癌症免疫治疗的制作方法
【专利摘要】我们将多种TLR激动剂配制入GVAX(工程化以分泌GM-CSF的经致死性辐照的肿瘤细胞疫苗)。特别地，将在患者中发现是安全的GLA和R848、TLR4和TLR7/8激动剂与GVAX配制(TEGVAX–代表TLR激动剂增强的GVAX)，且该制剂在3种不同的临床前模型包括可触知的B16中有效产生抗肿瘤应答。与对照相比，用TEGVAX治疗的小鼠中这些抗肿瘤应答与增加的能够分泌在肿瘤微环境中循环的IFN的CD4和CD8T细胞，以及与显著较高水平的p15E特异性CTL介导的细胞杀伤相关。当与抗-PD-1抗体组合时，TEGVAX能够诱导建立的B16肿瘤的消退。
【专利说明】癌症免疫治疗
[0001]本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的支持下完成。因此，根据基金号NIH K23-DE018464-02的条款，美国政府保留某些权利。
[0002]发明【技术领域】
[0003]本发明涉及癌症治疗领域。特别地，本发明涉及癌症免疫治疗。
[0004]发明背景
[0005]由于其在多种肿瘤类型中的安全性和可用性的广泛历史，被工程化以分泌GM-CSF的致死性辐照的肿瘤细胞疫苗(GVAX)是一种具有用于与免疫检查点阻断剂(blockade)抗体的组合治疗的潜力的疫苗平台。然而，由GVAX分泌的局部GM-CSF可以动员髓样前体细胞(myeloid precursor)成为巨曬细胞和树突细胞,但这种细胞因子可能不会诱导它们的激活。因此，GVAX的主要限制是在免疫系统的传入臂(afferent arm)中最佳肿瘤抗原呈递必需的抗原呈递细胞(APC)的激活。表型模拟(phenocopy)见于针对感染因子(infectiousagent)的疫苗中的稳固免疫应答的一个简单策略是，将多种TLR激动剂与基于癌细胞的疫苗组合。在临床上，已经开发了用于癌症患者的多种佐剂以增强癌症疫苗的效价，并且这些佐剂中的许多典型地是TLR激动剂。
[0006]关于非靶向TLR刺激的一种真正顾虑是肿瘤细胞中慢性TLR刺激的促癌症发生结果(procarcinogenic consequence)。肿瘤细胞上表达的TLR4受体的刺激已显示促进肿瘤发生。然而，造血区室(hematopoietic compartment)中的TLR信号传导已显示引起抗肿瘤应答，其已被转化为(translate into)多个临床试验。为了祀向肿瘤微环境中的树突细胞并测试肿瘤微环境中的TLR4刺激是否能够在体内诱导促癌症发生效应，我们团队瘤内注射了 LPS配制的GVAX，并发现TLR4配体吸附的GVAX(TLR4ligand absorbed GVAX)的瘤内注射改善了三种不同的鼠(murine)模型中的体内局部抗肿瘤应答。
[0007]本领域对获得更安全和更有效的肿瘤治疗存在持续性需求。
[0008]发明概述
[0009]根据本发明的一个方面，提供了可被用于治疗癌症患者的组合物。该组合物包括(a)表达细胞因子的、无增殖能力的(proliferation incompetent)、全癌细胞(wholecancer cell) ； (b)与人程序性死亡 I (Programmed Deathl, PD-1)特异性结合的抗-PD-1抗体；及(c)TLR(toll样受体)激动剂；其中用TLR激动剂配制该全癌细胞。
[0010]根据本发明的另一方面，提供了一种方法。向癌症患者施用剂(agent)。该剂是:
(a)表达细胞因子的、无增殖能力的、全癌细胞；(b)与人程序性死亡I (PD-1)特异性结合的抗-PD-1抗体；及(c) TLR(toll样受体)激动剂；其中用TLR激动剂配制该全癌细胞。用TLR激动剂配制该全癌细胞。
[0011]根据本发明的另一方面，提供了一种试剂盒，其包括以下剂:(a)表达细胞因子的、无增殖能力的、全癌细胞；(b)与人程序性死亡I (PD-1)特异性结合的抗-PD-1抗体；及(c)TLR(toll样受体)激动剂；其中用TLR激动剂配制该全癌细胞。任选地，用TLR激动剂配制该全癌细胞。
[0012] 这些实施方案和当阅读本说明书时将对本领域技术人员明显的其它实施方案，提供了技术。
[0013]附图简述
[0014] 图1A-1D.TEGVAX可增加引流淋巴结中激活的类浆细胞DC(pDC)和常规DC(cDC)。图1A.从疫苗注射后第3天,在非荷瘤小鼠(non-tumor bearing mice)中，定量来自疫苗引流 LN 的 pDC 和 cDC 门控群体(gated population)的 CD86。IDC-1005 是 10% (w/v)角S烯水包油媒介物(vehicle)中的GLA和R848，且TEGVAX是用辐照的GVAX配制的IDC-1005。图1B.相比GVAX，在疫苗注射后第3天，TEGVAX诱导增加的来自引流淋巴结的pDC上的⑶86和⑶80激活标志物(*P〈0.05)。图1C.相比GVAX，在疫苗注射后第3天，TEGVAX具有增加的来自引流淋巴结的cDC上的⑶86和⑶80激活标志物(*P〈0.05)。图1D.从用TEGVAX或GVAX注射后第3至7天，来自DLN的CD86+pDC和cDC。
[0015]图2A-2D.相比GVAX，TEGVAX在多种动物模型中诱导显著的体内抗肿瘤应答。所有这些体内治疗实验都代表至少3个独立实验，且所有实验中每一组都由10只小鼠/组构成。图2A.用GVAX、TEGVAX(GVAX/IDC-1005)、和IDC-1005在对侧肢中治疗患有可触知(palpable)的B16黑素瘤的小鼠，且每天测量肿瘤体积。IDC-1005是在10% (w/v)角鲨烯水包油乳剂中的GLA和R848。图2B.在第7天、第14天和第28天(箭头)，用疫苗和TLR激动剂的多次注射治疗可触知的B16黑素瘤。图2C.用IO6SCCFVn-GVAX在对侧肢中治疗可触知的SCCFVII舌癌，并每天测量肿瘤。用TEGVAX治疗的C3H/He0UJ小鼠消退，并且分别在第22天和第27天在不同的部位(箭头)用30^￥115\104和1\105再攻击这些小鼠(*P〈0.05 ;**P〈0.01)。在这些再攻击的部位无肿瘤生长。图2D.用TEGVAX (GVAX和IDC-1005的I小时孵育)对比未孵育的GVAX和IDC-1005混合物进行B16治疗试验。相比未孵育组，孵育组具有显著的抗肿瘤作用(*p〈0.05)。
