施方式中，用基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和粘多糖酶中的一种或多 种酶促消化羊膜组织。在一种具体的实施方式中，用胶原酶、分散酶和玻璃酸酶的组 合消化羊膜组织。在另一种具体的实施方式中，用LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis, Ind.)和玻璃酸酶的组合消化羊膜组织。能够用于破坏羊膜组织的其 他酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性酶。 可以通过血清中的α 2微球蛋白抑制丝氨酸蛋白酶，并且因此，在某些实施方式中，用于消 化的媒介可以是不含血清的。在某些其他实施方式中，在羊膜组织的消化中使用了 EDTA和 脱氧核糖核酸酶以(例如）提高细胞回收效率。在某些其他实施方式中，稀释消化物以避免 将细胞限制（trap )在粘稠的消化液内。
[0126] 组织消化酶的典型浓度包括，例如，对于胶原酶I和胶原酶IV为50_200U/mL，对于 分散酶为l-l〇U/mL，以及对于弹性酶为10-100U/mL。蛋白酶可以组合使用，即在相同消化 反应中使用两种或更多种蛋白酶，或者可以顺序使用以分离羊膜来源的贴壁细胞。例如，在 一种实施方式中，首先在37°C，以约0. 25%的浓度，用适当量的胰蛋白酶将羊膜组织或其部 分消化(例如）15分钟，然后以约lmg/ml至约2mg/ml的胶原酶消化(例如）45分钟。
[0127] 在一种实施方式中，能够如下所示获得羊膜来源的贴壁细胞。将羊膜切成约 0. 1" X0. 1"至约5" X 5"（例如，2" X 2"）大小的碎片。如下所示，通过三次胰酶消化从羊 膜的胎儿侧除去上皮细胞单层。将羊膜碎片置于具有温热(例如，约20°C至约37°C )胰蛋白 酶-EDTA溶液（0. 25%)的容器中。胰蛋白酶的体积可以在约5mL每克羊膜至约50mL每克 羊膜的范围内。将容器搅拌约5分钟至约30分钟(例如，15分钟)，同时保持温度恒定。然 后，通过任何适合的方法(如用手除去羊膜碎片或通过过滤）将羊膜部分与胰蛋白酶溶液分 离。胰酶消化步骤可以再重复至少一次。
[0128] -旦完成了最终的胰酶消化，将羊膜碎片放回到装有温热的胰蛋白酶中和溶液 (如磷酸盐缓冲盐水（PBS) /10%FBS、PBS/5%FBS或者PBS/3%FBS)的容器中。将容器搅拌约 5秒至约30分钟，例如，5分钟。然后，如上所述将羊膜碎片与胰蛋白酶中和溶液分离，并且 将羊膜部分置于装有温热PBS (pH7. 2)的容器中。将容器搅拌约5秒至约30分钟，然后将 羊膜部分与如上所述的PBS分离。
[0129] 然后，将羊膜碎片置于装有温热(例如，约20°C至约37°C)消化溶液的容器中。消 化溶液的体积可以在约5mL每克羊膜至约50mL每克羊膜的范围内。消化溶液包含处于适 合的培养基(如DMEM)中的消化酶。典型的消化溶液包括I型胶原酶(约50U/mL至约500U/ mL);I型胶原酶(约50U/mL至约500U/mL)加分散酶(约5U/mL至约lOOU/mL);和I型胶原酶 (约50U/mL至约500U/mL)、分散酶(约2U/mL至约50U/mL)和玻璃酸酶(约3U/mL至约10U/ mL)。将容器在37°C搅拌直至羊膜消化基本完成(约10分钟至约90分钟)。然后，以约ImL 每克羊膜组织至约50mL每克羊膜组织的比值将温热的PBS/5%FBS加入到容器中。将容器 搅拌约2分钟至约5分钟。然后，利用40 μ m至100 μ m过滤器过滤细胞悬液以除去任何未 消化的组织。将细胞悬浮在温热的PBS (约ImL至约500mL)中，然后在20°C以200Xg至 约400Xg离心约5分钟至约30分钟，例如，以300Xg离心约15分钟。离心后，除去上清 液并将细胞重悬浮于适合的培养基中。可以过滤细胞悬液（40 μ m至70 μ m过滤器)以除去 任何残余的未消化组织，从而得到单细胞悬液。
[0130] 在该实施方式中，如在本文其他地方所述的收集并培养悬浮的细胞以产生分离的 羊膜来源的贴壁细胞和这些细胞的群体。在该实施方式中，可以弃去剩余的未消化的羊膜。 例如，可以通过(例如）离心收集从羊膜组织释放的细胞并在标准细胞培养基中培养。
[0131] 在本文任何消化规程中，可以通过(例如）包含约50μπι至约150μπι，例如，约 75 μ m至约125 μ m的孔的过滤器过滤通过消化获得的细胞悬液。在一种更具体的实施方式 中，可以通过两种或更多种过滤器，例如，125 μ m过滤器和75 μ m过滤器过滤细胞悬液。
[0132] 结合本文所述的任何方法，如以上5. 3节中所述，通过选择表达一种或多种AMDAC 特征的细胞，可以从消化期间释放的细胞中分离AMDAC。
[0133] 例如，还可以使用包含用胰蛋白酶消化并随后用胶原酶消化的具体的两步分离法 分离AMDAC。因此，在另一个方面，本文提供了分离羊膜来源的贴壁细胞的方法，包括用胰蛋 白酶消化羊膜或其部分从而使上皮细胞从所述羊膜上释放；从所述上皮细胞上除去羊膜或 其部分；用胶原酶进一步水解羊膜或其部分从而使羊膜来源的贴壁细胞从所述羊膜或其部 分上释放；以及将所述羊膜来源的贴壁细胞与所述羊膜分离。在一种具体的实施方式中，将 羊膜或其部分的消化重复至少一次。在另一种具体的实施方式中，将用胶原酶的羊膜或其 部分的消化重复至少一次。在另一种具体的实施方式中，胰蛋白酶为约0. 1%-1. 〇%(最终浓 度)。在一种更具体的实施方式中，胰蛋白酶为约0.25% (最终浓度)。在另一种具体的实施 方式中，胶原酶为约50U/mL至约lOOOU/mL (最终浓度)。在一种更具体的实施方式中，胶原 酶为约125U/mL (最终浓度)。在另一种具体的实施方式中，分离方法还包括在细胞培养中 培养所述羊膜来源的贴壁细胞和在所述培养中将所述羊膜来源的贴壁细胞与非贴壁细胞 分离以产生富集的羊膜来源的贴壁细胞群体。在一种更具体的实施方式中，所述富集的羊 膜来源的贴壁细胞群体中至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98% 或 99% 的 细胞是所述羊膜来源的贴壁细胞。
