N-羟基琥珀酰亚胺用于改善缀合物的稳定性的用途

N-羟基琥珀酰亚胺用于改善缀合物的稳定性的用途
【专利摘要】本发明提供了用于在外源NHS存在的情况下产生具有改善的稳定性的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法。在一些实施方案中，本发明的方法包括添加一定摩尔比的相对于在修饰反应过程中作为双官能接头的水解/氨解的结果产生的NHS量的外源NHS。
【专利说明】N-羟基琥珀酰亚胺用于改善缀合物的稳定性的用途
[0001] 交叉参考相关申请
[0002] 本专利申请要求2011年12月13提交的美国临时专利申请No. 61/570, 139的利 益，将所述美国临时专利申请通过引用并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] 对癌症和其它疾病的治疗是有用的抗体-药物缀合物通常由三个不同的元件组 成：细胞结合剂、接头和细胞毒素剂。常用制剂方法之一包括修饰步骤，其中将细胞结合剂 与双官能接头反应以形成共价地连接于具有反应性基团的接头的细胞结合剂；纯化步骤， 其中将修饰抗体从修饰反应的组分纯化出来；缀合步骤，其中将修饰细胞结合剂与细胞毒 素剂反应以从接头（使用反应性基团）至细胞毒素剂形成共价化学价；和第二纯化步骤，其 中将缀合物从缀合反应的其它组分纯化出来。
[0005] 尽管在制备抗体-药物缀合物上取得了进展，但目前的方法受到几个因素限制。 例如，双官能交联剂对抗体的结合在本领域中目前使用的条件下是异质的，这导致包含稳 定的酰胺键和不稳定的酯键的缀合物。据认为缀合物中不稳定酯键的存在导致药物从缀合 物释放和缀合物的不稳定性。
[0006] 最近的临床试验已显示抗体-药物缀合物在治疗许多不同类型的癌症中的有前 景的作用。因此，存在对改进的制备更稳定的并且比由目前的方法产生的抗体-药物缀合 物更纯的抗体-药物缀合物的方法的需要。本发明提供了这样的方法。本发明的这些和其 它有利方面以及另外的发明特征根据本文中提供的本发明的描述将变得显然。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明提供了用于在外源N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)存在的情况下制造具有改善 的稳定性的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法。
[0009] 发明详述
[0010] 本领域技术人员将理解，包含化学地偶联于细胞毒素剂的抗体的缀合物（"抗 体-细胞毒素剂缀合物"）通常如下进行制备：利用双官能交联试剂（通常利用交联试剂上 的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)反应基团）修饰抗体，纯化具有连接于其的接头的抗体，将细 胞毒素剂缀合于具有连接于其的接头的抗体，和纯化抗体-细胞毒素剂缀合物。本发明通 过使稳定地键合于细胞结合剂的接头的量减少至最少和使导致缀合物不稳定性的不期望 的副反应降至最低来改进这样的方法。
[0011] 作为双官能接头（例如，SPP、STOB、SMCC)的水解/氨解的结果，在修饰反应过程 中产生少量NHS。NHS目前被本领域技术人员当作修饰反应的不期望的（或至少中性）副 产物。因此，目前的方法通常包括在添加细胞毒素剂之前纯化修饰抗体，这导致在缀合反应 之前NHS的除去。
[0012] 令人惊讶地发现，在外源NHS存在的情况下制备抗体-细胞毒素剂缀合物导致缀 合物的稳定性的显著增加，如通过游离类美登素的释放测量的。因此，本发明提供了用于在 外源NHS存在的情况下制造具有改善的稳定性的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法。
[0013] 本发明提供了用于制备细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括添 加外源NHS。如本文中所用，"外源NHS"是指在方法过程中从外部来源添加的NHS，并且不 是指在修饰反应过程中作为双官能接头的水解/氨解的结果产生的NHS。
[0014] 在一个实施方案中，本发明提供了用于制备细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的 方法,所述方法包括添加约0. ImM至约300mM的外源NHS。例如，本发明的方法包括添加 约 0· ImM、约 0· 2mM、约 0· 3mM、约 0· 4mM、约 0· 5mM、约 0· 6mM、约 0· 7mM、约 0· 8mM、约 0· 9mM、 约 L OmM、约 L ImM、约 L 3mM、约 L 5mM、约 L 7mM、约 L 9mM、约 2. OmM、约 2. ImM、约 2. 3mM、 约 2. 5mM、约 2. 7mM、约 2. 9mM、约 3. OmM、约 3. ImM、约 3. 3mM、约 3. 5mM、约 3. 7mM、约 3. 9mM、 约 4. OmM、约 4. ImM、约 4. 3mM、约 4. 5mM、约 4. 7mM、约 4. 9mM、约 5. OmM、约 5. ImM、约 5. 3mM、 约 5. 5mM、约 5. 7mM、约 5. 9mM、约 6. OmM、约 6. ImM、约 6. 3mM、约 6. 5mM、约 6. 7mM、约 6. 9mM、 约 7. OmM、约 7. ImM、约 7. 3mM、约 7. 5mM、约 7. 7mM、约 7. 9mM、约 8. OmM、约 8. ImM、约 8. 3mM、 约 8. 5mM、约 8. 7mM、约 8. 9mM、约 9. OmM、约 9. ImM、约 9. 3mM、约 9. 5mM、约 9. 7mM、约 9. 9mM、 约 10mM、约 llmM、约 12mM、约 13mM、约 14mM、约 15mM、约 16mM、约 17mM、约 18mM、约 19mM、 约 20mM、约 25mM、约 30mM、约 35mM、约 40mM、约 45mM、约 50mM、约 55mM、约 60mM、约 65mM、约 70mM、约 75mM、约 80mM、约 85mM、约 90mM、约 95mM、约 lOOmM、约 llOmM、约 120mM、约 130mM、 约 140mM、约 150mM、约 160mM、约 170mM、约 180mM、约 190mM、约 200mM、约 210mM、约 220mM、 约 230mM、约 240mM、约 250mM、约 260mM、约 270mM、约 280mM、约 290mM 或约 300mM 外源 NHS。 在一个实施方案中，本发明的方法包括添加约〇. ImM至约5mM、约0. ImM至约10mM、约1. OmM 至约5mM、约1. OmM至约10mM、约5. OmM至约10mM、约10mM至约20mM、约20mM至约30mM、 约30mM至约40mM、约40mM至约50mM、约50mM至约60mM、约60mM至约70mM、约70mM至约 80mM、约 80mM 至约 90mM、约 90mM 至约 100mM、约 100mM 至约 llOmM、约 llOmM 至约 120mM、约 120mM 至约 130mM、约 130mM 至约 140mM、约 140mM 至约 150mM、约 150mM 至约 160mM、约 160mM 至约 170mM、约 170mM 至约 180mM、约 180mM 至约 190mM、约 190mM 至约 200mM、约 200mM 至 约 220mM、约 220mM 至约 240mM、约 240mM 至约 260mM、约 260mM 至约 280mM 或约 280mM 至约 300mM外源NHS。在另一个实施方案中，本发明的方法包括添加约10mM至约200mM、约20至 约150mM、约50至约150mM或约20至约100mM外源NHS。
[0015] 在一些实施方案中，本发明的方法包括添加相对于作为双官能接头的水解/氨解 的结果在修饰反应过程中产生的NHS的量的一定摩尔比的外源NHS。本领域技术人员可测 定在特定修饰过程中产生的NHS的量，因为产生的NHS的量基本上与使用的双官能接头的 量相等。本领域技术人员随后可向反应混合物中添加相对于在修饰反应中产生的NHS的量 的一定摩尔比的外源NHS。在一个实施方案中，相对于在修饰反应过程中产生的NHS的量添 加约2至约200倍的外源NHS。例如，本发明的方法包括添加相对于在修饰反应中产生的 NHS的量约2倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约50倍、约100倍、或约200 倍的外源NHS。
[0016] 在一些实施方案中，本发明的方法包括添加相对于双官能接头的量的一定摩尔 比的外源NHS。在一个实施方案中，外源NHS对双官能交联试剂的摩尔比为约0. 5至约 1000(例如，约1至约900、约5至约750、约50至约500、约100至约500、约0. 5至约500 或约100至约1000)。例如，本发明的方法包含相对于双官能接头的量约0. 5倍、约1倍、约 2倍、约5、约10倍、约15、约20倍、约25、约50倍、约100倍、约200倍、约300倍、约400 倍、约500倍、约600倍、约700倍、约800倍、约900或约1000倍的NHS。
[0017] 已描述了许多用于制备细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法（参见，例如， 美国临时专利申请No. 61/468, 997、美国专利5, 208, 020、美国专利6, 441，163、美国专利 7, 811，572、美国专利申请公布No. 2006/0182750、美国专利申请公布No. 2008/0145374、美 国专利申请公布No. 2011/0003969和美国专利申请公布No. 2012/0253021)。本 申请人:已 令人惊讶地发现在用于制备细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法的过程中在任意点上 外源NHS的添加对缀合物稳定性具有有益效应。因此，本发明的方法包括在制备细胞结合 剂-细胞毒素剂缀合物的方法的过程中在任意点上添加外源NHS。例如，本发明的方法包 括将外源NHS添加至修饰步骤（即，其中将细胞结合剂与双官能接头反应的步骤）、缀合步 骤（即，其中将修饰细胞结合剂与细胞毒素剂反应的步骤）、纯化步骤或在前述步骤的任何 步骤之间的保持步骤。在一个实施方案中，本发明的方法包括将外源NHS添加至修饰步骤 (即，将NHS添加至修饰反应）、修饰步骤与纯化步骤之间的保持步骤、修饰步骤与缀合步骤 之间的保持步骤、纯化步骤、缀合步骤、缀合步骤与纯化步骤之间的保持步骤和/或两个纯 化步骤之间的保持步骤。
[0018] 在一个实施方案中，本发明提供了用于制备具有连接于其的接头的细胞结合剂 的方法，所述方法包括在外源NHS存在的情况下将细胞结合剂与双官能交联试剂反应，以 将接头共价地连接于细胞结合剂，从而制备包含具有连接于其的接头的细胞结合剂的混合 物。
[0019] 根据本发明的方法，将细胞结合剂与双官能交联试剂（即，修饰反应）接触产生包 含具有连接于其的细胞结合剂以及反应物和其它副产物的第一混合物。在本发明的一些实 施中，第一混合物包含具有稳定和不稳定地键合于其的接头的细胞结合剂以及反应物和其 它副产物。当接头与细胞结合剂之间的共价键在正常贮存条件下在一段时期（所述时期可 从数月变化至数年）内未被显著削弱或断裂时，接头被"稳定地"键合于细胞结合剂。相反 地，当接头与细胞结合剂之间的共价键在正常贮存条件下在一段时期（所述时期可从数月 变化至数年）内被显著削弱或断裂，则接头被"不稳定地"键合于细胞结合剂。
[0020] 修饰反应优选在约4至约pH9的pH (例如，约4. 5至约8. 5、约5至约8、约5. 5至 约7. 5、约6至约7、约6至约8、约6至约9或约6. 5至约7. 5的pH)下进行。在一些实施 方案中，修饰反应在约6至约8的pH(例如，约6、约6. 5、约7、约7. 5或约8的pH)下进行。
[0021] 在本发明的一个实施方案中，修饰细胞结合剂从反应和副产物的纯化通过将第一 混合物经历纯化法来进行。在这一点上，第一混合物可使用切向流过滤（TFF)例如基于膜 的切向流过滤法、非吸附色谱、吸附色谱、吸附过滤或选择性沉淀或任何其它适当的纯化法 以及其组合来进行纯化。该第一纯化步骤提供了纯化的第一混合物，即相较于在根据本发 明的纯化之前的第一混合物增加的具有连接于其的接头的细胞结合剂的浓度和减少的未 键结合的双官能交联试剂的量。优选地，第一混合物使用切向流过滤来进行纯化。
[0022] 在纯化第一混合物以获得具有连接于其的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合 物后，通过将具有连接于其的接头的细胞结合剂与细胞毒素剂在具有约4至约9的pH的溶 液中反应来将细胞毒素剂缀合于第一纯化的混合物中的具有连接于其的接头的细胞结合 齐U，从而形成第二混合物，其中产生包含（i)通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结 合剂、（ii)游离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混合物。
[0023] 任选地，可省略修饰细胞结合剂的纯化。因此，在本发明的一个实施方案中，未将 包含具有连接于其的细胞结合剂以及反应物和其它副产物的第一混合物经历纯化法。在这 样的情况下，可将细胞毒素剂与交联试剂同时添加，或可一些更晚的点，例如在将交联试剂 添加至细胞结合剂后1、2、3或更多个小时添加细胞毒素剂。通过将修饰细胞结合剂与细胞 毒素剂在具有约4至约9的pH的溶液中反应来将修饰细胞结合剂缀合于细胞毒素剂（例 如，类美登素），其中缀合步骤导致稳定的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、非稳定的细胞 结合剂-细胞毒素剂缀合物、非缀合细胞毒素剂（即，"游离"细胞毒素剂）、反应物和副产 物的混合物的形成。