[0016]图3A-3D.TEGVAX治疗增加了肿瘤坏死及肿瘤浸润性淋巴细胞和APC。图3A.收集来自每个治疗组的B16肿瘤组织并用H&E染色。TEGVAX治疗的肿瘤显示增加的坏死灶数目(画圆圈区域，20x)。图3B.在20x放大倍率下，在10个独立区域中定量用TEGVAX和GVAX治疗的肿瘤组织中的坏死灶(**P〈0.01)。图3C.每个治疗组中冷冻的肿瘤组织用aCD4和a⑶8FITC缀合物染色，并用DAPI复染。在肿瘤微环境的肿瘤组织中，TEGVAX治疗的B16黑素瘤具有增加的CD4和CD8细胞的浸润。图3D.用免疫荧光显微镜在10个不同的视场随机计数肿瘤浸润性⑶4、⑶8、和⑶86细胞。相比GVAX和IDC-1005治疗的肿瘤，TEGVAX治疗的B16肿瘤具有显著增加的浸润性淋巴细胞(*P〈0.05 ;**P〈0.01)。
[0017]图4A-4D.TEGVAX诱导肿瘤中的ThI应答，以及B7-H1表达的上调。图4A.从治疗的小鼠收集肿瘤引流淋巴结，并进行来自CD4和CD8群体二者的IFNy的细胞内染色。图4B.定量了每个治疗组中⑶4+IFN Y +和⑶8+IFN Y +的平均荧光强度。图4C.收集治疗的肿瘤组织，并用大鼠抗-小鼠B7-H1抗体染色，且抗-大鼠Cy3缀合物被用于评价B7-H1阳性细胞。在40x放大倍率下，在10个不同的视场中进行盲定量，并概述在图4D.中。
[0018]图5A-5D.TEGVAX的体内抗肿瘤应答是⑶4和⑶8T细胞二者依赖性的。图5A.在疫苗治疗期间，GKl.5 (⑶4耗竭)和2.43(⑶8耗竭)抗体二者被腹腔内注射。图5B.在TEGVAX和对照治疗试验中，⑶4、⑶8细胞被分别耗竭。图5C.Rag2_/_小鼠中TEGVAX的抗肿瘤应答被消除。图MyD88-/-和TRIF-/-双敲除小鼠中，TEGVAX的抗肿瘤应答被消除。在这些TLR信号传导缺陷小鼠中，TEGVAX的体内效应与GVAX是相同的(**P〈0.01)。[0019]图6A-B.TEGVAX治疗的小鼠具有增加的肿瘤特异性CTL细胞的数目。在用疫苗和佐剂治疗的B16荷瘤小鼠中进行用P15E肽的体内CTL和ELISP0T试验。图6A.在来自每个治疗组的疫苗治疗后第25天进行体内CTL试验。使用下式计算P15E肽特异性杀伤:(l-CFSEft% /CFSE% ) XlOO0图6Β.在第23天，来自每个治疗组的脾细胞的ELISP0T试验。Ρ15Ε 肽脉冲进入 T2kb APC (**Ρ〈0.01)。
[0020]图7A-7C.TEGVAX/抗-PD-1治疗可诱导建立的B16肿瘤的消退。图7A.右图显示用疫苗和抗-PD-1的各种组合治疗的建立的B16肿瘤的肿瘤生长速率。图7B.左图显示两只小鼠-右边的小鼠是用TEGVAX/抗-PD-1治疗的小鼠之一，左边的小鼠是用GVAX治疗的小鼠之一。TEGVAX治疗的小鼠没有显示任何消退。圆圈显示肿瘤接种部位。箭头显示白癜风的部位。图7C.收集肿瘤引流淋巴结并定量来自⑶4、⑶8、和⑶llc+DC细胞的THl细胞因子。
[0021]图8(补充的图1)在TEGVAX治疗的小鼠的肿瘤引流LN中增加的IL_12、TNF-α和IFN-α。收集了每个治疗组中的肿瘤DLN并分析了⑶Ilc+细胞上的Thl细胞因子谱。相比GVAX或对照治疗组，TEGVAX治疗的小鼠具有显著增加的IL12、TNF_ a和IFN- a阳性CDllc+细胞。
[0022]图9(补充的图2)TEGVAX诱导建立的CT26模型中的抗肿瘤应答。将105CT26结肠癌细胞注射入足垫(footpad)，并用疫苗治疗患有可触知的肿瘤的小鼠。CT26-GVAX如Yoshimura等人(11)中描述的制备。相比单独的CT26-GVAX或单独的IDC-1005，TEGVAX显著降低了小鼠CT 26结肠癌的生长(**P〈0.01)
[0023]图10A-B(补充的图3)被配制入TEGVAX的多种TLR激动剂具有最大的体内抗肿瘤应答。图10A.患有可触知的B16肿瘤的小鼠，用TEGVAX、GVAX、用R848配制的GVAX、或用GLA配制的GVAX治疗。所有配制由在疫苗注射之前使B16-GVAX与在10% (w/v)角鲨烯水包油乳剂媒介物中的佐剂在4°C孵育I小时构成(**P〈0.01)。图10B.含有媒介物不含GVAX的单独佐剂不具有体内抗肿瘤效应。
[0024]图11 (补充的图 4)使用 Lipofectamine?2000 (Invitrogen)，用吸附的 GLA 和R848配制的TEGVAX具有与用水包油乳剂媒介物配制的TEGVAX可比的体内抗肿瘤效应(**Ρ〈0.01)。
[0025]图12(补充的图5)TEGVAX增加了具有来自疫苗的替代肿瘤抗原(surrogatetumor antigen)内源性内吞Q点(Q_dot)的激活DC的数目。GVAX和TEGVAX被Qtracker655 (Invitrogen)标记，并接种到小鼠的足垫中。3天后，收集引流胭LN (drainingpopliteal LN)，并用⑶3和⑶19抗体耗竭淋巴细胞。FACS分析定量来自疫苗的Q-点标记的内源性PDC和cDC。
[0026]发明详述
[0027]我们已经开发了最佳配制的癌症疫苗组合ro-1阻断剂可在治疗上用于治疗肿瘤的体内证据。我们已经收集了证明该组合方案可以有效地针对建立的免疫原性不良的肿瘤的证据。该组合方案的所有组分已在患者中经单独测试，并发现在临床上是安全的。虽然 申请人:不打算受到任何提出的建议机制的约束，但是所公开的治疗策略可通过适应性免疫逃避起效。
[0028]患有不同癌症的患者可被该组合方案治疗。此类癌症包括结肠直肠癌、呼吸消化鳞状细胞癌(aero-digestive squamous cancer)、肺癌、脑癌、肝癌、胃癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、乳腺癌、黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、和肾癌。这个列表意在是说明性的而非限制性的。