[0134] 在上述方法的一种更具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞对0CT-4是阴 性的，如通过RT-PCR确定的，并且是HLA-G+、⑶90+、⑶105+和⑶117 _中的一种或多种，如通 过流式细胞术确定的。
[0135] 5. 4. 4羊腊来源的贴壁细朐的分离、分诜和鉴别
[0136] 如上所述，细胞沉淀物可以重悬浮于新鲜的细胞收集组合物或适合于细胞维持的 培养基，例如，达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM);伊思考夫改良达尔伯克培养基（IMDM)， 例如，含有2U/mL肝素和2mM EDTA的MDM无血清培养基（GibcoBRL，NY);缓冲液(例如，PBS、 HBSS)与FBS (例如，2%v/v)的混合物；等等。
[0137] 可以将已在(例如）具有或不具有额外的胞外基质涂层（如纤连蛋白）的组织培养 塑料的(例如）表面上培养的羊膜来源的贴壁细胞传代或通过差异贴壁分离。例如，可以在 组织培养塑料制品上在培养基中将得自如以上5. 4. 3节中所述进行的羊膜组织的胶原酶 消化的细胞悬液培养(例如)3_7天。在培养期间，悬液中多个细胞贴壁至培养表面，并且在 继续培养后，导致产生了羊膜来源的贴壁细胞。在培养基更换期间，除去不会导致产生羊膜 来源的贴壁细胞的非贴壁细胞。
[0138] 可以(例如）通过使用标准细胞检测技术(如免疫定位，例如，流式细胞术、细胞分 选、免疫细胞化学(例如，用组织特异或细胞标志物特异的抗体染色)、荧光活化的细胞分选 (FACS )、磁性活化的细胞分选（MACS ))测量形态和细胞表面标志物的变化，通过使用光学或 共聚焦显微镜检查法检查细胞形态和/或通过使用本领域中公知的技术(如PCR和基因表 达谱）测量基因表达的变化来监测从羊膜收集的细胞的个数和类型。这些技术也可以用于 鉴别对一种或多种特定标志物呈阳性的细胞。例如，使用抗CD34的一种或多种抗体，使用 上述技术可以确定细胞是否包含可检测数量的CD34 ;如果是，则该细胞是CD34+。
[0139] 可以使用荧光活化的细胞分选仪（FACS)来分选羊膜来源的细胞，例如，已通过 Ficoll分离、差异贴壁或两者组合分离的细胞。荧光活化的细胞分选（FACS)是根据颗 粒的荧光性质分离包括细胞在内的颗粒的公知方法(参见，例如，Kamarch, 1987, Methods Enzymol，151:150-165)。各个颗粒中荧光部分的激光激发导致产生少量电荷，其使得正负 颗粒与混合物电磁分离。在一种实施方式中，用不同的荧光标记物标记细胞表面标志物特 异的抗体或配体。通过细胞分选仪处理细胞，从而允许根据它们与所使用的抗体结合的能 力分离细胞。可以将FACS分选的颗粒直接沉积到96孔板或384孔板的各个孔中以有利于 分离和克隆。
[0140] 在一个分选方案中，可以根据标志物CD49f、VEGFR2/KDR和/或Flt-1/VEGFRl的 表达分选来自胎盘的细胞(例如，羊膜来源的贴壁细胞)。优选地，通过(例如)在细胞样品中 通过RT-PCR确定0CT-4的表达将细胞鉴别为0CT-4_，其中如果所述样品中的细胞在30次 循环后不能显示出mRNA的可检测产生，则所述细胞是0CT-4'例如，作为VEGFR2/KDR+和 VEGFRl/Flt-Γ的来自羊膜的细胞可以与作为 VEGFR2/KDR -和 VEGFRl/Flt-1 +、CD9+、CD54+、 ⑶105+、⑶200+和/或VE-钙粘素^中的一种或多种的细胞分选。在一种具体的实施方式 中，将作为⑶49f+、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+和 / 或 VE-钙粘素-中的一 种或多种的羊膜来源的组织培养塑料贴壁细胞或者作为VEGFR2/KDR+、⑶9 +、⑶54+、⑶105+、 CD200+和VE-钙粘素-的细胞与不表达一种或多种这些标志物的细胞分选开并选择。在 另一种具体的实施方式中，将另外是⑶31+、⑶34+、⑶45+、⑶133_和/或Tie-2 +中的一种或 多种或者全部的CD49f+、VEGFR2/KDR+、VEGFRl/Flt-Γ细胞与未显示出一种或多种或者任 何这些特征的细胞分选。在另一种具体的实施方式中，将另外是⑶9 +、⑶10+、⑶44+、⑶54+、 CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31、CD34、CD45、CD133、CD143、CD146-和 / 或 CXCR4 -中的 一种或多种或者全部的VEGFR2/KDR+、VEGFRl/Flt-Γ细胞与未显示出一种或多种或者任何 这些特征的细胞分选。
