专利名称：用于预防和治疗辐射损伤的rx31肽的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域。本发明涉及一种自由基清除肽及其在预防和治疗辐射损伤中的应用。
背景技术：
随着科学技术的发展，人们与各种辐射接触的机会越来越多。在日常生活中，手机、电脑、微波炉等家用电器，已经成为人们身边各种辐射的主要来源。自日本“3. 11”大地震以来，核污染和核设施泄漏等突发性事故也备受人们的关注。机体受到辐射损害，会导致患恶性肿瘤几率增加、生殖细胞和胎儿损伤、生长发育迟缓等严重后果；作为恶性肿瘤的主要治疗手段，放疗对机体正常组织的损伤也不容忽视，如何在放疗过程中保护瘤旁和远端正常组织，亦是放射医学和肿瘤治疗关注的热点。辐射对机体的损伤主要来自两方面一是辐射能量传递的直接作用，二是间接作用即通过水在辐射反应中产生自由基引起的损伤。对于辐射直接作用，除机械屏蔽别无更佳选择。因此抗辐射药物研究主要应从缓解或阻断辐射间接作用上探寻有效途径。目前抗辐射药物主要包括细胞因子、激素及中药复方等，它们大都通过促进机体免疫和造血功能恢复而间接达到减轻辐射损伤目的，尚缺乏功能明确、可直接阻断辐射损伤作用环节的药物；而被证明有效的含硫抗氧化剂代表阿米福汀(氨磷汀)，又因明显的毒性反应而使其应用受到限制。鉴此，研制结构新颖、机制明确、安全有效，特别是能够直接阻断辐射损伤环节的新一代抗辐射药物势在必行。研究已证实自由基在辐射间接损伤中扮演中心角色，研究者也致力于通过清除自由基这一途径寻找有效的抗辐射药物。但是，迄今尚无外源性抗氧化剂(如S0D，GSH)可达理想的清除自由基、阻断辐射损伤作用。究其根本，这些抗氧化剂不能进入细胞，只能部分缓解自由基对细胞膜的损伤，而无法阻断胞内质膜与细胞器的损伤。特别是对辐射损伤的中心环节——线粒体，缺乏根本的保护作用。辐射条件下，细胞内自由基的重要来源为线粒体，其内膜上的呼吸链中有
的氧可经旁路反应形成活性氧(ROS)自由基。而线粒体特殊的双层膜结构和裸露的 DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)决定其更容易受到ROS的损害。线粒体损伤导致氧化磷酸化功能降低，能量耗竭，又会产生大量的R0S，从而进入恶性循环，最终触发细胞凋亡和坏死。因此，线粒体是电离辐射“由内而外”损伤的中心环节，而进入线粒体内部俘获并清除 R0S，从而保护线粒体及整个细胞，是新型抗辐射药物研究的重要切入点。本发明人经过大量实验制备得到了靶向线粒体，并能有效清除活性氧自由基，从而减轻辐射对细胞及计提损伤的新型肽类化合物。
发明内容
本发明的目的在于提供用于预防或治疗辐射损伤的药物。本发明提供了一种肽类化合物，所述肽类化合物是一种由4个氨基酸残基组成的
3寡肽，在本发明中命名为RX31肽，其序列为D-Arg-Dmt-LyS-Phe-NH2，其中Dmt为二甲基酪氨酸。此外，本发明提供了一种药用药物组合物，其中包含所述RX31肽和药物学上可接受的载体。在本发明的一个技术方案中，RX31组合物的剂型为注射剂，使用的药物学上可接受的载体为生理盐水或PBS。在本发明一个优选实施方案中，所述RX31肽的给药剂量为 8 32mg/kg。本发明提供的寡肽适用于预防和治疗辐射引起的机体损伤。早期研究显示，RX31肽有良好的水溶性，能够非电压依赖性穿过质膜进入线粒体， 靶向定位于线粒体内膜并清除自由基；在局部缺血_再灌注损伤模型中，RX31肽能有效减少梗阻器官的坏死。ADME/T研究表明，RX31肽稳定性良好，能通过血脑屏障，并有较高的生物利用度。初步的毒性实验显示，RX31肽高效低毒，具有良好的药用前景。本发明人在研究中发现，RX31肽能在低浓度下有效保护细胞的增殖活性，且呈一定剂量效应关系。其作用机制是清除由辐射产生的R0S，保护线粒体的结构和功能，从而阻断由线粒体功能障碍引起的细胞坏死。本发明提供的药效学实验表明，RX31肽能有效提高小鼠致死剂量照射后的生存率，延长生存时间，并减缓体重下降，提升外周血象。RX31肽的此种保护作用，源于药物减少照射引起的免疫造血系统细胞内的ROS蓄积，保护线粒体并增加存活细胞比例，从而增加骨髓干细胞集落形成能力，并阻止淋巴细胞枯竭。另一方面，本发明提供了所述的肽类化合物在制备用于预防或治疗辐射损伤的药物中的用途。其中所述的辐射为放射辐射，优选为核辐射或6tlCo γ射线辐射。所述药物可以在辐射前，也可以在辐射后施用。另一方面，本发明提供了所述的肽类化合物在制备细胞增殖活性保护剂中的用途。另一方面，本发明提供了所述的肽类化合物在制备细胞凋亡抑制剂中的用途。本发明的优点1.本发明所述的肽能有效进入细胞，对辐射后细胞线粒体和细胞都有显著的保护作用；2. RX31肽不仅照射前应用能够提供辐射保护，而且在照射后给药对辐射损伤也有治疗作用。3. RX31肽皮下注射给药的辐射损伤防护效果优于腹腔注射给药，单次给药就可达到最佳疗效，使用方便快捷。