[0024] 缀合反应优选在约4至约pH9的pH(例如，约4. 5至约8. 5、约5至约8、约5. 5至 约7. 5、约6. 0至约7或约6. 5至约7. 5的pH)下进行。在一些实施方案中，缀合反应在约 6 至约 6. 5 的 pH(例如，5. 5 至 7 的 ρΗ、5· 7 至 6. 8 的 ρΗ、5· 8 至 6. 7 的 ρΗ、5· 9 至 6. 6 的 pH 或6至6. 5的pH、）、约6或更低的pH(例如，约4至6、约4至约5. 5、约5至6的pH)或约 6. 5或更高的pH(例如，6. 5至约9、约6. 5至约7、约7至约9、约7. 5至约9或6. 5至约8 的pH)下进行。在一个实施方案中，缀合反应在约4的pH至低于6的pH下或在高于6. 5 至9的pH下进行。当缀合步骤在约6. 5或更高的pH下进行时，一些含巯基细胞毒素剂可 易于通过二硫键形成二聚化。在一个实施方案中，可能需要从反应混合物除去痕量金属和 /或氧以及任选地添加抗氧化剂或使用具有更具反应性的离去基团的接头或以超过一个等 分添加细胞毒素剂来使得在这样的情况下能够进行高效反应。
[0025] 本发明的方法可任选地包括将蔗糖添加至用于本发明的方法的缀合步骤，以增加 细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的稳定性和回收。令人想要地，以约〇. 1% (w/v)至约20% (w/v)(例如，约 0.1% (w/v)、l% (w/v)、5% (w/v)、10% (w/v)、15% (w/v)或 20% (w/v)) 的浓度添加鹿糖。优选地，以约1% (w/v)至10% (w/v)(例如，（例如，约0. 5% (w/v)、约 1% (w/v)、约 1.5% (w/v)、约 2% (w/v)、约 3% (w/v)、约 4% (w/v)、约 5% (w/v)、约 6% (w/v)、约 7 % (w/v)、约 8 % (w/v)、约 9 % (w/v)、约 10 % (w/v)或约 11 % (w/v))的浓度 添加蔗糖。此外，缀合反应还可包括缓冲剂的添加。可使用本领域已知的任何适当的缓冲 齐[J。适当的缓冲剂包括例如柠檬酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲 齐U。在优选实施方案中，缓冲剂选自HEPPSO (N- (2-羟乙基）哌嗪-Ν' - (2-羟基丙磺酸））、 P0PS0 (哌嗪-1，4-双-(2-羟基-丙烷-磺酸）脱水物）、HEPES (4- (2-羟乙基）哌嗪-1-乙 磺酸）、HEPPS(EPPS) (4-(2-羟乙基）哌嗪-1-丙磺酸）、TES(N-[三（羟甲基）甲基]-2-氨 基乙磺酸）及其组合。
[0026] 在缀合步骤后，将缀合物经历纯化步骤。在这一点上，缀合混合物可使用切向流过 滤（TFF)例如基于膜的切向流过滤法、非吸附色谱、吸附色谱、吸附过滤或选择性沉淀或任 何其它适当纯化法以及其组合来纯化。本领域技术人员将理解，缀合步骤后的纯化使得能 够分离包含化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的稳定的缀合物。
[0027] 在一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含化学地偶联于细胞毒素剂的细 胞结合剂的缀合物的方法，所述方法包括在修饰步骤后的第一纯化步骤和在第缀合步骤 后的第二纯化步骤，其中方法包括外源NHS。可在本发明的方法过程中的任意点上添加外 源NHS(即，至修饰步骤、至缀合步骤、至纯化步骤或至上述步骤的任一个之间的的保持步 骤）。例如，在一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒 素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括（a)将细胞结 合剂与双官能交联试剂接触，以将接头共价地连接于细胞结合剂，从而制备包含具有连接 于其的接头的细胞结合剂的第一混合物，（b)将第一混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、 非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，从而制备具有连接于其的接头的细胞结合剂的 纯化的第一混合物，（c)通过将具有连接于其的接头的细胞结合剂与细胞毒素剂反应来将 细胞毒素剂缀合于纯化的第一混合物中的具有连接于其的接头的细胞结合剂，从而制备包 含（i)含有通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀 合物、（ii)游离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混合物，和（d)将第二混合物经历 切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合以将细胞结合剂-细 胞毒素剂缀合物从第二混合物的其它组分纯化出来，从而制备细胞结合剂-细胞毒素剂 缀合物的纯化的第二混合物，其中在步骤（a)期间或之后以及在步骤（c)之前添加外源 NHS (即，在外源NHS存在的情况下进行步骤步骤（a)中的接触，所述方法包括在外源NHS存 在的情况下在步骤（a)之后保持混合物，在步骤（b)中添加外源NHS和/或方法包括在外源 NHS存在的情况下在步骤（b)之后保持第一混合物）。在另一个实施方案中，本发明提供了 用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素 剂缀合物的方法，方法包括：(a)将细胞结合剂与双官能交联试剂接触以将接头共价连接 于细胞结合剂，从而制备包含具有连接于其的接头的细胞结合剂的第一混合物，（b)将第一 混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，从而制备 具有连接于其的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合物，（c)通过将具有连接于其的接头 的细胞结合剂与细胞毒素剂在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下反应来将细胞毒素剂 缀合于纯化的第一混合物中的具有连接于其的接头的细胞结合剂，从而制备包含（i)含有 通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、（ii) 游离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混合物，和（d)将第二混合物经历切向流过滤、 选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合以将细胞结合剂-细胞毒素剂缀合 物从第二混合物的其它组分纯化出来，从而制备细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的 第二混合物。在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含通过接头化学地偶联于细 胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法，方法包括：(a)将细胞结 合剂与双官能交联试剂接触以将接头共价地连接于细胞结合剂，从而制备包含具有连接于 其的接头的细胞结合剂的第一混合物，（b)将第一混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非 吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，从而制备具有连接于其的接头的细胞结合剂的纯 化的第一混合物，（c)通过将具有连接于其的接头的细胞结合剂与细胞毒素剂反应来将细 胞毒素剂缀合于纯化的第一混合物中的具有连接于其的接头的细胞结合剂，从而制备包含 (i)含有通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合 物、（ii)游离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混合物，（d)在外源N-羟基琥珀酰亚 胺存在的情况下温育第二混合物；和（e)在步骤（d)之后将第二混合物经历切向流过滤、选 择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合以将细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物 从第二混合物的其它组分纯化出来，从而制备通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结 合剂的纯化的第二混合物。
[0028] 本文中描述的任何纯化法可用于本发明的方法。在本发明的一个实施方案中，在 纯化步骤中使用切向流过滤（TFF，也称为交叉流过滤、超滤和渗滤）和/或吸附色谱树脂。 例如，本发明的方法可包含在修饰步骤后使用TFF的第一纯化步骤和在缀合步骤后使用 TFF的第二纯化步骤。或者，本发明的方法可包括在修饰步骤后使用吸附色谱的第一纯化步 骤和在缀合步骤后使用吸附色谱的第二纯化步骤。本发明的方法还可包括在修饰步骤后使 用吸附色谱的第一纯化步骤和在缀合步骤后使用TFF的第二纯化步骤，或在修饰步骤后使 用TFF的第一纯化步骤和在缀合步骤后使用吸附色谱的第二纯化步骤。
[0029] 在本发明的一个实施方案中，将非吸附色谱用作纯化步骤。例如，本发明的方法可 包括在修饰步骤后使用非吸附色谱的第二纯化步骤和在缀合步骤后使用非吸附色谱的第 二纯化步骤。
[0030] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含化学地偶联于细胞毒素剂的细 胞结合剂的缀合物的方法，其中在修饰反应后和在缀合反应前，未将包含具有连接于其的 接头的细胞结合剂的第一混合物经历，并且其中所述方法包括外源NHS。可在在本发明的 方法过程中的任意点上添加外源NHS(即，至修饰步骤、至缀合步骤、至纯化步骤或至上述 步骤的任一个之间的保持步骤）。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含通 过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法， 所述方法包括：(a)将细胞结合剂与双官能交联试剂接触以将接头共价地连接于细胞结合 齐U，从而制备包含具有连接于其的接头的细胞结合剂的第一混合物，（b)通过将具有连接于 其的接头的细胞结合剂与细胞毒素剂反应来将细胞毒素剂缀合于第一混合物中的具有连 接于其的接头的细胞结合剂，从而制备包含（i)含有通过接头偶联于细胞毒素剂的细胞结 合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、（ii)游离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二 混合物，和（c)将第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色 谱或其组合，以将细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从第二混合物的其它组分纯化出来，从 而制备细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物，其中在步骤（a)的过程中或 之后和在步骤（b)之前添加外源N-羟基琥珀酰亚胺（S卩，在外源NHS存在的情况下进行步 骤（a)中的接触和/或所述方法包括在外源NHS存在的情况下在步骤（a)之后保持第一混 合物）。在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒 素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括：(a)将细胞结 合剂与双官能交联试剂接触以将接头共价连接于细胞结合剂，从而制备包含具有连接于其 的接头的细胞结合剂的第一混合物，（b)通过将具有连接于其的接头的细胞结合剂与细胞 毒素剂在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下反应来将细胞毒素剂缀合于第一混合物中 的具有连接于其的接头的细胞结合剂，从而制备包含（i)含有通过接头偶联于细胞毒素剂 的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、（ii)游离细胞毒素剂和（iii)反应副产 物的第二混合物，和（c)将第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过 滤、吸附色谱或其组合，以将细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从第二混合物的其它组分纯 化出来，从而制备细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物。在另一个实施方 案中，本发明提供了用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的缀合 物的方法，所述方法包括：(a)将细胞结合剂与双官能交联试剂接触以将接头共价地连接 于细胞结合剂，从而制备包含具有连接于其的接头的细胞结合剂的第一混合物，（b)通过将 具有连接于其的接头的细胞结合剂与细胞毒素剂反应来将细胞毒素剂缀合于第一混合物 中的具有连接于其的接头的细胞结合剂，从而制备包含（i)含有通过接头化学地偶联于细 胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、（ii)游离细胞毒素剂和（iii) 反应副产物的第二混合物，（c)在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下温育第二混合物； 和（d)将第二混合物在步骤（c)之后经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、 吸附色谱或其组合，以将细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从第二混合物的其它组分纯化出 来，从而制备细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物。本文中描述的任何纯 化法可用作缀合反应后的纯化步骤。在优选实施方案中，将切向流过滤、吸附色谱或非吸附 色谱用作缀合反应后的纯化步骤。