[0141] 可以对由消化所产生的细胞悬液或对通过(例如）离心或使用流式细胞术的分离 从消化物中收集的分离的细胞进行羊膜来源的贴壁细胞的选择。可以单独或者(例如)与根 据其在培养中的贴壁特性选择细胞的程序结合来完成通过所表达标志物的选择。例如，可 以在根据标志物表达的分选之前或之后完成贴壁选择。
[0142] 相对于胎盘细胞的抗体介导的检测和分选，可以与适合于细胞检测和分选的任何 荧光团或其他标记物结合(例如，荧光激活细胞分选）使用对特定标志物特异的任何抗体。 对标志物特异的抗体/荧光团组合包括，但不限于，异硫氰酸荧光素 （FITC)结合的抗⑶105 的单克隆抗体(得自R&D Systems Inc. ,Minneapolis, Minnesota);藻红蛋白（PE)结合的抗 CD200 单克隆抗体（BD Biosciences Pharmingen);VEGFR2/KDR-生物素 （CD309, Abeam)等。 可以用有利于抗体检测的任何标准抗体标记物标记抗本文所公开的任何标志物的抗体，所 述标记物包括，例如，辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶抗生蛋白 链菌素/生物素、抗生物素蛋白/生物素、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素 （FITC)、罗丹明、 二氯三嗪胺荧光素、5-二甲氨基萘磺酰氯或藻红蛋白（ΡΕ)、鲁米诺、荧光素酶、萤光素和水 母发光蛋白，并且适合的放射性物质的实例包括 125I、131I、35S或3Η。
[0143] 可以用抗单个标志物的抗体标记羊膜来源的贴壁细胞并且基于所述单个标志物 检测和分选，或者可以用抗多种不同标志物的多个抗体同时标记并基于所述多种标志物分 选。
[0144] 在另一种实施方式中，可以使用磁珠将细胞(例如，本文所述的羊膜来源的贴壁细 胞）与其他羊膜细胞分离。可以使用磁激活细胞分选(MACS)技术分选细胞，该技术是基于 其结合磁珠（0.5-100 μ m直径）的能力分离颗粒的方法。可以在磁性微球上进行多种有用 的修饰，其包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后，将珠与细胞 混合以使其结合。然后，将细胞穿过磁场以分离出具有特异性细胞表面标志物的细胞。在 一种实施方式中，然后可以将这些细胞分离并与和抗其他细胞表面标志物的抗体结合的磁 珠再次混合。将这些细胞再次通过磁场，从而分离出与两种抗体结合的细胞。然后，可以将 这些细胞稀释至单独的盘中，如用于无性系分离的微量滴定盘。
[0145] 可以使用本领域中已知的标准技术评价羊膜来源的贴壁细胞的存活力、增殖潜能 和寿命，所述标准技术如台盼蓝排阻测定、荧光素二乙酸酯吸收测定、碘化丙啶吸收测定 (以评价存活力）；和胸苷吸收测定或MTT细胞增殖测定（以评价增殖)。可以通过本领域中 熟知的方法确定寿命，如通过确定扩大培养中群体倍增的最大次数。
[0146] 还可以使用本领域中已知的其他技术将羊膜来源的贴壁细胞与其他胎盘细胞分 离，所述技术例如所需细胞的选择性生长（阳性选择)、不希望的细胞的选择性破坏（阴性选 择）；基于混合群体中差异细胞可凝集性的分离，如(例如）使用大豆凝集素；冻融程序；过 滤；常规和区带离心；离心淘选(逆流离心作用）；单位重力分离；逆流分配；电泳等。
[0147] 5. 5.羊膜来源的贴壁细胞的培养
[0148] 就任何哺乳动物细胞而言，本文所述的羊膜来源的贴壁细胞的生长部分取决于选 择用于生长的特定培养基。在适宜条件下，羊膜来源的贴壁细胞的数目通常在约24小时内 加倍。在培养期间，在培养中本文所述的羊膜来源的贴壁细胞贴壁至基质上，例如，组织培 养容器(例如，塑料组织培养皿、纤连蛋白涂覆的塑料等)的表面上，并且形成单层。通常，在 羊膜消化后的2-7天内构建培养细胞。它们以每天约0. 4至1. 2次群体倍增增殖并且可以 经历至少30至50次群体倍增。细胞在亚汇合和扩增期间显示出间充质细胞/成纤维细胞 样表型，在汇合时显示出立方体/卵石样外形，并且在培养时增殖是强烈接触抑制的。在培 养中扩增期间，羊膜来源的生血管细胞群体可以形成胚状体样体。
[0149] 5. 5. 1 培养某
[0150] 分离的羊膜来源的贴壁细胞或这些细胞的群体可用于起始或接种细胞培养物。一 般将细胞转移至未用胞外基质或生物分子涂覆或用其涂覆的无菌组织培养容器中，所述 胞外基质或生物分子如层粘连蛋白、胶原(例如，天然或变性的胶原)、明胶、纤连蛋白、鸟氨 酸、玻连蛋白和胞外膜蛋白（例如，MATRIGEL?(BD Discovery Labware, Bedford, Mass·))。
[0151] 例如，可以在适合于干细胞培养的培养基中构建AMDAC。构建培养基可以(例如） 包括 EGM-2 培养基（Lonza)、DMEM+10% FBS，或包含 60% DMEM-LG (Gibco)、40% MCDB-201 (Sigma)、2% 胎牛血清（FCS) (Hyclone Laboratories)、lX 膜岛素-转铁蛋白-硒（ITS)、 IX亚油酸-牛血清白蛋白（LA-BSA)、KT9M地塞米松（Sigma)、KT4M抗坏血酸2-磷酸 酯（Sigma)、10ng/ml表皮生长因子（EGF) (R&D Systems)、10ng/ml血小板源性生长因子 (H)GF-BB) (R&D Systems)和100U青霉素/1000U链霉素的培养基(在本文中称为"标准培 养基")。