[0029]全癌细胞针对治疗接受者(recipient)可以是同种异体的、同基因的、或自体的。通常，它们可通过保留它们的免疫原性和它们的代谢活性的技术被处理以使得它们无增殖能力。一种通常使用的技术是辐照此类细胞。通常，使用患者具有的相同的一般类型的肿瘤细胞。例如，患有黑素瘤的患者通常将被施用无增殖能力的黑素瘤细胞。该细胞可天然地表达和分泌细胞因子或用指导此表达和分泌的核酸通过转染表达和分泌细胞因子。一种合适的细胞因子是GM-CSF。例如，肿瘤细胞可表达编码GM-CSF的转基因，如美国专利号5，637，483,5, 904，920,6, 277，368 和 6，350，445，以及美国专利公布号 20100150946 中描述的，每一篇文献都通过引用明确被并入。用于治疗胰腺癌的表达GM-CSF、遗传修饰的癌细胞的一个实例，在美国专利号6，033，674和5，985，290中描述，这两篇文献都通过引用明确被并入本文。可以使用其它细胞因子。可被使用的合适的细胞因子包括刺激树突细胞诱导、募集和/或成熟的细胞因子。此类细胞因子包括，但不限于，以下的一种或多种:GM-CSF、0)40配体、11^-12、0(^3、0(^20、和 0(^21。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是具有免疫调节活性并与GenBank登录号AAA52122.1具有至少约85%氨基酸序列同一性的细胞因子或片段。
[0030]根据一个可选的实施方案，细胞因子通过表达和分泌一种或多种细胞因子的失活的旁观细胞(bystander cell)递送。旁观细胞可提供所有刺激树突细胞的诱导、募集和/或成熟的细胞因子，或可补充由失活的肿瘤细胞分泌的细胞因子。表达免疫调节细胞因子的旁观细胞系在美国专利号6, 464, 973和8, 012, 469, Dessureault等人,Ann.Surg.0ncol.14:869-84，2007，和 Eager 和 Nemunaitis, Mol.Ther.12:18-27，2005 中描述，每一篇文献都通过引用明确被并入。
[0031]适于在治疗方案和组合物和试剂盒中使用的抗体，包括任何与程序性死亡-1(PD-1)特异性结合的抗体。可被使用的抗体的示例性类型包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、抗体结合片段、和双抗体。通常，抗体基本上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因或其片段编码。抗体能够特异性结合抗原或表位。参见，例如Fundamental Immunology,第三版，ff.E.Paul编著，RavenPress, N.Y.(1993) ；ffilson(1994) ；J.1mmunol.Methodsl75:267-273 ；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods25:85_97。抗体通常与抗原或表位特异性结合。特异性结合发生于对应的抗原或表位，即使在蛋白质和其它生物制剂的异种群体的存在下。抗体的特异性结合表明其以实质上大于与不相关的抗原结合的亲和力与其靶抗原或表位结合。亲和力中的相对差异通常为至少25%较高、更通常为至少50%较高、最通常为至少100%。例如，相对差异可以是至少2x、至少5x、至少10x、至少25x、至少50x、至少100x、至少ΙΟΟΟχ。
[0032]Toll样受体(TLR)是感知微生物产物和/或启动适应性免疫应答的蛋白质家族。TLR激活树突细胞(DC)。TLR是保守的跨膜分子，含有富含亮氨酸重复的胞外域、跨膜结构域和细胞内TIR.(Toll/IL-1R)结构域。TLR识别微生物中的不同结构，通常被称为“PAMP” (病原体相关分子模式)。与TLR结合的配体引起诱导产生参与炎症和免疫的因子的细胞内信号传导通路的级联反应。[0033]可用于这些受体的示例性激动剂包括，但不限于脂蛋白、脂多肽、肽聚糖、酵母聚糖、脂多糖、奈瑟氏球菌孔蛋白、鞭毛蛋白、抑制蛋白、神经酰胺半乳糖脂(galactoceramide)、胞壁酰二肽、吡喃葡萄糖基脂质 A(glucopyranosyl lipid A,GLA)、和瑞喹莫德(R848)。肽聚糖、脂蛋白、和脂磷壁酸是革兰氏阳性细胞壁组分。脂多糖由大多数细菌表达。鞭毛蛋白是由病原细菌和共生细菌分泌的细菌鞭毛的结构组分。神经酰胺半乳糖脂(a-GalCer)是天然杀伤T(NKT)细胞的活化剂。胞壁酰二肽是所有细菌共有的生物活性肽聚糖基序。此类激动剂通过Toll样受体介导先天免疫激活。激动剂对其同源受体(cognate receptor)的特异结合通常用术语亲和力表示。本发明的配体可以以约IO4IVTi和约IO8M-1之间的亲和力结合。亲和力根据Kd = koff/kon(koff是解离速率常数、kon是缔合速率常数、且Kd是平衡常数)被计算。可使用单一或多种激动剂。
[0034]在人类中，已经鉴定了 10种TLR。在细胞表面上表达的TLR包括TLR-1、TLR-2、TLR-4、TLR-5和TLR-6，而TLR-3、TLR-7/8、和TLR-9在ER区室表达。基于不同的TLR表达模式，可鉴定人树突细胞亚组(subset)。通过举例的方式，当被刺激时，DC的髓样或“常规”亚组(mDC)表达TLR1-8，且产生激活标志物(例如⑶80、⑶86、MHC I和II类、CCR7)、促炎细胞因子、和趋化因子的级联反应。这种刺激和导致的表达的结果是抗原特异性CD4+和CD8+T细胞致敏(priming)。这些DC获得占据抗原的增强的能力，并将它们以适当的形式呈递至T细胞。相反，当激活时，DC的类浆细胞亚组(pDC)仅表达TLR7和TLR9，而导致NK细胞以及T细胞的激活。由于垂死的肿瘤细胞可负面影响DC功能，已表明，在癌症治疗的免疫治疗方法中用TLR激动剂激活的DC可有利于致敏抗肿瘤免疫。还表明，使用辐照和化疗成功治疗乳腺癌需要TLR4激活。
[0035]本领域已知的且可用于本发明的TLR激动剂包括，但不限于以下:
[0036]Pam3Cys, TLR-1/2 激动剂；
[0037]CFA, TLR-2 激动剂；
[0038]MALP2, TLR-2 激动剂；
[0039]Pam2Cys, TLR-2 激动剂；
[0040]FSL-1，TLR-2 激动剂；
[0041]Hib-OMPC, TLR-2 激动剂；
[0042]聚肌苷酸:聚胞苷酸(polyribosinic:polyribocytidicacid, Poly 1: C), TLR-3激动剂；
[0043]聚腺苷酸-聚尿苷酸(poly AU)，TLR-3激动剂；
[0044]用聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷胞-聚胞苷酸(Hiltonol?)，TLR-3激动剂；
[0045]单磷酰基脂质(MPL)，TLR-4激动剂；
[0046]LPS，TLR-4 激动剂；
[0047]细菌鞭毛蛋白，TLR-5激动剂；
[0048]唾液酸化-Tn (STn)，与一些人癌细胞上的MUCl粘蛋白相关的碳水化合物和TLR-4激动剂；
[0049]咪喹莫特，TLR-7激动剂；
[0050] 瑞喹莫德，TLR-7/8激动剂；[0051]洛索立宾，TLR-7/8激动剂；及
[0052]未甲基化的CpG 二核苷酸(CpG-ODN)，TLR-9激动剂。
[0053]全癌细胞与TLR激动剂的制剂呈现为增强的功效的促成因素(contributingfactor)。制剂可以在诸如4°C温度下一起孵育诸如1/4、1/2、1、2、3、5、10、24小时的时间段。可选地，可以采用在亲脂性剂或乳化剂存在下的结合。此类剂在本领域是公知的。
[0054]可以设想各种给药方案，同时或错开时间(staggered timing)、单一或多种剂、单个周期或多个周期。
[0055]向癌症患者施用治疗剂的方法不同。示例性的方法包括但不限于皮下、静脉内、肌内、动脉内、皮内、鞘内、肿瘤内、腹腔内、舌下、和硬膜外施用。可以向人、哺乳动物、哺乳类受试者、动物、兽医受试者、安慰剂受试者、研究受试者、或实验受试者施用。典型地，剂诸如外源配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物与受试者在适当的解剖学位置相接触。施用可以是用于治疗、药代动力学研究、诊断分析、研究、安慰剂或实验方法的目的。根据本发明的剂可以，但并非不需要，作为单一组合物施用。虽然作为单一组合物施用被本发明设想，剂可作为分开的施用被递送至单一受试者，施用可在相同或不同的时间、并且施用可通过相同施用途径或不同施用途径。在一些情况下，剂实际上可以在受试者的身体内相互接触，体内形成组合物。
[0056]上述公开总体描述了本发明。本文公开的所有参考文献通过引用被明确并入。可通过参考以下特定实施例获得更完整的理解，其在本文被提供仅用于说明的目的并不预期限制本发明的范围 。
实施例
[0057]为了评价多种TLR激动剂在临床环境中诱导全身性抗肿瘤免疫的能力，我们用GVAX配制了吡喃葡萄糖基脂质A (GLA-TLR4激动剂)和瑞喹莫德(TLR7/8激动剂)，并研究了它们在可触知的B16模型中的体内抗肿瘤效应。GLA是显示具有比单磷酰基脂质A强的TLR4激动剂的合成的六酰化分子，其目前正作为癌症疫苗中的TLR4激动剂佐剂经受临床试验。R848是被发现与咪喹莫特(TLR7激动剂)相比产生50-100倍细胞因子应答的TLR7/8激动剂，且该剂也已通过了患者中安全性的I期试验。我们将已在患者中被单独地测试为临床上安全的这些佐剂组合，以配制TLR激动剂增强的GVAX (TEGVAX)，并在建立的肿瘤环境中检查它们激活APC和提高抗肿瘤T细胞的潜能。
[0058]Li等人和Curran等人均表明，抗_PD_1和细胞疫苗可被组合以诱导体内抗肿瘤应答，但该报告利用非可触知的肿瘤接种方法，该方法可能不会建模具有建立的肿瘤组织的临床环境。Curran等人还将抗-CTLA-4与抗-PD-1和疫苗组合，但由于在临床前和临床研究中与易普利姆玛(ipilimumab)相关的毒性，我们选择抗-PD-1阻断剂。由于我们专注于开发可在肿瘤微环境中产生显著干扰素应答的安全疫苗，我们采用了严格的模型以测试TEGVAX和抗-PD-1对可触知的、建立的B16肿瘤的组合治疗。
[0059]实施例1
[0060]材料和方法
[0061]小鼠和试剂:6-8周龄雌性 C57BL/6、Balb/c、及 C3H/He0UJ 小鼠(Jackson 实验室)根据 Johns Hopkins Hospital (JHH)Animal Care and Use Committee 被饲养。C57BL/6MyD88 / TRIF / 和 B6 (Cg) Rag2tml (Rag2 / )小鼠分别获自 Franck Housseau 博士和 Fan Pan 博士(JHH)。B16 和 B16GVAX 细胞在含有 10 % AFCS、青霉素(100U/ml)和链霉素(100U/ml)的RPMI1640培养基中培养。Cytofix/Cytoperm试剂盒和抗体购自BDBioscience。CDllc+细胞通过抗小鼠 CDllc microBeads (MACS, Miltenyi Biotec)被分离。每2天一次(共5次)腹腔内注射200 μ g/剂量的⑶4耗竭GKl.5抗体(⑶4cbpletingGKl.5antibody)以及 CD8 耗竭 2.43 (CD8cbpleting2.43) (Bio X Cell)。表达阻断抗-PD-1抗体的杂交瘤(克隆G4)获自Charles Drake博士(JHH)。
[0062]在10% (w/v)角S烯水包油乳剂(Immune Design)中制备lmg/ml的吡喃葡萄糖基脂质 A (GLA)和 0.2mg/ml 的瑞喹莫德(R848)。IDC-1005 是 lmg/ml GLA 和 0.2mg/mL R848在乳剂媒介物中的混合物。接种前，将IDC-1005与辐照的GVAX细胞在4°C孵育0.5-2小时。用IDC-1005配制的GVAX被标记为TEGVAX。在某些情况下，用Lipofectamine使不含乳剂媒介物的GLA和R848被吸附进入GVAX细胞，并洗涤4次以除去未吸附的TLR激动剂和转染子。