图1为MTS法检测本发明所述肽对辐射后细胞的增殖活性影响；图2a为本发明所述肽对辐射后细胞内02_产生的影响情况；图2b为本发明所述肽对辐射后细胞内H2O2产生的影响情况；图3为本发明所述肽对辐射后细胞生存情况的影响；图4为本发明所述肽对辐射后细胞周期的影响；图5为本发明所述肽对辐射后细胞线粒体膜电位的保护作用；图6为本发明所述肽对辐射后小鼠30d生存率的影响；
图7为本发明所述肽对辐射后小鼠30d平均生存时间的影响；图8为本发明所述肽对辐射后小鼠30d平均体重改变的影响；图9为本发明所述肽对辐射后小鼠外周血像的影响；图10为本发明所述肽对辐射后小鼠骨髓干细胞集落形成能力影响；图11为本发明所述肽对辐射后小鼠脾和胸腺器官指数的影响；图12为本发明所述肽对辐射后脾淋巴细胞生存状态的影响。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件，或按照制造厂商所建议的方法。
实施例实施例1RX31肽的制备RX31肽(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)用固相合成法制备。通过质谱确证其化学结构， 紫外检测器测定其纯度> 98%，用无菌PBS配制溶液备用。实施例2RX31对辐射后细胞增殖活性的保护中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，常规培养，传代3 5代后消化收集，细胞消化后计数并稀释到6*104/mL，与不同浓度RX31共同孵育15 20min。之后用6tlCo γ射线照射，总剂量7. 5Gy，将照射后的细胞铺板。照射后48小时，MTS法检测细胞增殖活性，并与空白对照 (正常组)和阴性对照(照射损伤组)相比较。结果见图1。结果可见，RX31对细胞有显著保护作用，并在给药浓度范围内，呈现出一定的剂量_效应关系。具体表现为随给药浓度增加，细胞增殖活性损伤越小，且与阴性对照有显著差异(附图中 * :p < 0. 05，** :p < 0. 01，*** :p < 0. 001)。实施例3RX31对辐射后细胞内活性氧(ROS)含量影响的测定细胞与RX31孵育15 20min后照射，照后不同时间点分别用DHE和DCF探针(购自Sigma)标记胞内的O2 -和H2O2，流式细胞术检测平均荧光强度，并与空白对照(正常组) 和阴性对照(照射损伤组)相比较。具体结果如表1，表2及图2所示(附表及附图中
ρ < 0. 05, ** :p < 0. 01，:p < 0. 001)。表1RX31对胞内0厂产生的影响(平均荧光强度，mean士SD，η = 3)
权利要求
1.一种用于预防或治疗辐射损伤的药物组合物，其中含有肽类化合物和药物学上可接受的载体，所述肽类化合物由4个氨基酸残基组成，结构式为D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2，其中 Dmt为二甲基酪氨酸。
2.权利要求1所述的药物组合物，该组合物为注射剂，其中所述的药物学上可接受的载体为PBS或生理盐水。
3.权利要求1所述的肽类化合物在制备用于预防或治疗辐射损伤的药物中的用途。
4.权利要求3所述的用途，其中所述的辐射为放射辐射。
5.权利要求4所述的用途，其中所述的放射辐射为核辐射。
6.权利要求4所述的用途，其中所述的放射辐射为6tlCoγ射线辐射。
7.权利要求3至6中任一项所述的用途，其中所述药物为在辐射前或辐射后施用。
8.权利要求1所述的肽类化合物在制备细胞增殖活性保护剂中的用途。
9.权利要求1所述的肽类化合物在制备细胞凋亡抑制剂中的用途。
全文摘要
本发明属于生物制药领域。本发明涉及一种化学合成肽及其在预防和治疗辐射损伤中的应用。所述化学合成肽可有效降低辐射后的细胞内活性氧含量，减轻自由基对线粒体的损伤，并能显著减少辐射导致的细胞凋亡和坏死，增加细胞存活比例；并可通过对辐射后小鼠的免疫造血系统的保护，从而显著提高致死剂量辐射小鼠的生存率，延长平均生存时间，改善生存质量。
文档编号A61P39/06GK102327600SQ20111027185
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者付洁, 向慎思, 宋海峰, 欧伦, 王清清, 董立厚, 邹佳, 陈方, 高新 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所