[0152] 可以在本领域中认为是对细胞(例如，贴壁的胎盘干细胞）培养可用的任 何培养基中和任何条件下培养羊膜来源的贴壁细胞。优选地，所述培养基包含血 清。在多种实施方式中，用于AMDAC的培养或继代培养的培养基包括STEMPR0? (Invitrogen)、MSCM-sf (ScienCell, Carlsbad, CA)、MESENCULT ? -ACF 培养基（StemCell Technologies, Vancouver, Canada)、标准培养基、缺少EGF的标准培养基、缺少F1DGF的标准 培养基、DMEM+10% FBS、EGM-2 (Lonza)、EGM-2MV (Lonza)、2%、10% 和 20% ES 培养基、ES-SSR 培养基或a-MEM-20% FBS。羊膜来源的贴壁细胞的培养可用的培养基包括，例如，DMEM、 IMDM、DMEM (高或低葡萄糖)、伊格尔基础培养基、汉姆氏FlO培养基（F10)、汉姆氏F-12 培养基（F12)、伊思考夫改良达尔伯克氏培养基、间质干细胞生长培养基(MSCGM Lonza)、 ADVANCESTEM?培养基（Hyclone)、KNOCKOUT tmDMEM (Invitrogen)、莱博维茨 L-15 培养基 (Liebovitz，s L-15 medium)、MCDB、DMEM/F12、RPMI 1640、高级 DMEM (Gibco)、DMEM/ MCDB201 (Sigma)和CELL-GRO FREE等。在多种实施方式中，例如，含有ITS (胰岛素-转 铁蛋白-硒)、LA+BSA (亚油酸-牛血清白蛋白）、葡萄糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-I和 青霉素/链霉素的DMEM-LG (达尔伯克氏改良基础培养基，低葡萄糖）/MCDB201 (鸡胚成纤 维细胞基础培养基）；包含约2%至约20%，例如，约10%胎牛血清（FBS ;例如，确定的胎牛血 清，Hyclone, Logan Utah)的DMEM-HG (高葡萄糖）;包含约2%至约20%，例如，约15%FBS的 DMEM-HG ;包含约2%至约20%，例如，约10%FBS、含约2至约20%，例如，约10%马血清和氢化 可的松的頂DM (伊思考夫改良达尔伯克氏培养基）；包含约2%至约20%，例如，约10%FBS、 EGF和肝素的M199 ;包含约2%至约20%，例如，约10%FBS、GlutaMAX?和庆大霉素的a -MEM (最小必需培养基）；包含10%FBS、GlutaMAX?和庆大霉素的DMEM ;包括含约2%至约20%，例 如，约15% (v/v)胎牛血清(例如，确定的胎牛血清，Hyclone, Logan Utah)、抗生素/抗真菌 齐Ll (例如，约100单位/晕升的青霉素、100单位/晕升的链霉素和/或〇. 25晕克/晕升的 两性霉素 B (Invitrogen, Carlsbad, Calif·))和 0.001% (ν/ν) β-疏基乙醇（Sigma, St. Louis Mo.)的DMEM-LG ;补充有2%至20%FBS、非必需氨基酸（Invitrogen)、β -巯基乙醇 的Knockouttm-DMEM基础培养基、补充有knockout?血清置换物的knockout ?基础培养基、 包含2%至20%FBS的α -MEM、补充有EGF、VEGF、bFGF、R3-IGF-l、氢化可的松、肝素、抗坏血 酸、FBS、庆大霉素的EBM2?基础培养基等。
[0153] 培养基可以单独或组合地补充一种或多种组分，其包括，例如，血清(例如，FCS或 FBS，例如，约2-20%(v/v);马血清（ES);人血清（HS)); β -巯基乙醇（BME)，优选地约0. 001% (v/v);-种或多种生长因子，例如，血小板源性生长因子（PDGF)、表皮生长因子（EGF)、碱性 成纤维细胞生长因子（bFGF)、胰岛素样生长因子-I (IGF-1)、白血病抑制因子（LIF)、血管 内皮生长因子（VEGF)和促红细胞生成素（EP0);氨基酸，包括L-缬氨酸；和一种或多种抗生 素和/或抗真菌剂以控制微生物污染，如，例如，青霉素、链霉素硫酸盐、两性霉素 B、庆大霉 素和制霉菌素。
[0154] 可以在标准的组织培养条件下(例如，在组织培养盘或多孔板中）培养羊膜来源的 贴壁细胞(AMDAC)。还可以使用悬滴法培养细胞。在该方法中，细胞以约IX IO4个细胞/mL 悬浮在约5mL培养基中，并且将一滴或多滴培养基置于组织培养容器(例如，IOOmL培养皿） 的盖内。所述滴可以是来自（例如)多孔道移液器的(例如)单滴或多滴。小心地将所述盖翻 转并置于培养皿底部的上方，所述培养皿底部含有大量液体(例如，足以维持培养皿气氛中 湿度的无菌PBS)，并且培养细胞。还可以在标准或大体积或高通量培养系统中培养AMDAC， 如T-三角瓶、CorningHYPERFLASK?细胞工厂（Nunc)、l-、2-、4-、10或40-层TrayCell堆 叠等。还可以在生物反应器，例如，高通量生物反应器、静态生物反应器、推流式生物反应器 等中培养AMDAC。生物反应器的实例包括Celligen培养系统（New Brunswick, Edison, NJ)、 WAVE Bioreactor? (General Electric)等。
[0155] 在一种实施方式中，在存在起维持细胞中未分化表型的作用的化合物的情况下 培养羊膜来源的贴壁细胞。在具体的实施方式中，该化合物是取代的3, 4-二氢吡啶酚
[4, 5-d]嘧啶。在更具体的实施方式中，该化合物是具有以下化学结构的化合物：
[0156]

【权利要求】