[0031] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含化学地偶联于细胞毒素剂的细 胞结合剂的缀合物的方法，其中将修饰反应和缀合反应组合入单个步骤，随后进行纯化步 骤（如在美国临时专利申请No. 61/468, 997和美国专利申请公布No. 2012/0253021中描述 的），并且其中方法包括外源NHS。可在本发明的方法过程中的任意点上添加外源NHS (即， 至组合修饰/缀合步骤、至纯化步骤或至上述步骤之间的保持步骤）。因此，在一个实施方 案中，本发明提供了用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞 结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括：(a)将细胞结合剂与细胞毒素剂在外源 N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒素剂的第一混合物， 随后将第一混合物与包含接头的双官能交联试剂在具有约4至约9的pH的溶液中接触，以 提供包含（i)含有通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒 素剂缀合物、（ii)游离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混合物；和（b)将第二混合 物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以将细胞结合 剂-细胞毒素剂缀合物从第二混合物的其它组分纯化出来，从而制备细胞结合剂-细胞毒 素剂缀合物的纯化的第二混合物。在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含通过 接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所 述方法包括：(a)将细胞结合剂与细胞毒素剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒素剂的 第一混合物，随后将第一混合物与包含接头的双官能交联试剂在外源N-羟基琥珀酰亚胺 存在的情况下于具有约4至约9的pH的溶液中接触，以提供包含（i)含有通过述接头化 学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、（ii)游离细胞毒 素剂和（iii)反应副产物的第二混合物；和（b)将第二混合物经历切向流过滤、选择性沉 淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以将细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从第 二混合物的其它组分纯化出来，从而制备细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混 合物。在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素 剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法，方法包括：(a)将细胞结合剂与 细胞毒素剂接触以形成包含细胞结合剂和细胞毒素剂的第一混合物，随后将第一混合物与 包含接头的双官能交联试剂于具有约4至约9的pH的溶液中接触，以提供包含（i)含有通 过述接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、（ii) 游离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混合物；(b)在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的 情况下温育第二混合物；和（c)将第二混合物在步骤（b)之后经历切向流过滤、选择性沉 淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以将细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从第 二混合物的其它组分纯化出来，从而制备细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混 合物。在一个实施方案中，在将第一混合物与双官能交联试剂接触后立即进行步骤（b)的 温育（即，在组合修饰/缀合步骤后的保持步骤）。在一个实施方案中，方法包括将第二混合 物经历步骤（a)与（b)之间的纯化步骤，以将细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从第二混合 物的其它组分纯化出来，从而在保持步骤之前（即，在步骤（b)之前）制备细胞结合剂-细 胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物。本文中描述的任何纯化法可用于本发明的方法。在 优选实施方案中，切向流过滤、吸附色谱或非吸附色谱用作纯化步骤。
[0032] 在一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含化学地偶联于细胞毒素剂的细 胞结合剂的缀合物的方法，其中所述方法包括将预形成的细胞毒素剂-接头化合物缀 合于细胞结合剂，如美国专利6, 441，163以及美国专利申请公布No. 2011/0003969和 2008/0145374中描述的，并且其中方法包括外源NHS。可在本发明的方法的过程中的任意 点上添加外源NHS(即，至缀合步骤、至纯化步骤或上述步骤之间的保持步骤）。例如，在一 个实施方案中，本发明提供了用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合 剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括（a)将细胞结合剂与包含化学 地偶联于接头的细胞毒素剂的细胞毒素剂-接头化合物接触，以将细胞毒素剂-接头化合 物共价地连接于细胞结合剂，从而制备包含含有通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞 结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的混合物和（b)将包含细胞结合剂-细胞毒素剂 缀合物的混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合， 以纯化缀合物，其中在步骤（a)期间或之后和在步骤（b)之前添加外源N-羟基琥珀酰亚胺 (即，在外源NHS存在的情况下进行步骤（a)中的接触或方法包括在外源NHS存在的情况下 在（a)之后保持混合物）。在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备包含通过接头化 学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法 包括：(a)将细胞结合剂与包含化学地偶联于接头的细胞毒素剂的细胞毒素剂-接头化合 物接触，以将细胞毒素剂-接头化合物共价地连接于细胞结合剂，从而制备包含含有通过 接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的混合物； (b)在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下温育步骤（a)的混合物；和（c)将混合物在步 骤（b)后经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以将细 胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从混合物的其它组分纯化出来，从而制备细胞结合剂-细胞 毒素剂缀合物的纯化的混合物。方法任选地包括将步骤（a)的混合物经历步骤（a)与（b) 之间的纯化，以将细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从混合物的其它组合分纯化出来，从而 在保持步骤（步骤（b))之前制备细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的混合物。步骤 (a)与（b)之间的纯化步骤任选地在外源NHS存在的情况下进行。本文中描述的任何纯化 法可用于本发明的方法。在优选实施方案中，切向流过滤、吸附色谱或非吸附色谱用作纯化 步骤。
[0033] 在一个实施方案中，通过将细胞毒素剂与包含接头双官能交联试剂接触来制备细 胞毒素剂-接头化合物，以将细胞毒素剂共价地连接于接头。在将细胞毒素剂-接头化合 物与细胞结合剂接触之前，将细胞毒素剂-接头化合物任选地经历纯化。
[0034] 在本发明的一个实施方案中，本发明的方法包括在缀合步骤后两个分开的纯化步 骤。可在外源NHS存在的情况下进行缀合反应后的纯化步骤。例如，本发明的方法可包括 缀合步骤，随后进行纯化步骤（在外源NHS不存在或存在的情况下），随后在外源NHS存在 的情况下进行保持步骤，随后进行另一个纯化步骤。本文中描述的任何纯化法可用作缀合 反应后的纯化步骤。在优选实施方案中，切向流过滤、吸附色谱、非吸附色谱或其组合在缀 合反应后用作纯化步骤。
[0035] 任何适当的TFF系统可用于纯化，包括Pell icon型系统 (Millipore, Billerica, ΜΑ) > Sartocon Cassette 系统（Sartorius AG, Edgewood, NY)和 Centrasette 型系统（Pall Corp.，East Hills, NY)。
[0036] 任何适当的吸附色谱树脂可用于纯化。优选吸附色谱树脂包括羟基磷灰石色 谱法、疏水性电荷诱导色谱法（HCIC)、疏水相互作用色谱法（HIC)、离了交换色谱法、混 合模式离子交换色谱法、固定金属亲和色谱法（IMAC)、染料配体色谱法、亲和色谱法、反 相色谱法及其组合。适当的羟基磷灰石树脂的实例包括陶瓷羟基磷灰石（CHT I型和II 型，Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)、HA Ultrogel 轻基憐灰石（Pall Corp.，East Hills, NY)和陶瓷氟憐灰石（CFT I 型和 II 型，Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。适当 的HCIC树脂的实例为MEP Hypercel树脂（Pall Corp.，East Hills, NY)。适当的HIC树脂的 实例包括丁基-Sepharose、己基-Sepaharose、苯基-Sepharose和辛基Sepharose树脂（全 部来自 GE Healthcare, Piscataway，NJ)以及 Macro-prep 甲基和 Macro-Prep 叔-丁基树 脂（Biorad Laboratories, Hercules, CA)。适当的离子交换树脂的实例包括SP-Sepharose、 CM-Sepharose 和 Q-Sepharose 树脂（全部来自 GE Healthcare, Piscataway, NJ)以及 Unosphere S 树脂（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。适当的混合模式离子交换 剂的实例包括 Bakerbond ABx 树脂（JT Baker，Phillipsburg NJ)。适当的 IMAC 树脂 的实例包括螯合 Sepharose 树脂（GE Healthcare, Piscataway, NJ)和 Profinity IMAC 树脂（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。适当的染料配体树脂的实例包括Blue Sepharose 树脂（GE Healthcare, Piscataway, NJ)和 Affi-gel Blue 树脂（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。适当的亲和树脂的实例包括蛋白A Sepharose树脂（例 如，MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, NJ)，其中细胞结合剂为抗体，和外源凝集素 亲和树脂例如兵豆属植物外源凝集素 Sepharose树脂（GE Healthcare, Piscataway, NJ)， 其中细胞结合剂具有适当的外源凝集素结合部位。或者，可使用对于细胞结合 剂是特异的抗体。可将这样的抗体固定于例如Sepharose 4Fast Flow树脂（GE Healthcare, Piscataway, NJ)。适当的反相树脂的实例包括C4、C8和C18树脂（Grace Vydac，Hesperia, CA)〇