[0063]肿瘤治疗试验:C57BL/6小鼠在脚垫中被注射1_5χ104Β16。可触知的肿瘤形成之后(5-10天)，将100 μ IlO6的用或未用IDC-1005配制的B16GVAX皮下注射到对侧肢。对照组注射媒介物。对于所有这些实验，使用10只小鼠/组。通过可比的方法，将SCCFVII/SF细胞和CT26细胞分别用于C3H/He0UJ小鼠和Balb/c小鼠(28)。以与B16相同的方式将先前制备的辐照的106SCCFVII/SF-GVAX用于SCCFVII模型(3)。对于CT26模型，转导GM-CSF的CT26细胞被用作CT26GVAX(11)。对于所有疫苗，测定GM-CSF的滴度以确保GM-CSF表达水平介于50-500ng/106细胞/24小时范围内。每天测量肿瘤。在某些情况下，接种前用Qtracker655 (Invitrogen)标记GVAX。对于F1D-1实验,肿瘤是可触知的之后，每周两次腹腔内注射100 μ g/小鼠/注射连同疫苗治疗。
[0064]DC激活分析:在疫苗治疗后3-7天，收集来自荷瘤或幼稚的(naive)小鼠的脾和引流淋巴结(DLN)。将研碎的脾在含有DNA酶 I (Roche)和 Liberase Blendzyme2 (20, OOOMandlU/ml) (Roche)的介质中消化。通过耗竭⑶3+和⑶19+获得富集DC的群体，并针对⑶IIc+和B220+门控。这些通过使用⑶80、⑶86、⑶40和MHCII抗体的多色FACS分析被评价。
[0065]ELISP0T 分析:ELISP0T 板(MultiScreenms 过滤板，Millipore)用小鼠IFN- Y Ab (MabTech)包覆 24 小时，且 T2kb 细胞用 10 μ g/ml 的 P15E (KSPffFTTL)肽脉冲过夜。将来自脾的IO6脾CD8细胞一式三份铺板，以与脉冲的或未脉冲的105T2kb细胞共培养,或用I μ M PMA和10ng/ml离子霉素刺激作为阳性对照。在第3天，加入生物素化的抗小鼠IFN-YAb(MabTech)和链霉亲和素-HRP。使用AEC底物试剂(BD)显影斑点，并使用ELISP0T 酶标仪(Immunospot)分析。
[0066]体内CTL 分析:用 0.5μ M和 5μ M CFSE(Molecular Probes)标记脾细胞。5μΜCFSE标记的细胞用10 μ g/ml P15E (KSPffFTTL)肽脉冲。0.5 μ M CFSE标记的细胞用β -半乳糖苷酶(β-gal) (TPHPARIGL)肽脉冲。用这些细胞的1:1混合物静脉注射小鼠，并在24小时后分离脾细胞 ，并通过流式细胞术分析。使用下式计算抗原特异性杀伤:(1-cfsep15E%
/CFSE0_半乳糖苷酶) XlOOο
[0067]免疫组织化学:用丙酮固定10 μ m厚的冷冻切片，并用I % BSA在室温封闭30分钟。对于石蜡包埋的组织，在如上所述的I % BSA封闭前，将切片固定在4%多聚甲醛中。α⑶4、α⑶8、α⑶86FITC缀合物和α⑶45和α Β7-Η1—抗在4°C孵育I小时。在某些情况下，Cy3缀合物抗体被用作二抗。DAPI用作核复染剂。在X40的放大倍率下，定量了10个随机选择的视场中的阳性细胞。在IHC切片被染色以及随机标记(JF)后，盲法进行(LH)阳性染色的定量。显微镜是Nikon, Eclipse E800。相机是Nikon, DS-QiIMc。软件是NIS-Element AR3.0。
[0068]细胞因子分析:收集的DC用Golgistop?(BD)蛋白质运输莫能菌素(proteintransport monensin)和LPS0.1 μ g/ml孵育5小时。针对抗小鼠CDllc、CD86、MHCI1、IL_12、IFNa和TNFa表达染色DC，且在用Cytokit的膜透化作用后，针对抗小鼠IL_2、IFNa、IFN Y , TNF a表达染色收集的淋巴细胞。冲洗抗体后，通过FACS分析获取数据。
[0069]实施例2
[0070]多种TLR激动剂增强的GVAX(TEGVAX)相比GVAX增加引流淋巴结中激活的常规树突细胞和类浆细胞树突细胞两者
[0071]为了进一步增加由GVAX产生的抗肿瘤应答，我们将GLA和R848与GVAX组合，并测试该TEGVAX制剂是否会增加非荷瘤小鼠的DLN中激活的树突细胞的数目。相比GVAX，TEGVAX能够增强来自疫苗接种部位的DLN中的树突细胞的激活表型(图1)。分析了类浆细胞DC(pDC)和常规DC(cDC)两者，且TEGVAX治疗组的两个群体都显示增强的⑶80和⑶86激活标志物的表达(图1A-C)。在佐剂注射后第3天，门控的DC显示增加的激活标志物峰值，并且这持续直至第7天(图1D)。最后，为了评价这些激活的DC是否提供用于抗肿瘤应答的合适的细胞因子环境，来自引流淋巴结的CDllc+细胞的细胞因子谱还表明IL-12、IFNa、TNFa的增加的数目，其可以使T细胞组分(T-cell r印ertoire)倾向对ThI应答(补充的图1)。
[0072]实施例3
[0073]建立的肿瘤的TEGVAX治疗显著降低体内肿瘤生长速率
[0074]我们最初在治疗模型中用建立的B16肿瘤测试了我们的TEGVAX。当接种的B16肿瘤是可触知的时(通常在第7-10天)，我们用TEGVAX、GVAX、GLA/R848 (IDC-1005)、和媒介物对照在对侧肢皮下治疗荷瘤小鼠。如图2A所示，接受TEGVAX的小鼠仅一次治疗就显示显著较低的肿瘤生长速率。单独的GVAX和单独的TLR激动剂两者具有一些适度的益处，但组合治疗产生了最好的体内抗肿瘤应答。当我们比较TEGVAX与GVAX的制剂与单独的GLA或与单独的R848时，我们发现将GLA/R848制剂组合入GVAX具有最好的抗肿瘤应答(补充的图2A)。