1. 一种治疗已暴露于福射的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的 分离的羊膜来源的贴壁细胞(AMDAC)，其中所述细胞贴壁至组织培养塑料，并且其中所述细 胞是0CT-4-(八聚物结合蛋白4)，可通过RT-PCR确定。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是电离福射。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是目福射、Y幅射或X射线。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是a福射。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是中子福射。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是0. OlmSv至0. ImSv (0. OOlrem至 0. Olrem)之间的单一剂量。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是ImSv至lOmSv (0. Irem至1.化em) (OOlGy至0. OlGy)之间的单一剂量。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是lOmSv至lOOmSv (Irem至lOrem) (0. OlGy至0. IGy)之间的单一剂量。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是lOOmSv至lOOOmSW lOrem至10化em) (0. IGy至1. OGy)之间的单一剂量。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是lOOOmSv至2000mSv (10化em至 200rem) (IGy至2Gy)之间的单一剂量。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是2000mSv至3000mSv (20化em至 SOOrem) (2Gy至3Gy)之间的单一剂量。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是3000mSv至4000mSv (30化em至 400rem) (3Gy至4Gy)之间的单一剂量。
13. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是5000mSv至lOOOOmSv (50化em至 lOOOrem) (5Gy至lOGy)之间的单一剂量。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是lOOOOmSv至lOOOOOmSv (lOOOrem 至lOOOOrem) (lOGy至lOOGy)之间的慢性暴露。
15. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是0. OlmSv至0. ImSv (0. OOlrem至 0. Olrem)之间的慢性暴露。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是ImSv至lOmSv (0. Irem至1. Orem) (OOlGy至0. OlGy)之间的慢性暴露。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是lOmSv至lOOmSv (Irem至lOrem) (0. OlGy至0. IGy)之间的慢性暴露。
18. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是lOOmSv至lOOOmSv (1化em至 lOOrem) (0. IGy至1. OGy)之间的慢性暴露。
19. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是lOOOmSv至2000mSv (10化em至 200rem) (IGy至2Gy)之间的慢性暴露。
20. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是2000mSv至3000mSv (20化em至 SOOrem) (2Gy至3Gy)之间的慢性暴露。
21. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是3000mSv至4000mSv (30化em至 400rem) (3Gy至4Gy)之间的慢性暴露。
22. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是5000mSv至lOOOOmSv (50化em至 lOOOrem) (5Gy至lOGy)之间的慢性暴露。
23. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述福射是lOOOOmSv至lOOOOOmSv (lOOOrem 至lOOOOrem) (lOGy至lOOGy)之间的慢性暴露。
24. 根据权利要求15-23中任一项所述的方法，其中，所述慢性暴露是在1-6天。
25. 根据权利要求15-23中任一项所述的方法，其中，所述慢性暴露是在7-13天。
26. 根据权利要求15-23中任一项所述的方法，其中，所述慢性暴露是在14-27天。