[0037] 任何适当的非吸附色谱树脂可用于纯化。适当的非吸附色谱树脂的实例包括但不 限于 SEPHADEX? G-25、G-50、G-100、SEPHACRYL? 树脂（例如，S-200 和 S-300)、SUPERDEX? 树脂（例如，SUPERDEX?75 和 SUPERDEX?200)、BIO-GEL?树脂（例如，P-6、P-10、P-30、 P-60和P-100)以及对于本领域技术人员来说是已知的其它树脂。
[0038] 在一个实施方案中，本发明的方法还包括在外源NHS存在的情况下包括一个或多 个（例如，一、二或三个）保持步骤（S卩，将外源NHS添加至保持步骤），以将不稳定地结合的 接头从细胞结合剂释放。保持步骤包括在用双官能交联试剂修饰细胞结合剂后，在将细胞 毒素剂缀合于具有连接于其的接头的细胞结合剂后，和/或在纯化步骤之后保持混合物。
[0039] 保持步骤包括将溶液维持在适当的温度（例如，约2°C至约37°C )进行适当的时 期（例如，约1小时至约1周）以从细胞结合剂释放不稳定结合的接头，同时大体上不从细 胞结合剂释放稳定结合的接头。在一个实施方案中，保持步骤包括将溶液维持在低温（例 如，约2°C至约10°C或约4°C )、室温（例如，约20°C至约30°C或约20°C至约25°C )或升高 的温度（例如，约30°C至约37°C )。
[0040] 保持步骤的持续时间取决于进行维持步骤时的温度。例如，保持步骤的持续时间 可通过在升高的温度上进行保持步骤来显著减少，最大温度受限于细胞结合剂-细胞毒素 剂缀合物的稳定性。保持步骤可包括维持溶液约1小时至约1天（例如，约1小时、约2小 时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约 12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时或约24小时），约5小时 至约1周，约12小时至约1周（例如，约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约2 天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天），进行约12小时至约1周（例如，约12小时、 约16小时、约20小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天）或约 1天至约1周。
[0041] 在一个实施方案中，保持步骤包括将溶液维持在约2°C至约8°C的温度，进行至少 约12小时直至1天的时间。
[0042] 用于保持步骤的pH值优选为约4至约9 (例如，约4. 5至约8. 5或约5至约8)。 在一个实施方案中，用于保持步骤的pH值从约5变化至约7. 5 (例如，约5. 5至约7. 5、约6 至约7. 5、约6. 5至约7. 5、约7至约7. 5、约5至约7、约5至约6. 5、约5至约5. 5、约5. 5 至约7、约6至约6. 5或约6至约7)。例如，用于保持步骤的pH值可以为约4、约4. 5、约5、 约5. 5、约6、约6. 5、约7、约7. 5、约8、约8. 5或约9。
[0043] 可在将细胞结合剂缀合于细胞毒素剂之前或之后进行保持步骤。在一个实施方案 中，在用双官能交联试剂修饰细胞结合剂之后直接进行保持步骤。例如，本发明的方法包括 在用双官能交联试剂修饰细胞结合剂之后并且在缀合之前进行保持步骤。在修饰细胞结合 剂后，可在保持步骤之前和/或保持步骤之后，但在缀合步骤之前进行纯化。在另一个实施 方案中，在将细胞毒素剂缀合于具有连接于其的细胞结合剂之后并且在纯化步骤之前直接 进行保持步骤。在另一个实施方案中，在缀合和纯化步骤之前进行保持步骤，随后进行另外 的纯化步骤。
[0044] 在具体实施方案中，保持步骤可包括在约2°C至约室温在于约5-7. 5或约6. 5-7. 5 的pH下温育混合物约1小时至约1周。
[0045] 本发明提供了用于制备包含化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的稳定缀合 物的组合物的方法，其中所述组合物大体上不含不稳定的缀合物。在这方面，本发明提供了 用于制备具有显著高的纯度和稳定性的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的方法。由缀合物 的高纯度和稳定性，这样的组合物可用于治疗疾病。包含化学地偶联于细胞毒素剂例如类 美登素的细胞结合剂例如抗体的组合物描述于例如美国专利7, 374, 762和美国专利申请 公布No. 2007/0031402中。在本发明的一个方面，具有显著地高的纯度的细胞结合剂-细 胞毒素剂缀合物下列特征的一个或多个特征：（a)大于约90% (例如，大于或等于约91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)，优选大于约95%的缀合物种类是 单体的，（b)缀合物制剂中未缀合接头水平低于约10% (例如，少于或等于约9%、8%、7%、 6<%、5<%、4<%、3 <%、2(%、1(%或0(%)(相对于总的接头）、（(3)少于10 (%的缀合物种类被交 联（例如，少于或等于约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%)，（(1)缀合物制 剂中的游离细胞毒素剂水平少于约2% (例如，少于或等于约1. 9%、1. 8%、1. 7%、1. 6%、 1. 5 %U. 4 %U. 3 %U. 2 %U. 1 %>1. Ο %>0. 9 %,0. 8 %,0. 7 %,0. 6 %,0. 5 %,0. 4 %, 0. 3%、0. 2%、0. 1%或0% )(相对于总的细胞毒素剂），和/或（e)贮存后（例如，在约1 周、约2周、约3周、约1月、约2月、约3月、约4月、约5月、约6月、约1年、约2年或约5 年后）游离细胞毒素剂水无显著升高。游离细胞毒素剂水平的"显著升高"意指在一定的 贮存时间后，游离细胞毒素剂的水平的升高少于约〇. 1 %、约〇. 2%、约0. 3%、约0. 4%、约 0. 5%、约 0. 6%、约 0. 7%、约 0. 8%、约 0. 9%、约 1. 0%、约 1. 1 %、约 1. 2%、约 1. 3%、约 1. 4%、约 1. 5%、约 1. 6%、约 1. 7%、约 1. 8%、约 1. 9%、约 2. 0%、约 2. 2%、约 2. 5%、约 2. 7%、约 3. 0%、约 3. 2%、约 3. 5%、约 3. 7%或约 4. 0%。
[0046] 如本文中所用，术语"未缀合的接头"是指与双官能交联试剂共价连接的细胞结合 齐U，其中细胞结合剂未通过双官能交联试剂的接头共价地偶联于细胞毒素剂（即，"未缀合 的接头"可由CBA-L表示，其中CBA表示细胞结合剂并且L表示双官能交联试剂。相反地， 细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物可由CBA-L-D表示，其中D表示细胞毒素剂）。
[0047] 在一个实施方案中，细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物中的细胞毒素剂对细胞结合 剂的平均摩尔比为约1至约10、约2至约7、约3至约5、约2. 5至约4. 5 (例如，约2. 5、约 2. 6、约 2. 7、约 2. 8、约 2. 9、约 3. 0、约 3. 1、约 3. 3、约 3. 4、约 3. 5、约 3. 6、约 3. 7、约 3. 8、约 3. 9、约 4. 0、约 4. 1、约 4. 2、约 4. 3、约 4. 4、约 4. 5)、约 3. 0 至约 4. 0、约 3. 2 至约 4. 2、约 4. 5 对 5. 5 (例如，约 4. 5、约 4. 6、约 4. 7、约 4. 8、约 4. 9、约 5. 0、约 5. 1、约 5. 2、约 5. 3、约 5. 4、 约 5. 5)。
[0048] 细胞结合剂可以是结合细胞，通常且优选地动物细胞（例如，人细胞）的任何适当 的试剂。细胞结合剂优选为肽或多肽。适当的细胞结合剂包括例如抗体（例如，单克隆抗 体及其片段）、干扰素（例如，-〇、-0、-^)、淋巴因子（例如，白细胞介素2(11^-2)，白细 胞介素3 (IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6 (IL-6)、激素（例如，胰岛素、TRH(促 甲状腺激素释放激素）、MSH(黑素细胞刺激素）、类固醇激素，例如雄激素类和雌激素类）、 生长因子和集落刺激因子，例如表皮生长因子（EGF)、转化生长因子α (TGF-α)、成纤维细 胞生长因子（FGF)、血管内皮生长因子（VEGF)、集落刺激因子（CSF)，例如G-CSF，M-CSF和 GM_CSF(Burgess, Immunology Today 5:155-158(1984))、营养物转运分子（例如，转铁蛋 白）、维生素（例如，叶酸）以及特异性结合细胞表面上的靶分子的任何其它试剂或分子。 [0049] 当细胞结合剂是抗体时，其结合抗原，所述抗原是多肽和可以是跨膜分子（例如 受体）或配体例如生长因子。示例性抗原包括分子例如肾素；生长激素，包括人生长激素 和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋 白酶；胰岛素 Α-链；胰岛素 Β-链；胰岛素原；滤泡刺激激素；降钙素；促黄体激素；胰高血 糖素；凝血因子例如因子vmc、因子IX、组织因子（TF)和von Willebrands因子；抗-凝血 因子例如蛋白C ;心钠素；肺表面活性剂；血纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人悄或组织类 型血纤溶酶原激活物（t-PA);铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β ; 脑啡肽酶；RANTES(在激活上受调节的，通常Τ-细胞表达和分泌的）；人巨噬细胞炎性蛋 白（MIP-1-α);血清白蛋白，例如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素 Α-链； 松弛素 B-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白，例如β-内酰胺酶；DNA酶； IgE ;细胞毒素 Τ淋巴细胞相关抗原（CTLA)，例如CTLA-4 ;抑制素；活化素；血管内皮生长 因子（VEGF);激素或生长因子的受体；蛋白A或D ;类风湿因子；神经营养因子例如骨来 源的神经营养因子（BDNF)，神经营养因子-3、-4、-5或-6 (NT-3、NT4、NT-5或NT-6)或神 经生长因子例如NGF-β ;血小板衍生生长因子（PDGF);成纤维细胞生长因子例如aFGF和 bFGF;表皮生长因子（EGF);转化生长因子（TGF)例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-βΙ、 TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4 或 TGF-β 5 ;胰岛素-样生长因子-I 和-II (IGF-I 和 IGF-II); des (l-3)-IGF-I (脑 IGF-I)、胰岛素-样生长因子结合蛋白、EpCAM、⑶3、FLT3、PSMA、PSCA、 MUC1、MUC16、STEAP、CEA、TENB2、EphA 受体、EphB 受体、叶酸受体、F0LR1、间皮素、cripto、 α νβ 6、整联蛋白、VEGF、VEGFR、EGFR、转铁蛋白受体、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5 ; CD 蛋白例如 CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD 11、CD 14、CD 19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、 CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80. CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CD152 或美国专利申请公布 No. 2008/0171040 或 美国专利申请公布No. 2008/0305044(将所述美国专利申请公布通过引用整体并入本文） 中公开的结合一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体的抗体；红细胞生成素；骨诱导因 子；免疫毒素；骨形态发生蛋白（BMP);干扰素，例如干扰素-α、-β和-γ ;集落刺激因子 (CSF)，例如，M-CSF，GM-CSF和G-CSF ;白细胞介素（IL)，例如，IL-1至IL-10 ;超氧化物歧 化酶；Τ-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原例如，HIV包膜的部分；转运蛋 白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白例如⑶11a、⑶lib、⑶11c、⑶18、ICAM、VLA-4 和VCAM ;肿瘤相关抗原例如HER2、HER3或HER4受体；内皮因子、c-Met、lGFlR、PSGR、NGEP、 PSMA、PSCA、LGR5、B7H4以及上文列出的多肽的任一种的片段。
[0050] 此外，结合骨髓细胞的GM-CSF可用作针对来自急性髓性白血病的患病细胞的细 胞结合剂。结合活化的T细胞的IL-2可用于移植排斥的预防，用于移植物抗宿主病的治疗 和预防，和用于急性T细胞白血病的治疗。结合黑色素细胞的MSH可用于治疗黑色素瘤，正 如针对黑色素瘤的抗体可用于治疗黑色素瘤一样。叶酸可用于靶向卵巢和其它肿瘤上表达 的叶酸受体。表皮生长因子可用于靶向鳞癌例如肺以及头颈癌。生长抑素可用于靶向神经 母细胞瘤和其它肿瘤类型。.