[0075]为了进一步提高抗肿瘤应答，我们用多种TEGVAX治疗进行实验，并发现多种TEGVAX治疗的小鼠都没有表现出可见于未治疗的小鼠中的指数增长(图2B)。由于激活的DC在该时间点的下降的水平，每7天一次注射TEGVAX(图1D)。这些TEGVAX治疗的具有郁积型肿瘤(smoldering tumor)的小鼠,用105B16细胞在不同于原发肿瘤部位的部位被接种，并且，在这些小鼠中，没有肿瘤在第二部位生长，表明针对后续B16攻击的体内免疫(数据未示出)。我们还在C3H小鼠的SCCFVII鳞状细胞癌模型中以及在Balb/c小鼠的CT26结肠癌模型中测试了 TEGVAX，具有可比的结果，表明该抗肿瘤应答适用于多种肿瘤组织学，并且不依赖于鼠背景(图2C)(补充的图3)。对于SCCFVII模型，单一 TEGVAX治疗实际上诱导了肿瘤的完全消退。再次，在这些小鼠中用SCCFVII肿瘤细胞的再攻击没有显示肿瘤在第二部位生长的证据。
[0076] TEGVAX的抗肿瘤效应依赖于TEGVAX的制剂。当我们用GVAX和GLA/R848治疗荷瘤小鼠而未在注射前共孵育I小时时，无抗肿瘤效应被记录(图2D)。我们认为共孵育时间可允许用角鲨烯油乳剂媒介物使疏水TLR激动剂吸附进入GVAX，并且该制剂对于TEGVAX的抗肿瘤应答是必要的。为了测试这一点，我们用Lipofectamine将GLA和R848吸附进入GVAX，并洗涤细胞以除去未吸附的佐剂/转染子，并且我们发现由转染方法产生的TEGVAX与由用亲脂性媒介物的延长孵育方法产生的TEGVAX在它们的抗肿瘤功效方面是可比的(补充的图4)。
[0077]实施例4
[0078]TEGVAX增加肿瘤微环境中淋巴细胞的浸润，且这与肿瘤坏死的诱导、局部ThI应答、及肿瘤上增加的B7-H1表达相关
[0079]我们检查了在我们的治疗分析完成时收集的肿瘤组织，并检查了肿瘤微环境的淋巴细胞。与那些用GVAX或对照治疗的小鼠相比，组织学分析显示用TEGVAX治疗的那些小鼠中显著增加的局灶性坏死的区域(图3A、B)。用⑶4和⑶8抗体的免疫组织化学显示TEGVAX治疗的肿瘤在肿瘤组织中具有丰富的浸润性CD4和CD8细胞(图3C、D)。当我们检查肿瘤引流淋巴结时，我们注意到，相比GVAX或对照治疗，TEGVAX治疗的小鼠具有增加的IFN Y +⑶4和⑶8。为了测试这些增加的ThI细胞是否与肿瘤细胞上的B7-H1上调有关，我们染色肿瘤组织，并发现相比GVAX和媒介物治疗的小鼠，TEGVAX还显著增加B7-H1的表达(图 4C)。
[0080]实施例5
[0081]TEGVAX的抗肿瘤应答依赖于⑶4和⑶8细胞两者，以及MyD88/TRIF信号传导
[0082]为了评价T细胞对TEGVAX的抗肿瘤应答是否是重要的，我们用⑶4和CD8耗竭进行疫苗治疗分析。当⑶4或⑶8T细胞耗竭时，TEGVAX治疗效应被消除，表明⑶4和⑶8淋巴细胞二者对抗肿瘤免疫应答的重要性。使用Rag2K0小鼠的实验证实了这些发现结果(图5A、B、C)。
[0083]由于多种TLR激动剂被用作TEGVAX的制剂组分，我们试图确定TLR信号传导对于疫苗作用是否是关键的。用MyD88/TRIF双敲除小鼠进行B16荷瘤小鼠的TEGVAX治疗。再次，TEGVAX的抗肿瘤效应在这些小鼠中被完全消除，确认了 TEGVAX的抗肿瘤效应依赖于TLR信号传导(图OT)。
[0084]实施例6
[0085]TEGVAX增加肿瘤特异性pl5E特异性细胞毒性T细胞的数目
[0086]由于用TEGVAX的抗肿瘤效应与激活的DC相关的明确的体内证据，我们还检查了免疫系统的效应臂(effector arm)。基于B16肿瘤中免疫显性pl5E抗原的表达,我们进行了体内CTL试验以定量分泌pl5E特异性IFNy的CTL的水平(图6)。如图6所示，在当TEGVAX治疗组与其它对照组的生长速率存在明显的分离的第21天时(图1)，相比GVAX或其它对照小鼠，用TEGVAX治疗的小鼠的脾中存在增加的pl5E特异性CTL的杀伤活性(图6A)。还用以pl5E肽脉冲T2kb细胞作为APC对来自治疗组和对照组中的每一个的⑶8T细胞进行ELISP0T试验。这两个独立的试验表明用TEGVAX治疗的小鼠中增加的肿瘤特异性(抗-P15E) CTL的数目和活性(图6B)。[0087]实施例7
[0088]与抗-PD-1抗体组合的TEGVAX可诱导建立的B16肿瘤的消退
[0089]由于TEGVAX增加pl5E_特异性细胞毒性T细胞以及产生IFN Y的⑶8细胞的数目的能力，我们将TEGVAX与免疫检查点通路Β7-Η1/Η)-1的阻断剂相组合。I3D-1在激活的T细胞上表达且其配体B7-H1在肿瘤细胞上的共定位与抗-PD-1阻断剂的临床疗效相关，该配体87-!11被分泌正^^的T细胞 上调。这些发现暗示了支持的适应性免疫耐受机制是，抗-PD-1阻断剂理想地适于与可产生强大的ThI应答的疫苗相组合。在我们的鼠模型中，TEGVAX增加了分泌IFNy的T细胞以及肿瘤细胞上上调的B7-H1的表达两者(图4)。当抗-PD-1抗体治疗与TEGVAX组合时，在50%的治疗的小鼠中记录到建立的B16肿瘤的消退(图7A)。在响应组合治疗的这些小鼠中，记录到白癜风，如图7B中所示。用单独的抗I3D-1或抗I3D-1与GVAX —起治疗的小鼠相对于单独的GVAX治疗，肿瘤生长速率无改善。相比用单独的TEGVAX或抗-PD-1，这些体内肿瘤治疗试验与从用TEGVAX和抗-PD-1治疗的小鼠的肿瘤DLN中收集的增加的ThI细胞因子的协同作用相关(图7C)。
[0090]实施例8
[0091]讨论
[0092]在此报告中，我们用TLR4 (GLA)和TLR7/8 (R848)激动剂配制了 GVAX，并在3个不同的鼠模型中证明相比单独的GVAX或单独的TLR激动剂，体内抗肿瘤应答的显著增强。我们证明，这些佐剂增加了激活的类浆细胞DC(pDC)以及常规DC(cDC)的数目。这些体内抗肿瘤应答是T细胞依赖的，且相比GVAX治疗组，TEGVAX治疗组中B16模型中的肿瘤特异性pl5E特异性T细胞升高。关于这些实验，我们使用了针对建立的B16肿瘤的治疗模型，该B16肿瘤是在它们成为可触知的之后则不能被已知的疫苗制剂治疗的免疫原性差的肿瘤。随着反复的TEGVAX治疗，肿瘤倾向于显示“郁积型”生长速率，如图2中所示的。对于SCCFVII模型，仅用TEGVAX的单一治疗诱导可触知的肿瘤的消退。对于CT26结肠癌模型，对可触知的病变的TEGVAX治疗也表现出体内抗肿瘤效应(补充的图3)。TEGVAX治疗与在肿瘤引流淋巴结中增加的IFNY+CD4和⑶8细胞以及肿瘤细胞上增加的B7-H1表达相关。当TEGVAX与抗-PD-1阻断剂组合时，我们观察到建立的B16肿瘤的消退，如图7中所示的。