27. 根据权利要求15-23中任一项所述的方法，其中，所述慢性暴露是在28-56天。
28. 根据权利要求1所述的方法，其中，由于所述暴露于福射，所述个体已发展或有可 能发展急性福射综合征或急性福射综合征的症状。
29. 根据权利要求1所述的方法，其中，在所述施用时，所述个体尚未发展急性福射综 合征的一种或多种症状。
30. 根据权利要求28所述的方法，其中，所述一种或多种症状包括恶也、呕吐、腹泻、发 烧和/或头痛中的一种或多种。
31. 根据权利要求28所述的方法，其中，所述一种或多种症状包括紫薇、虚弱、疲劳、感 染、脱发、暴露组织的水泡或坏死、和/或出血。
32. 根据权利要求28所述的方法，其中，所述一种或多种症状包括神经功能缺损、认知 损害、共济失调、震颤和/或癒痛。
33. 根据权利要求28所述的方法，其中，所述一种或多种症状包括白细胞减少。
34. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述个体暴露于来自未接触所述个体身体的源 的福射。
35. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述个体暴露于由于放射源接触所述个体的身 体而造成的福射。
36. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述个体由于所述个体吸入或摄入放射源而暴 露于福射。
37. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述施用在所述暴露的96小时内进行。
38. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述施用在所述暴露的72小时内进行。
39. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述施用在所述暴露的48小时内进行。
40. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述施用在所述暴露的24小时内进行。
41. 根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述细胞是HLA-G -，可通过RT-PCR确 定。
42. 根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述细胞另外是CD49f+，可通过流式细 胞术确定。
43. 根据权利要求3所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是0CT-4 -、HLA-G -和CD49f+。
44. 根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是CD90\CD105+或CD117 -， 可通过流式细胞术确定。
45. 根据权利要求44所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是CD90 \CD105+和CD117 -， 可通过流式细胞术可确定。
46. 根据权利要求45所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是0CT-4 -和HLA-G -，通过 RT-PCR确定，和CD49r、CD90\CD105+和CD117-，可通过流式细胞术确定。
47. 根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是VEGFRl/Flt-1 +(血管内皮 生长因子受体1)和VEGFR2/邸r (血管内皮生长因子受体2)，可通过免疫定位确定。
48. 根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是CD9\CD10\CD44\CD54\ CD98+、Tie-2+ (血管生成素受体)、TEM-7+ (肿瘤血管内皮标志物7)、CD31-、CD34-、CD45-、 CD133-、CD143-(血管紧张素I转化酶，ACEXCD146-(黑素瘤细胞粘附分子)或CXCR4-(趋 化因子（C-X-C基序）受体4)中的一种或多种，可通过免疫定位确定。
49. 根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是CD9\CD10\CD44\CD54\ CD98+、Tie-2+ (血管生成素受体)、TEM-7+ (肿瘤血管内皮标志物7)、CD31-、CD34-、CD45-、 〔0133-、〔0143-、〔0146-和〔《0?4-，可通过免疫定位确定。
50. 根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述细胞是VE-巧粘素-，可通过免疫定 位确定。
51. 根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC另外对CD105 +和CD200 +是 阳性的，可通过免疫定位确定。
52. 根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，在暴露于50ng/mLVEGF7天后，所述 AMDAC不表达CD34,可通过免疫定位确定。
53. 包含权利要求1所述的AMDAC的分离的细胞群体，其中，所述群体中至少50%的所 述细胞是权利要求1所述的细胞。