[0051] 乳腺和睾丸的癌症可分别被作为细胞结合剂的雌激素（或雌激素类似物）或雄激 素（或雄激素类似物）成功靶向。
[0052] 如本文中所用，术语"抗体"是指任何免疫球蛋白、任何免疫球蛋白片段例如 Fab、Fab'、F(ab'）2、dsFv、sFv、微型抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、纳米抗体、蛋 白水解激活抗体、结构域抗体、单链抗体等（Parham, J. Immunol. 131:2895-2902(1983); Spring 等人，J.Immunol.113:470-478 (1974) ；Nisonoff 等人,Arch. Biochem. Biophys.89:230-244(1960) ;Kim 等人，Mol. Cancer Ther·，7:2486-2497(2008); Carter, Nature Revs. ,6:343-357(2006))或免疫球蛋白嵌合体，其可结合细胞表面上的抗 原（例如，其包含互补决定区（CDR))。任何适当的抗体可用作细胞结合剂。本领域技术人 员将理解适当的抗体的选择将取决于待被靶向的细胞群体。在这一点上，在特定细胞群体 (通常地且优选地患病细胞群体）中选择性表达的细胞表面分子（即，抗原）的类型和数目 将决定用于本发明的组合物的适当的抗体的选择。细胞表面表达特征谱对于多种细胞类型 包括肿瘤细胞类型是已知的，或如果未知时，可使用常规分子生物学和组织化学技术来测 定。抗体可以是双特异性抗体（Morrison，SL, Nature biotechnology, 25 (11) :1233 - 4 (20 07))。
[0053] 抗体可以是多克隆的或单克隆的，但最优选是单克隆抗体。如本文中所用，"多克 隆"抗体是指通常包含在被免疫的动物的血清中的抗体分子的异质群体。"单克隆"抗体是 指对于特定抗原是特异性的抗体分子的同质群体。单克隆抗体通常由单个克隆的B淋巴细 胞（"B细胞"）产生。单克隆抗体可使用本领域技术人员已知的多种技术来获得，包括标准 杂交瘤技术（参见，例如，Kdhler 和 Milstein, Eur. J. Immunol. , 5:511-519 (1976) ；Harlow 和 Lane (编辑），Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988);和 C. A. Janeway 等 人（编辑），Immunobiology,第 5 版，Garland Publishing，New York，NY(2001))。简而言 之，产生单克隆抗体的杂交瘤法通常包括利用抗原（即，"免疫原"）注射任何适当的动物， 通常且优选地小鼠。随后杀死动物，将从其脾分离的B细胞与人骨髓瘤细胞融合。产生杂交 细胞（即，"杂交瘤")，其可无限增殖并在体外连续分泌高滴度的具有期望的特异性的抗体。 本领域已知的任何适当方法可用于鉴定产生具有期望的特异性的抗体的杂交瘤细胞。这样 的方法包括例如酶联免疫吸附测定（ELISA)、Western印迹分析和放射免疫测定。筛选杂 交瘤的群体以分离单个克隆，所述克隆的每一个分泌针对抗原的单一抗体种类。因为每一 个杂交瘤是来源于与单个B细胞融合的克隆，因此其产生的所有抗体分子在结构上包括它 们的抗原结合部位和同种型是相同的。单克隆抗体还可使用其它适当的技术包括EBV-杂 交瘤技术（参见，例如，Haskard 和 Archer, J. Immunol. Methods, 74 (2) : 361-67 (1984)，和 Roder等人，Methods Enzymol.，121:140-67 (1986))、噬菌体载体表达系统（参见，例如， Huse等人，Science, 246:1275-81 (1989))或包含抗体片段例如Fab和scFv (单链可变区） 的噬菌体展示文库（参见，例如，美国专利5, 885, 793和5, 969, 108以及国际专利申请公布 No. W0 92/01047 和 W0 99/06587)来产生。
[0054] 单克隆抗体可从任何适当的动物分离或可在其中产生，但优选在哺乳动物，更优 选小鼠或人，最优选人中产生。用于在小鼠中产生抗体的方法对于本领域技术人员来说 是公知的并且在本文中进行了描述。关于人抗体，本领域技术人员将理解多克隆抗体可 从利用适当的抗原接种或免疫的人受试者的血清分离。或者，人抗体可通过采用用于在 非人动物例如小鼠中产生人抗体的已知技术来产生（参见，例如，美国专利5, 545, 806 ; 5, 569, 825 ;和 5, 714, 352 以及美国专利申请公布 No. 2002/0197266 A1)。
[0055] 虽然是人的治疗应用的理想选择，但人抗体，特别地人单克隆抗体，通常比小鼠单 克隆抗体更难产生。然而，小鼠单克隆抗体，当给人施用时，诱导快速宿主抗体反应，这可减 小抗体-细胞毒素剂缀合物的治疗或诊断潜能。为了克服这些并发症，单克隆抗体优选地 不被人免疫系统识别为"外来的"。
[0056] 为此目的，噬菌体展示可用于产生抗体。在这一点上，编码抗体的抗原结合可 变（V)结构域的噬菌体文库可使用标准分子生物学和重组DNA技术来产生（参见，例如， Sambrook 等人（编辑），Molecular Cloning, A LaboratoryManual,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(2001))。选择编码具有期望的特异性的可变区的噬 菌体的对期望的抗原的特异性结合，重建包含选择的可变结构域的完全人抗体。将编码重 建抗体的核酸序列引入适当的细胞系，例如用于杂交瘤产生的骨髓瘤细胞，以便具有单克 隆抗体的特征的人抗体由细胞分泌（参见，例如，Janeway等人，同上，Huse等人，同上， 和美国专利6, 265, 150)。或者，可从对于特定人重链和轻链免疫球蛋白基因是转基因的小 鼠产生单克隆抗体。这样的方法在本领域是已知的并且描述于例如美国专利5, 545, 806和 5, 569, 825以及Janeway等人（同上）中。
[0057] 最优选地，抗体是人源化抗体。如本文中所用，"人源化"抗体是其中将形成抗 体的抗原结合环的小鼠单克隆抗体的互补决定区（CDR)移植至人抗体分子的构架上的抗 体。归因于小鼠与人抗体的构架的相似性，通常在本领域接受：该方法产生在抗原性上 与人抗体相同但结合与CDR所源自的小鼠单克隆抗体结合的抗原相同的抗原的单克隆抗 体。用于产生人源化抗体的方法在本领域是公知的并且详细地描述于例如Janeway等人 (同上）、美国专利5, 225, 539、5, 585, 089和5, 693, 761、欧洲专利0239400 B1以及英国 专利2188638中。人源化抗体还可使用美国专利5, 639, 641和Pedersen等人，J. Mol. Biol. ,235:959-973(1994)中描述的抗体表面再建技术来产生。虽然本发明组合物的缀合 物中使用的抗体最优选为人源化单克隆抗体，但如上所述的人单克隆抗体和小鼠单克隆抗 体也在本发明的范围内。
[0058] 具有至少一个抗原结合部位，从而识别并结合至少一个存在于靶细胞表面上的抗 原或受体的抗体片段也在本发明的苦海无边内。在这方面，完整抗体分子的蛋白质水解切 割可产生保留识别并结合抗原的能力的许多抗体片段。例如，利用蛋白酶木瓜蛋白酶对抗 体分子的有限消化通常产生三个片段，所述片段中的两个片段相同并且被称为Fab片段， 因为它们保留亲代抗体分子的抗原结合活性。利用酶胃蛋白酶对抗体分子的切割通常产 生两个抗体片段，所述片段中的一个保留抗体分子的两个抗原结合臂，从而被称为F(ab'） 2 片段。利用二硫苏糖醇或巯基乙胺对F(ab'）2片段的还原产生称为Fab'片段的片段。单 链可变区片段（sFv)抗体片段（其由包含通过合成肽连接于抗体轻链的V结构域的抗体重 链的可变（V)结构域的截断的Fab片段组成）可使用常规重组DNA技术学技术（参见，例 如，Janeway等人，同上）来产生。类似地，二硫化物稳定的可变区片段（dsFv)可通过重组 DNA 技术来制备（参见，例如，Reiter 等人，Protein Engineering, 7:697-704(1994))。然 而，本发明的背景中的抗体片段不限于抗体片段的这些示例性类型。可使用识别并结合期 望的细胞表面受体或抗原的任何适当的抗体片段。抗体片段进一步描述于例如Parham, J. Immunol. ,131:2895-2902(1983) ;Spring 等人，J.Immunol. ,113:470-478(1974);和 Nisonoff 等人，Arch. Biochem. Biophys.，89:230-244 (1960)中。抗体-抗原结合可使用本 领域已知的任何适当的方法来测定，所述方法是例如放射免疫测定（RIA)、ELISA、Western 印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定（参见，例如，Janeway等人，同上，和美国专利申请公布 No. 2002/0197266A1)。
[0059] 此外，抗体可以是嵌合抗体或其抗原结合片段。关于"嵌合"，其意指抗体包含至 少两个获自或来源于至少两个不同物种的免疫球蛋白或其片段（例如，两种不同免疫球蛋 白，例如与鼠免疫球蛋白可变区组合的人免疫球蛋白恒定区）。抗体还可以是结构域抗体 (dAb)或其抗原结合片段，例如，胳骑抗体（参见，例如，Desmyter等人，似1：11^31:；1〇1(31:· Biol.，3:752，（1996))或藍鱼抗体，例如，新的抗原受体（IgNAR)(参见，例如，Greenberg等 人，Nature, 374:168 (1995)和 Stanfield 等人，Science, 305:1770-1773 (2004))。
[0060] 任何适当的抗体可用于本发明的背景。例如，单克隆抗体J5是对于 常见急性淋巴细胞白血病抗原（CALLA)是特异性的鼠 IgG2a抗体（Ritz等 人，Nature, 283:583-585(1980))，并且可用于靶向表达CALLA的细胞（例如，急性淋巴母 细胞白血病细胞）。单克隆抗体MY9是特异性结合CD33抗原的鼠 IgGl抗体（Griffin等 人，Leukemia Res.，8:521 (1984))，并且可用于靶向表达CD33的细胞（例如，急性髓性白血 病（AML)细胞）。
[0061] 类似地，单克隆抗体抗-B4(也称为M)是结合B细胞上的⑶19抗原的鼠 IgGl抗 体（Nadler等人，J. Immunol.，131:244-250 (1983))，并且可用于靶向B细胞或表达CD19的 患病细胞（例如，非何杰金氏淋巴瘤细胞和慢性淋巴母细胞白血病细胞）。N901是结合在 神经内分泌来源包括小细胞肺肿瘤的细胞上发现的CD56(神经细胞粘附分子）抗原的鼠单 克隆抗体，其可在缀合物中用于将将药物靶向神经内分泌来源的细胞。优选在J5、MY9和B4 抗体用作缀合物的部分之前将其进行表面再建或人源化。抗体的表面再建或人源化描述于 例如 Roguska 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:969-73 (1994)中。
[0062] 此外，单克隆抗体C242结合CanAg抗原（参见，例如，美国专利5, 552, 293)，并 且可用于将缀合物靶向表达CanAg的肿瘤例如结直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和胃癌。 此〇242是单克隆抗体0242的人源化形式（参见，例如，美国专利5,552,293)。将!11^242 所产生自的杂交瘤以ECACC标识号90012601保藏。HuC242可使用CDR-移植法（参见，例 如，美国专利5, 585, 089、5, 693, 761和5, 693, 762)或表面再建技术（参见，例如，美国专利 5,639,641)来制备。HuC242可用于将缀合物靶向表达CanAg抗原的肿瘤细胞，例如结直肠 癌细胞、胰腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞和胃癌细胞。
[0063] 为了靶向卵巢癌和前列腺癌细胞，可将抗-MUC1抗体用作缀合物中的细胞 结合剂。抗-MUC1抗体包括例如抗-HMFG-2 (参见，例如，Taylor-Papadimitriou等 人，Int.J. Cancer, 28:17-21 (1981))、hCTMOl (参见，例如，van Hof 等人，Cancer Res.，56:5179-5185(1996))和DS6。前列腺癌细胞还可通过使用抗-前列腺-特异性膜 抗原（PSMA)作为细胞结合剂例如J591，利用缀合物来靶向（参见，例如，Liu等人，Cancer Res.，57:3629-3634 (1997))。此外，表达Her2抗原的癌细胞例如乳腺癌和卵巢癌可使用抗 体曲妥珠单抗来靶向。结合胰岛素样生长因子受体的抗-IGF-IR抗体还可用于缀合物。结 合 CD27L、EGFRvIII、Cripto、CD138、CD38、EphA2、整联蛋白、CD37、叶酸受体和 Her3 的抗体 还可用于缀合物。
[0064] 在一个实施方案中，抗体选自huN901、huMy9_6、huB4、huC242、曲妥珠单抗、比伐 单抗、西罗珠单抗、利妥昔单抗、huDS6、国际专利申请公布No. W0 2010/124797中描述的 抗-间皮素抗体（例如MF-T)、美国专利申请公布No. 2010/0093980中描述的抗-cripto 抗体（例如huB3F6)、美国专利申请公布No. 2007/0183971中描述的抗-CD138抗体（例如 huB-B4)、美国专利No. 7, 736, 644和7, 628, 986以及美国专利申请公布No. 2010/0111979 ; 2009/0240038 ;2009/0175887 ;2009/0156790 和 2009/0155282 中描述的抗-EGFRvIII 抗 体、国际专利申请公布No. W0/2011/039721和W0/2011/039724中描述的人源化EphA2抗体 (例如2H11R35R74)、国际专利申请公布No. W0 2008/047242中描述的抗-CD38抗体（例如 hu38SB19)、美国临时申请No. 61/307, 797、61/346, 595和61/413, 172以及美国专利申请公 布No. 2012/0009181中描述的抗-叶酸受体抗体（例如，huMovl9);美国专利5, 958, 872 和6, 596, 743中描述的抗-IGF1R抗体；美国专利申请公布No. 2011/0256153中描述的 抗4037抗体（例如，1111〇)37-3);美国专利申请公布此.2006/0127407中描述的抗-整联蛋 白α νβ6抗体（例如，CNT095);和国际专利申请公布No.WO 2012/019024中描述的抗-Her3 抗体。特别优选的抗体是本文中描述的人源化单克隆抗体。