[0093]GLA和R848最初被选择，因为相比其它TLR激动剂，这些佐剂显著诱导增强的抗肿瘤细胞因子谱，并且两者都在患者中被测试是安全的。TLR4激动剂GLA，在其激活鼠和人树突细胞的能力方面与单磷酰脂质A(MPL)进行比较，且GLA被认为在体内和体外增加多种ThI型细胞因子方面是更有效的。TLR7/8激动剂R848，也被发现相对于咪喹莫特在增加I型IFN谱方面具有显著改善。因此，我们的关于建立的肿瘤的体内结果，证明了 TEGVAX作为癌症疫苗的高转化潜力。有趣的是，当我们检查治疗的小鼠的肿瘤微环境时，我们注意到相比GVAX，TEGVAX治疗的小鼠中来自肿瘤引流淋巴结的⑶4和⑶8细胞的增加的IFN Y水平以及来自肿瘤的增加的B7-H1表达(图4)。
[0094]因此，我们的临床前研究是测试疫苗与抗-PD-1阻断剂的组合治疗的很好的场所。B7-H1的诱导对肿瘤细胞的重要性及其与淋巴细胞上的ro-1的接合作为关键的免疫逃避机制，在临床前模型中被证实，且B7-H1表达在临床上与多种癌症类型较差的预后相关。对于患有晚期黑素瘤、肺癌、和肾癌的患者，用阻断抗-PD-1抗体的单一治疗导致显著的存活益处，且同时进行的组织学分析证明B7-H1和IFNy的表达与对ro-Ι阻断剂的应答之间的强的相关性。在上皮组织以及B16-F10肿瘤细胞中，IFN Y可诱导B7-H1表达。累加地，这些发现结果支持适应性耐受机制，由此抗-PD-1阻断剂能够通过部分经由IFNy诱导肿瘤上的B7-H1解开其驻留肿瘤特异性细胞毒性T细胞的抗肿瘤功效，驻留肿瘤特异性细胞毒性T细胞诱导其自身的抑制。因此，抗-PD-1阻断剂理想地适于与诱导IFNy的疫苗的组合治疗。图7中显示的用TEGVAX/抗-PD-1治疗时建立的B16的消退，为抗-PD-1治疗与适当的疫苗组合的临床试验提供体内临床前理由。
[0095]以前的报道表明，抗-PD-1、抗-CTLA-4和疫苗的组合，可促进抗肿瘤应答，但它们的体内试验涉及对不可触知的、非建立的B16肿瘤开始治疗。我们的治疗试验要严格的多，其中我们在B16接种后7-10天开始治疗，在该时间点上大多数免疫治疗是失败的。此外，我们不需要将抗-PD-1与其它免疫检查点阻断剂抗体结合以证明建立的肿瘤的消退。
[0096]当我们检查来自肿瘤的引流淋巴结时，TEGVAX和抗_PD_1组合的协同效应被证实。肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的收集是不可行的，因为消退的肿瘤或小的肿瘤尺寸不能采样用于流式细胞术的足够的细胞。然而，相比单独的TEGVAX或抗-PD-1治疗组中的适度提高，来自胭淋巴结的⑶4和⑶8淋巴细胞两者和⑶Ilc+树突细胞展示IL-2、IL-12和IFN-Y表达水平的数倍增加(图7C)。这些ThI细胞因子与相比TEGVAX和PD-1治疗组TEGVAX/抗-PD-1治疗组中pl5E特异性CTL的增加的数目相关(数据未显示)。
[0097]从转化的角度来看，易普利姆玛与3-4级毒性和治疗相关死亡的独立的报道相关，因此抗-CTLA-4抗体的添加可能不是改善我们的体内结果的第一选择。然而，由于免疫检查点分子的许多家族中显著的冗余，以及临床级检查点阻断抗体的可用性，存在向抗-PD-1治疗增加其它免疫检查点阻断抗体的可能性。由于增加的IFNy可潜在地上调肿瘤微环境中的B7-H1的可能性，可选的方法是使用可与抗-PD-1组合的安全的疫苗增加肿瘤特异性CTL的水平。对于本研究的目的，我们选择了具有TLR4和TLR7/8活性的两种TLR激动剂，但其它TLR激动剂(鞭毛蛋白、CpG、等)或其它PAMP分子是否可以进一步增强抗肿瘤应答还不清楚。最后，应重申的是，TEGVAX的所有组分已在患者中经测试是安全的。由于其自身作为有效的抗肿瘤剂的证明，与抗-PD-1抗体组合的TEGVAX具有用于临床试验的高转化潜力。
[0098]我们先前证明了使用LPS配制的GVAX的瘤内注射的体内应答，但现在我们报道了用TLR4和TLR7/8激动剂两者配制的GVAX作为治疗剂的有效得多的应答。在这些治疗模型中，相比全身性注射，作为瘤内注射的基础的机理是不同的，但累加地，这些实验证明，瘤内注射或全身性注射用细胞疫苗配制的TLR激动剂将不可能具有促癌症发生作用。肿瘤细胞中的MyD88-NF-K B信号传导通路已显示具促癌症发生后果。然而，TLR激动剂已清楚地显示激活树突细胞中的MyD88-TRIF通路以致敏用于抗肿瘤应答的适应性免疫系统。在本报道中，配制入GVAX的TLR激动剂可刺激引流淋巴结中的DC，且在我们的全身性治疗模型中未能够证明任何不利的促癌症发生作用。
[0099]GVAX以及在一些模型中TLR激动剂自身，具有肿瘤生长速率中的早期适度的影响，但在所有被研究的鼠模型中，TEGVAX组与对照组之间具有明确的分离。我们还将TEGVAX与GLA/GVAX和R848/GVAX进行比较，且清楚的是，TEGVAX组合了 TLR4和TLR7/8两者的活性，具有最佳的体内抗肿瘤应答(补充的图2)。对于B16实验，有活力的B16肿瘤细胞被皮下注射在远离最初的肿瘤接种或疫苗接种的部位，且未记录到肿瘤生长。类似地，对于SCCFVII模型，再攻击实验显示仅单一的TEGVAX治疗后就没有肿瘤长出(图2C)。
[0100]我们认为TLR4和TLR7/8两种刺激的组合，可以增加cDC以及pDC 二者以诱导T细胞稳固地致敏为抗肿瘤T细胞，该抗肿瘤T细胞负责TEGVAX的体内抗肿瘤作用。用MyD88-TRIF双敲除小鼠进行TEGVAX治疗试验，且抗肿瘤作用被完全消除(图4C)。MyD88是TLR7/8信号传导的关键介导者(mediator)，且TRIF和MyD88两者均是TLR4信号传导的关键的下游介导者。当我们检查引流淋巴结CDllc+细胞时，我们注意到相比对照，TEGVAX治疗组中增加的ThI细胞因子表达(图5)。CDllc和这些ThI细胞因子的点阵图提供以下信息:双阳性中的增加主要源自CDllc+群体中的移位(shift)，表明TLR激动剂的添加主要诱导了 APC至淋巴结的增加的运输，而不是增加基于每个细胞的炎性细胞因子的产生。为此，我们用Q-点标记了 TEGVAX，并定量引流淋巴结中通过细胞至细胞转移被Q-点标记的内源APC(补充的图5)。对于pDC和cDC两者的群体，存在数量上更多的用Q-点标记的激活的DC，与我们以下的假设相一致:TLR佐剂增加肿瘤和引流淋巴结之间循环的激活的DC数目，其中它们可以致敏T细胞。