54. 根据权利要求53所述的分离的细胞群体，其中，所述群体中至少80%的所述细胞是 权利要求1所述的AMDAC。
55. 根据权利要求54所述的分离的细胞群体，其中，所述群体中至少90%的所述细胞是 权利要求1所述的AMDAC。
56. 包含根据权利要求1或41-52中任一项所述的AMDAC的组合物。
57. 包含权利要求53所述的AMDAC的所述分离的细胞群体，其中，所述群体还包含分离 的第二类型细胞，并且其中所述群体不是羊膜、羊膜部分或羊膜匀浆。
58. 根据权利要求57所述的分离的细胞群体，其中，所述第二类型细胞是胚胎干细胞、 血细胞、分离自周围血的干细胞、分离自胎盘血的干细胞、分离自胎盘灌流液的干细胞、分 离自胎盘组织的干细胞、分离自厮带血的干细胞、厮带干细胞、骨髓源间质干细胞、骨髓源 间充质基质细胞、造血干细胞、成体干细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、内皮细胞、成 血管细胞、内皮祖细胞、外膜细胞、也肌细胞、肌细胞、也肌成肌细胞、成肌细胞、或操纵W类 似于胚胎干细胞的细胞。
59. 根据权利要求57或58所述的分离的细胞群体，其中，所述第二类型细胞占所述群 体中至少10%的细胞。
60. 根据权利要求57或58所述的分离的细胞群体，其中，所述第二类型细胞占所述群 体中至少25%的细胞。
61. 根据权利要求57或58所述的分离的细胞群体，其中，所述第二类型细胞是造血干 细胞或祖细胞。
62. 根据权利要求61所述的分离的群体，其中，所述造血干细胞或祖细胞是CD34 +细 胞。
63. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述AMDAC贴壁至组织培养塑料；其中所述细 胞是 0CT-4-，通过 RT-PCR 确定，并且是 CD49f\HLA-G-、CD90\CD105+和 CD117 -，通过免疫 定位确定；并且其中所述AMDAC ; (a) 表达 CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFRl/Flt-1 或 VEGFR2/ 邸R (CD309)中的一种或多种，可通过免疫定位确定； (b) 缺乏 CD31、CD：M、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G 或 VE-巧粘素的表达，可通过免疫定位确定，或缺乏S0X2的表达，可通过RT-PCR确定； Cc)表达 ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPm、ANGPIIS、ANGPIIA、 BAI1、CD44、CD200、CEACAMl、CHGA、COL15A1、COL18A1、C0L4A1、C0L4A2、C0L4A3、CSF3、CTGF、 CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGFl、邸Gl、EDIL3、ENPP2、EP皿2、FBLN5、巧、FGFl、FGF2、FIGF、 FLT4、FN1、FST、F0XC2、GRN、HGF、肥Y1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、 MMP2、MY0Z2、NRPl、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAMl、PF4、PGKl、PROXl、PTN、SEMA3F、 沈 RPINB5、沈 RPINCl、沈 RPINFl、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFBl、T皿 SI、T皿 S2、TIEl、TIE2/T邸、 TNF、?NI1、TNFSF15、VA甜 1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFRl/化T1 或 VEGFR2/邸R 的 mRNA ; (d)表达蛋白质CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、目2-微球蛋白、CD：M9、CD318、PDLl、 CD106、半乳凝素-UADAM17、血管紧张肤原前体、细丝蛋白A、a-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨 瞻细胞己醜化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋 白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C或肌球蛋白重链，非肌A型中的一种或多种； (e )向培养AMDAC的培养基中分泌VEGF、HGF、比-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、 ENA-78、GR0、比-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR 或半乳凝素-1 ; (f) W高于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA;miR-17-3p、 miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92 或 miR-296,； (g) W低于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA;miR-20a、 miR-20b、miR-221、miR-222、miR-l化或 miR-16,； 化）表达下述 miRNA ;miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、 miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-l化或 miR-16 ;或 (i)与在21%02条件下CD20化、IL-8或VEGF的表达相比，当在低于约5%0 2中培养时， 表达较高水平的CD20化、IL-8或VEGF。