[0065] 虽然细胞结合剂优选为抗体，但细胞结合剂还可以是非抗体分子。适 当的非抗体分子包括例如，锚蛋白重复蛋白（DARPins ;Zahnd等人，J. Biol. Chem·，281，46,35167-35175,（2006) ;Binz 等人，Nature Biotechnology, 23:1257-126 8 (2005))或锚蛋白样重复蛋白或例如美国专利申请公布No. 2007/0238667 ;美国专利 7, 101，675 ;以及国际专利申请公布No. TO/2007/147213和TO/2007/062466)中描述的 合成肽、干扰素（例如，-α、-β或-γ干扰素）、淋巴因子（例如，白细胞介素2(IL-2)、 IL-3、IL-4或IL-6)、激素（例如，胰岛素）、生长因子（例如，EGF、TGF- a、FGF和 VEGF)、集落刺激因子（例如，G-CSF、M-CSF 和 GM-CSF(参见，例如，Burgess, Immunology Today, 5:155-158 (1984))、生长抑素和转铁蛋白（参见，例如，0' Keefe等人，181〇1· Chem.，260:932-937(1985))。例如，GM-CSF，其结合髓系细胞，可用作细胞结合剂来靶向急 性髓性白细胞。此外，IL-2,其结合活化的T-细胞，可用于预防移植排斥，用于治疗或预防 移植物抗宿主病，和用于治疗急性T细胞白血病。表皮生长因子（EGF)可用于靶向鳞癌例 如肺癌和头颈癌。生长抑素可用于靶向神经母细胞瘤细胞和其它肿瘤细胞类型。
[0066] 缀合物可包含任何适当的细胞毒素剂。如本文中所用，"细胞毒素剂"是指导致细 胞死亡、诱导细胞死亡或减小细胞活力的任何化合物。适当的细胞毒素剂包括例如类美登 素和类美登素类似物、紫杉烷、CC-1065和CC-1065类似物以及多拉司他汀及多拉司他汀 类似物。在本发明的优选实施方案中，细胞毒素剂为类美登素，包括美登醇和美登醇类似 物。类美登素是抑制微管形成并且对哺乳动物细胞具有高度毒性的化合物。适当的美登醇 类似物的实例包括具有修饰芳香环的美登醇类似物和在其它位置具有修饰的美登醇类似 物。这样的类美登素描述于例如美国专利4, 256, 746 ;4, 294, 757 ;4, 307, 016 ;4, 313, 946 ; 4, 315, 929 ；4, 322, 348 ；4, 331, 598 ；4, 361, 650 ；4, 362, 663 ；4, 364, 866 ；4, 424, 219 ； 4, 371, 533 ;4, 450, 254 ;5, 475, 092 ;5, 585, 499 ;5, 846, 545 和 6, 333, 410 中。
[0067] 具有修饰芳环的美登醇类似物的实例包括：（1)C-19-脱氯（美国专利4, 256, 746) (通过安丝菌素 P2的LAH还原制备的）、（2) C-20-羟基（或C-20-去甲基）+/-C-19-脱 氯（美国专利4, 361，650和4, 307, 016)(通过使用链霉菌属（Streptomyces)或放线菌 属（Actinomyces)的去甲基作用或使用LAH的脱氯作用制备的）和（3)C-20-去甲氧基、 C-20-酰氧基（-0C0R)、+/-脱氯（美国专利4, 294, 757)(通过使用酰氯的酰化作用制备 的）。
[0068] 具有除芳环外的位置的修饰的美登醇类似物的实例包括：（l)C-9-SH(美国专 利4, 424, 219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应制备的）、（2)C-14-烷氧甲基（脱甲氧 基/01 201〇(美国专利4,331，598)、（3)(：-14-羟甲基或酰氧甲基（0120!1或01 2^)(美国 专利4,450,254)(从诺卡尔菌属（此(^"1幻制备的）、（4)(：-15-羟基/酰氧基（美国 专利4, 364, 866)(通过链霉菌属对美登醇的转化制备的）、（5)C-15-甲氧基（美国专利 4, 313, 946和4, 315, 929)(从滑桃树分离的）、（6)C-18-N-去甲基（美国专利4, 362, 663 和4, 322, 348)(通过链霉菌属对美登醇的去甲基作用制备的）和（7) 4, 5-脱氧（美国专利 4, 371，533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原制备的）。
[0069] 在本发明的优选实施方案中，缀合物利用含硫醇基类美登素 DM1 (也称为N2'-去乙 酰基-N2 -(3-巯基-1-氧戊基）-美坦辛作为细胞毒素剂。DM1的结构由式（I)表不：
[0070]
【权利要求】
1. 一种用于制备具有连接于其的接头的细胞结合剂的方法，所述方法包括在外源 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)存在的情况下将细胞结合剂与双官能交联试剂接触以将接头共 价地连接于所述细胞结合剂，从而制备包含具有连接于其的接头的细胞结合剂的混合物。
2. -种用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合 剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括： (a) 将细胞结合剂与双官能交联试剂接触以将接头共价地连接于所述细胞结合剂，从 而制备包含具有连接于其的接头的细胞结合剂的第一混合物， (b) 将所述第一混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱 或其组合，从而制备具有连接于其的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合物， (c) 通过将具有连接于其的接头的细胞结合剂与细胞毒素剂反应来将细胞毒素剂缀合 于所述纯化的第一混合物中的具有连接于其的接头的细胞结合剂，从而制备包含（i)含有 通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、（ii) 游离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混合物，和 (d) 将第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其 组合以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述第二混合物的其它组分纯化出来，从 而制备所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物， 其中在步骤（a)期间或之后以及在步骤（c)之前添加外源N-羟基琥珀酰亚胺。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下进行步骤 (a)中的接触。
4. 根据权利要求2所述的方法，其还包括在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下在步 骤（a)之后保持所述第一混合物。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的溶液进行所述保 持。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述pH为约5. 0至约8. 0。
7. 根据权利要求2所述的方法，其中在步骤（b)中添加外源N-羟基琥珀酰亚胺。
8. 根据权利要求2所述的方法，其还包括在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下在步 骤（b)之后保持所述纯化的第一混合物。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的溶液中进行所述保 持。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述pH为约5. 0至约8. 0。
11. 根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中在步骤（b)和（d)中使用切向流 过滤。
12. 根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中在步骤（b)和（d)中使用吸附色 谱。
13. 根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中在步骤（b)中使用吸附色谱以及 在步骤（d)中使用切向流过滤。
14. 根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中在步骤（b)和（d)中使用非吸附 色谱。
15. 根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中在步骤（b)中使用切向流过滤以 及在步骤（d)中使用吸附色谱。
16. 根据权利要求2至15中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的溶 液中进行步骤（a)中的接触。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述pH为约6. 0至约8. 0。
18. 根据权利要求16所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
19. 根据权利要求2至18中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的溶 液中进行步骤（c)中的缀合。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述pH为约5. 0至约8. 0。
21. 根据权利要求19所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
22. -种用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合 剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括： (a) 将细胞结合剂与双官能交联试剂接触以将接头共价连接于细胞结合剂，从而制备 包含具有连接于其的接头的细胞结合剂的第一混合物， (b) 通过将具有连接于其的接头的细胞结合剂与细胞毒素剂反应来将细胞毒素剂缀合 于所述第一混合物中的具有连接于其的接头的细胞结合剂，从而制备包含（i)含有通过接 头偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、（ii)游离细胞毒素 剂和（iii)反应副产物的第二混合物，和 (c) 将所述第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱 或其组合，以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述第二混合物的其它组分纯化出 来，从而制备所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物， 其中在步骤（a)的过程中或之后和在步骤（b)之前添加所述外源N-羟基琥珀酰亚胺。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下进行步 骤（a)中的接触。
24. 根据权利要求22所述的方法，其还包括在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下在 步骤（a)后保持所述第一混合物。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的溶液中进行所述 保持。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述pH为约6. 0至约8. 0。
27. 根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中在步骤（c)中使用切向流过滤。
28. 根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中在步骤（c)中使用吸附色谱。
29. 根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中在步骤（c)中使用非吸附色谱。
30. 根据权利要求22至29中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的 溶液中进行步骤（a)中的接触。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述pH为约6. 0至约8. 0。
32. 根据权利要求30所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
33. 根据权利要求22至32中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的 溶液中进行步骤（b)中的缀合。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述pH为约5. 0至约8. 0。
35. 根据权利要求33所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
36. -种用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合 剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括： (a) 将细胞结合剂与包含化学地偶联于接头的细胞毒素剂的细胞毒素剂-接头化合物 接触，以将细胞毒素剂-接头化合物共价地偶联于所述细胞结合剂，从而制备包含含有通 过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的 混合物，和 (b) 将包含所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的混合物经历切向流过滤、选择性沉 淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以纯化所述缀合物，其中在步骤（a)的过程 中或之后和在步骤（b)之前添加外源N-羟基琥珀酰亚胺。
37. 根据权利要求36所述的方法，其中在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下进行步 骤（a)中的接触。
38. 根据权利要求36所述的方法，其还包括在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下在 步骤（a)后保持所述混合物。
39. 根据权利要求38所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的溶液中进行所述 保持。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述pH为约6. 0至约8. 0。