[0101]我们以前的关于吸附LPS的GVAX的工作证明，TLR4激动剂吸附进入细胞疫苗对于体内抗肿瘤功效是关键的。我们推测，GLA和R848吸附进入GVAX对于观察到的TEGVAX的增强的抗肿瘤应答也是关键的。当我们简单地共注射了 GLA和R848佐剂与GVAX而没有任何孵育时，不存在体内抗肿瘤应答(图2D)。只有当TLR激动剂和GVAX与亲脂性媒介物孵育一小时，我们才获得能够诱导针对B16模型的局部应答以及诱导针对SCCFVII模型的消退的TEGVAX制剂。为了进一步测试这一点，我们使用不含角鲨烯水包油乳剂的Lipofectamine，用GLA和R848配制了 GVAX，并在B16模型中证明了可相比的体内抗肿瘤应答(补充的图4)。因此，以后工作的一个方面，涉及TEGVAX制剂的进一步优化。
[0102]累加地，本 报道证明，作为治疗性疫苗，TEGVAX提供了超越GVAX的显著改善，其可以显著增强肿瘤特异性T细胞的致敏，即使针对已建立的肿瘤，并且它是待被加入癌症患者中与抗-PD-1阻断抗体或其它形式的免疫检查点阻断剂的组合治疗的优越的候选物。
【权利要求】
1.一种组合物，所述组合物包括: 表达细胞因子的、无增殖能力的、全癌细胞； 与人程序性死亡I (PD-1)特异性结合的抗-PD-1抗体；及 TLR(toll样受体)激动剂； 其中用所述TLR激动剂配制所述全癌细胞。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞因子是GM-CSF(粒细胞单核细胞刺激因子)。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述全癌细胞是所述患者自体的。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中用TLR7/8激动剂配制所述全癌细胞。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中用TLR4激动剂配制所述全癌细胞。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中用TLR4和TLR7/8激动剂配制所述全癌细胞。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述TLR激动剂选自由以下构成的组:GLA、R848、和其组合。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述癌细胞是黑素瘤细胞。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中用乳剂媒介物配制所述TLR激动剂和全肿瘤细胞。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中用Lipofectamine?配制所述TLR激动剂和全肿瘤细胞。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中用阳离子脂质配制所述TLR激动剂和全肿瘤细胞。
12.—种方法，所述方法包括: 向癌症患者施用以下的免疫治疗剂: 表达细胞因子的、无增殖能力的、全癌细胞； 与人程序性死亡I (PD-1)特异性结合的抗-PD-1抗体；及 TLR(toll样受体)激动剂； 其中用所述TLR激动剂配制所述全癌细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞因子是GM-CSF(粒细胞单核细胞刺激因子)。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述全癌细胞是所述患者自体的。
15.根据权利要求12所述的方法，其中用TLR7/8激动剂配制所述全癌细胞。
16.根据权利要求12所述的方法，其中用TLR4激动剂配制所述全癌细胞。
17.根据权利要求12所述的方法，其中用TLR4和TLR7/8激动剂配制所述全癌细胞。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述TLR激动剂选自由以下构成的组:GLA、R848、和其组合。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述全癌细胞是黑素瘤细胞。
20.根据权利要求12所述的方法，其中用乳剂媒介物配制所述TLR激动剂和全肿瘤细胞。
21.根据权利要求12所述的方法,其中用Lipofectamine?配制所述TLR激动剂和全肿瘤细胞。
22.根据权利要求12所述的方法，其中用阳离子脂质配制所述TLR激动剂和全肿瘤细胞。
23.—种试剂盒，所述试剂盒包括以下剂: 表达细胞因子的、无增殖能力的、全癌细胞； 与人程序性死亡I (PD-1)特异性结合的抗-PD-1抗体；及 TLR(toll样受体)激动剂。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，还包括用于施用和/或配制所述剂的说明书。
25.根据权利要求23所述的试剂盒，还包括乳剂媒介物。
26.根据权利要求2 3所述的试剂盒,还包括Lipofectamine?。
27.根据权利要求23所述的试剂盒，还包括阳离子脂质。
【文档编号】A61P35/00GK103957939SQ201280055855
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年9月19日 优先权日:2011年9月19日
【发明者】Y·J·金, D·M·帕多略, J·傅 申请人:约翰霍普金斯大学