64. 根据权利要求63所述的方法，其中，所述AMDAC是0CT-4 -，通过RT-PCR确定，并且 是CD49r、HLA-G-、CD90\CD105+和CD117-，可通过免疫定位确定；并且其中所述AMDAC; (a) 表达 CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFRl/Flt-1 和 / 或 VEGFR2/邸R (CD309)，可通过免疫定位确定； (b) 缺乏 CD31、CD：M、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G 和 /或VE-巧粘素的表达，可通过免疫定位确定，和/或缺乏S0X2的表达，可通过RT-PCR确 定； Cc)表达 ACTA2、ADAMTS1、AM0T、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPm、ANGPIIS、ANGPIIA、 BAI1、CD44、CD200、CEACAMl、CHGA、COL15A1、COL18A1、C0L4A1、C0L4A2、C0L4A3、CSF3、CTGF、 CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGFl、邸Gl、EDIL3、ENPP2、EP皿2、FBLN5、巧、FGFl、FGF2、FIGF、 FLT4、FN1、FST、F0XC2、GRN、HGF、肥Y1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、 MMP2、MY0Z2、NRPl、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAMl、PF4、PGKl、PROXl、PTN、SEMA3F、 沈 RPINB5、沈 RPINCl、沈 RPINFl、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFBl、T皿 SI、T皿 S2、TIEl、TIE2/T邸、 (d)表达蛋白质CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、目2-微球蛋白、CD：M9、CD318、PDLl、 CD106、半乳凝素-UADAM17、血管紧张肤原前体、细丝蛋白A、a-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨 瞻细胞己醜化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋 白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C和/或肌球蛋白重链，非肌A型中的一种或多种； (e )向培养AMDAC的培养基中分泌VEGF、HGF、比-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、 ENA-78、GR0、比-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR 和半乳凝素-1 中的一种或多种； (f) W高于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA;miR-17-3p、 miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92 和 / 或 miR-296,; (g) W低于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA;miR-20a、 miR-20b、miR-221、miR-222、miR-l化和 / 或 miR-16,； (h) 表达下述 miRNA ;miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、 miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-l化和 / 或miR-16 ;和 (i) 与在21%02条件下CD20化、IL-8和/或VEGF的表达相比，当在低于约5%0 2中培养 时，表达较高水平的CD20化、IL-8和/或VEGF。
【文档编号】A61K35/51GK104470529SQ201280040374
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2012年7月13日 优先权日:2011年7月15日
【发明者】亚历山大·弗兰茨基, 阿贾伊·帕尔, 罗伯特·J·哈黎里, 弗拉基米尔·扬科维奇 申请人:人类起源公司