41. 根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中通过将细胞毒素剂与包含接头的 双官能交联试剂接触以将所述细胞毒素剂共价地连接于所述接头来制备细胞毒素剂-接 头化合物，并从而制备包含所述细胞毒素剂-接头化合物的混合物。
42. 根据权利要求36至41中任一项所述的方法，其中在与所述细胞结合剂接触之前纯 化所述细胞毒素剂-接头化合物。
43. 根据权利要求36至41中任一项所述的方法，其中在与细胞结合剂接触之前不纯化 所述细胞毒素剂-接头化合物。
44. 根据权利要求36至43中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的 溶液中进行步骤（a)中的接触。
45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述pH为约6. 0至约8. 0。
46. 根据权利要求44所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
47. -种用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合 剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括： (a) 将细胞结合剂与双官能交联试剂接触以将接头共价地连接于所述细胞结合剂，从 而制备包含具有连接于其的接头的细胞结合剂的第一混合物， (b) 将所述第一混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱 或其组合，从而制备具有连接于其的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合物， (c) 通过将所述具有连接于其的接头的细胞结合剂与细胞毒素剂在外源N-羟基琥珀 酰亚胺存在的情况下反应，来将细胞毒素剂缀合于所述纯化的第一混合物中的具有连接于 其的接头的细胞结合剂，从而制备包含（i)含有通过接头偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂 的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、（ii)游离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混合 物，和 (d) 将所述第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱 或其组合以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述第二混合物的其它组分纯化出 来，从而制备细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中在步骤（b)和（d)中使用切向流过滤。
49. 根据权利要求47所述的方法，其中在步骤（b)和（d)中使用吸附色谱。
50. 根据权利要求47所述的方法，其中在步骤（b)和（d)中使用非吸附色谱。
51. 根据权利要求47所述的方法，其中在步骤（b)中使用吸附色谱以及在步骤（d)中 使用切向流过滤。
52. 根据权利要求47所述的方法，其中在步骤（b)中使用切向流过滤以及在步骤（d) 中使用吸附色谱。
53. 根据权利要求47至52中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的 溶液中进行步骤（a)中的接触。
54. 根据权利要求53所述的方法，其中所述pH为约6. 0至约8. 0。
55. 根据权利要求53所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
56. 根据权利要求47至55中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的 溶液中进行步骤（c)中的缀合。
57. 根据权利要求56所述的方法，其中所述pH为约5. 0至约8. 0。
58. 根据权利要求56所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
59. -种用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合 剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括： (a) 将细胞结合剂与双官能交联试剂接触以将接头共价地连接于所述细胞结合剂，从 而制备包含具有连接于其的接头的细胞结合剂的第一混合物， (b) 通过将具有连接于其的接头的细胞结合剂与细胞毒素剂在外源N-羟基琥珀酰亚 胺存在的情况下反应，来将细胞毒素剂缀合于所述第一混合物中的所述具有连接于其的接 头的细胞结合剂，从而制备包含（i)含有通过所述接头化学地偶联于所述细胞毒素剂的细 胞结合剂的所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、（ii)游离细胞毒素剂和（iii)反应副产 物的第二混合物，和 (c) 将所述第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱 或其组合以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述第二混合物的其它组分纯化出 来，从而制备所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物。
60. 根据权利要求59所述的方法，其中在步骤（c)中使用切向流过滤。
61. 根据权利要求59所述的方法，其中在步骤（c)中使用吸附色谱。
62. 根据权利要求59所述的方法，其中在步骤（c)中使用非吸附色谱。
63. 根据权利要求59至62中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的 溶液中进行步骤（a)中的接触。
64. 根据权利要求63所述的方法，其中所述pH为约6. 0至约8. 0。
65. 根据权利要求63所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
66. 根据权利要求59至65中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的 溶液中进行步骤（c)中的缀合。
67. 根据权利要求66所述的方法，其中所述pH为约5. 0至约8. 0。
68. 根据权利要求66所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
69. -种用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合 剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括： (a) 将细胞结合剂与双官能交联试剂接触以将接头共价地连接于所述细胞结合剂，从 而制备包含具有连接于其的接头的细胞结合剂的第一混合物， (b) 将所述第一混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱 或其组合，从而制备具有连接于其的接头的细胞结合剂的纯化的第一混合物， (c) 通过将所述具有连接于其的接头的细胞结合剂与细胞毒素剂反应,来将细胞毒素 剂缀合于所述纯化的第一混合物中的所述具有连接于其的接头的细胞结合剂，从而制备包 含（i)含有通过所述接头化学地偶联于所述细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞 毒素剂缀合物、（ii)游离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混合物， (d) 在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下温育所述第二混合物；和 (e) 在步骤（d)之后将所述第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸 附过滤、吸附色谱或其组合，以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述第二混合物 的其它组分纯化出来，从而制备通过所述接头化学地偶联于所述细胞毒素剂的细胞结合剂 的纯化的第二混合物。
70. 根据权利要求69所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH溶液中进行步骤 (d)中的温育。
71. 根据权利要求70所述的方法，其中所述pH为约5. 0至约8. 0。
72. 根据权利要求70所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
73. 根据权利要求69至72中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的 溶液中进行步骤（a)中的接触。
74. 根据权利要求73所述的方法，其中所述pH为约6. 0至约8. 0。
75. 根据权利要求73所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
76. 根据权利要求69至75中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的 溶液中进行步骤（c)中的缀合。
77. 根据权利要求76所述的方法，其中所述pH为约5. 0至约8. 0。
78. 根据权利要求76所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
79. 根据权利要求69至78中任一项所述的方法，其还包括在步骤（c)与（d)之间将所 述第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合，以 将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述第二混合物的其它组分纯化出业，从而在步 骤（d)之前制备所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物。
80. 根据权利要求79所述的方法，其中在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下进行纯 化。
81. 根据权利要求79或80所述的方法，其中将所述第二混合物在步骤（c)与（d)之间 经历切向流过滤。
82. 根据权利要求69至81中任一项所述的方法，其中在步骤（e)中使用切向流过滤。
83. 根据权利要求69至81中任一项所述的方法，其中在步骤（e)中使用吸附色谱。
84. 根据权利要求69至81中任一项所述的方法，其中在步骤（e)中使用非吸附色谱。
85. 根据权利要求69至84中任一项所述的方法，其中在步骤（b)中使用切向流过滤。
86. 根据权利要求69至84中任一项所述的方法，其中在步骤（b)中使用吸附色谱。
87. 根据权利要求69至84中任一项所述的方法，其中在步骤（b)中使用非吸附色谱。
88. -种用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的缀合物的方 法，所述方法包括： (a) 将细胞结合剂与双官能交联试剂接触以将接头共价地连接于所述细胞结合剂，从 而制备包含具有连接于其的接头的细胞结合剂的第一混合物， (b) 通过将所述具有连接于其的接头的细胞结合剂与细胞毒素剂反应,来将细胞毒素 剂缀合于所述第一混合物中的所述具有连接于其的接头的细胞结合剂，从而制备包含（i) 含有通过所述接头化学地偶联于所述细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素 剂缀合物、（ii)游离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混合物， (c) 在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下温育所述第二混合物；和 (d) 将所述第二混合物在步骤（c)之后经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸 附过滤、吸附色谱或其组合，以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述第二混合物 的其它组分纯化出来，从而制备所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合 物。
89. 根据权利要求88所述的方法，其中在具有约4. 0至9. 0的pH的溶液中进行步骤 (c)中的温育。
90. 根据权利要求89所述的方法，其中所述pH为约5. 0至约8. 0。
91. 根据权利要求89所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
92. 根据权利要求88至91中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至9. 0的pH的溶 液中进行步骤（a)中的接触。
93. 根据权利要求92所述的方法，其中所述pH为约6. 0至约8. 0。
94. 根据权利要求92所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
95. 根据权利要求88至94中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至9. 0的pH的溶 液中进行步骤（b)中的缀合。
96. 根据权利要求95所述的方法，其中所述pH为约5. 0至约8. 0。
97. 根据权利要求95所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
98. 根据权利要求88至97中任一项所述的方法，其还包括在步骤（b)与（c)之间将所 述第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合步 骤，以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述第二混合物的其它组分纯化出来，从 而在步骤（c)之前制备所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物。
99. 根据权利要求98所述的方法，其中在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下在步骤 (b)与（c)之间进行所述第二混合物的纯化。
100. 根据权利要求98或99所述的方法，其中将所述第二混合物在步骤（b)与（c)之 间经历切向流过滤。
101. 根据权利要求88至100中任一项所述的方法，其中在步骤（d)中使用切向流过 滤。
102. 根据权利要求88至100中任一项所述的方法，其中在步骤（d)中使用吸附色谱。
103. 根据权利要求88至100中任一项所述的方法，其中在步骤（d)中使用非吸附色 谱。
104. -种用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合 剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括： (a) 将细胞结合剂与细胞毒素剂接触以形成包含所述细胞结合剂和所述细胞毒素剂的 第一混合物，随后将所述第一混合物与包含接头的双官能交联试剂在具有约4至约9的pH 的溶液中接触，以提供包含（i)含有通过所述接头化学地偶联于所述细胞毒素剂的细胞结 合剂的细胞结合剂细胞毒素剂缀合物、（ii)游离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混 合物； (b) 在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下温育所述第二混合物；和 (c) 将所述第二混合物在步骤（b)后经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附 过滤、吸附色谱或其组合，以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述第二混合物的 其它组分纯化出来，从而制备所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物。
105. 根据权利要求104所述的方法，其中在将所述第一混合物与所述双官能交联试剂 接触后立即进行步骤（b)的温育。
106. 根据权利要求104或105所述的方法，其中在具有约4. 0至9. 0的pH的溶液中进 行步骤（b)中的温育。
107. 根据权利要求106所述的方法，其中所述pH为约5. 0至约8. 0。
108. 根据权利要求106所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
109. 根据权利要求104至108中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH 溶液中进行步骤（a)中的接触。
110. 根据权利要求109所述的方法，其中所述pH为约6. 0至8. 0。
111. 根据权利要求104至110中任一项所述的方法，其还包括在步骤（a)与（b)之间将 所述第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱或其组合， 以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述第二混合物的其它组分纯化出来，从而在 步骤（b)之前制备所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物。
112. 根据权利要求111所述的方法，其中在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下在步 骤（a)与（b)之间进行所述第二混合物的纯化。
113. 根据权利要求111或112所述的方法，其中将所述第二混合物在步骤（a)与（b) 之间经历切向流过滤。
114. 根据权利要求104至113中任一项所述的方法，其中在步骤（c)中使用切向流过 滤。
115. 根据权利要求104至113中任一项所述的方法，其中在步骤（c)中使用吸附色谱。
116. 根据权利要求104至113中任一项所述的方法，其中在步骤（c)中使用非吸附色 谱。
117. -种用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合 剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括： (a)将细胞结合剂与细胞毒素剂在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下接触，以形成 包含所述细胞结合剂和所述细胞毒素剂的第一混合物，随后将所述第一混合物与包含接头 的双官能交联试剂于具有约4至约9的pH的溶液中接触，以提供包含（i)含有通过接头化 学地偶联于所述细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、（ii)游离细 胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混合物；和 (b)将所述第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱 或其组合，以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述第二混合物的其它组分纯化出 来，从而制备所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物。
118. -种用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合 剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括： (a) 将细胞结合剂与细胞毒素剂接触以形成包含所述细胞结合剂和所述细胞毒素剂的 第一混合物，随后将所述第一混合物与包含接头的双官能交联试剂在外源N-羟基琥珀酰 亚胺存在的情况下于具有约4至约9的pH的溶液中接触，以提供包含（i)含有通过所述接 头化学地偶联于所述细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物、（ii)游 离细胞毒素剂和（iii)反应副产物的第二混合物；和 (b) 将所述第二混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱 或其组合，以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述第二混合物的其它组分纯化出 来，从而制备所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的第二混合物。
119. 根据权利要求117或118所述的方法，其中在具有约4. 0至约9. 0的pH的溶液中 的进行步骤（a)的接触。
120. 根据权利要求119所述的方法，其中所述pH为约6. 0至8. 0。
121. 根据权利要求117至120中任一项所述的方法，其中在步骤（b)中使用切向流过 滤。
122. 根据权利要求117至120中任一项所述的方法，其中在步骤（b)中使用吸附色谱。
123. 根据权利要求117至120中任一项所述的方法，其中在步骤（b)中使用非吸附色 谱。
124. -种用于制备包含通过接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合 剂-细胞毒素剂缀合物的方法，所述方法包括： (a) 将细胞结合剂与包含化学地偶联于接头的细胞毒素剂的细胞毒素剂-接头化合物 接触，以将所述细胞毒素剂-接头化合物共价地连接于所述细胞结合剂，从而制备包含含 有通过所述接头化学地偶联于细胞毒素剂的细胞结合剂的细胞结合剂-细胞毒素剂缀合 物的混合物； (b) 在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下温育步骤（a)的所述混合物；和 (c) 将所述混合物在步骤（b)后经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、 吸附色谱或其组合，以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述混合物的其它组分纯 化出来，从而制备所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的混合物。
125. 根据权利要求124所述的方法，其中通过将细胞毒素剂与包含接头的双官能交联 试剂接触以将所述细胞毒素剂共价地连接于接头，来制备所述细胞毒素剂-接头化合物。
126. 根据权利要求124或125所述的方法，其中在与所述细胞结合剂接触之前纯化所 述细胞毒素剂-接头化合物。
127. 根据权利要求124或125所述的方法，其中在与所述细胞结合剂接触之前不纯化 所述细胞毒素剂-接头化合物。
128. 根据权利要求124至127中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至9. 0的pH的 溶液中进行步骤（b)中的温育。
129. 根据权利要求128所述的方法，其中所述pH为约5. 0至约8. 0。
130. 根据权利要求128所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
131. 根据权利要求124至130中任一项所述的方法，其中在具有约4. 0至9. 0的pH的 溶液中进行步骤（a)中的接触。
132. 根据权利要求131所述的方法，其中所述pH为约6. 0至约8. 0。
133. 根据权利要求131所述的方法，其中所述pH为约6. 5至约7. 5。
134. 根据权利要求124至133中任一项所述的方法，其还包括在步骤（a)与（b)之间 将步骤（a)的所述混合物经历切向流过滤、选择性沉淀、非吸附色谱、吸附过滤、吸附色谱 或其组合，以将所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物从所述混合物的其它组分纯化出来， 从而在步骤（b)之前制备所述细胞结合剂-细胞毒素剂缀合物的纯化的混合物。
135. 根据权利要求134所述的方法，其中在外源N-羟基琥珀酰亚胺存在的情况下在步 骤（a)与（b)之间进行所述混合物的纯化。
136. 根据权利要求134或135所述的方法，其中在步骤（a)与（b)之间将步骤（a)的 混合物经历切向流过滤。
137. 根据权利要求124至136中任一项所述的方法，其中在步骤（c)中使用切向流过 滤。
138. 根据权利要求124至136中任一项所述的方法，其中在步骤（c)中使用吸附色谱。
139. 根据权利要求124至136中任一项所述的方法，其中在步骤（c)中使用非吸附色 谱。
140. 根据权利要求2至139中任一项所述的方法，其中所述非吸附色谱选自 SEPHADEX?树脂、SEPHACRYL?树脂、SUPERDEX?树脂和⑷〇...(;丨丨丨/树脂。
141. 根据权利要求1至140中任一项所述的方法，其中所述吸附色谱选自羟基磷灰石 色谱法、疏水性电荷诱导色谱法（HCIC)、疏水相互作用色谱法（HIC)、离子交换色谱法、混 合模式离子交换色谱法、固定金属亲和色谱法（IMAC)、染料配体色谱法、亲和色谱法、反相 色谱法及其组合。
142. 根据权利要求1至141中任一项所述的方法，其中所述细胞结合剂选自抗体、干扰 素、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、 胰岛素、EGF、TGF- a、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF 和转铁蛋白。
143. 根据权利要求142所述的方法，其中所述细胞结合剂为抗体。
144. 根据权利要求143所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
145. 根据权利要求143所述的方法，其中所述抗体为人源化单克隆抗体。
146. 根据权利要求143所述的方法，其中所述抗体选自huN901、huMy9-6、huB4、 huC242、曲妥珠单抗、比伐单抗、西罗珠单抗、CNT095、huDS6、利妥昔单抗、抗-⑶27L抗体、 抗-EGFRvIII抗体、抗-Cripto抗体、抗-CD138抗体、抗-CD38抗体、抗-EphA2抗体、整联 蛋白靶向抗体、抗-CD37抗体、抗-叶酸受体抗体、抗-Her3抗体和抗-IGFIR抗体。
147. 根据权利要求1至146中任一项所述的方法，其中所述细胞毒素剂选自类美登素、 紫杉烷类、CC1065以及前述毒素剂的类似物。
148. 根据权利要求147所述的方法，其中所述细胞毒素剂为类美登素。
149. 根据权利要求148所述的方法，其中所述类美登素包含硫醇基。
150. 根据权利要求148所述的方法，其中所述类美登素为DM1。
151. 根据权利要求148所述的方法，其中所述类美登素为DM4。
152. 根据权利要求1至151中任一项所述的方法，其中所述细胞结合剂通过化学键被 化学地偶联于所述细胞毒素剂，所述化学键选自二硫键、酸不稳定键、光不稳定键、肽酶不 稳定键、硫醚键和酯酶不稳定键。
153. 根据权利要求1至152中任一项所述的方法，其中所述双官能交联试剂包含可与 所述细胞结合剂的赖氨酸残基形成酰胺键的反应性部分。
154. 根据权利要求153所述的方法，其中所述反应性部分为羧酸部分或反应性酯部 分。
155. 根据权利要求153所述的方法，其中所述双官能交联试剂包含N-琥珀酰亚胺酯部 分或N-磺基琥珀酰亚氨酯部分。
156. 根据权利要求155所述的方法，其中所述双官能交联试剂还包含基于马来酰亚胺 的部分。
157. 根据权利要求155所述的方法，其中所述双官能交联试剂选自4-(马来酰亚胺甲 基）环己基羧酸N-琥珀酰亚胺酯（SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基）-环 己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯）（LC-SMCC)、κ -马来酰亚胺基十一酸N-琥珀酰亚胺酯 (KMUA)、γ -马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯（GMBS)、N- ( β -马来酰亚胺基丙酰氧基） 琥珀酰亚胺酯（BMPS)、ε -马来酰亚胺基己酸Ν-羟基琥珀酰亚胺酯（EMCS)、间-马来酰亚 胺苯甲酰基-Ν-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS)、Ν-( α -马来酰亚胺乙酰氧基）_琥珀酰亚胺酯 (AMAS)、6-( β -马来酰亚胺丙酰氨基）己酸琥珀酰亚胺酯（SMPH)、4-(对-马来酰亚胺苯 基）-丁酸Ν-琥珀酰亚胺酯（SMPB)、磺基-Mai、PEG 4-Mal、CX1-1、4_ (2-吡啶基二硫代）丁 酸N-琥珀酰亚胺酯（STOB)、4_ (2-吡啶基二硫代）戊酸N-琥珀酰亚胺酯（SPP)和4- (2-批 啶基二硫代）2-磺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯（磺基-STOB)。
158. 根据权利要求157所述的方法，其中所述双官能交联试剂为4-(马来酰亚胺甲 基）环己基羧酸N-琥珀酰亚胺酯（SMCC)、4-(2-吡啶基二硫代）戊酸N-琥珀酰亚胺酯 (SPP)或4-(2-吡啶基二硫代）丁酸N-琥珀酰亚胺酯（STOB)。
159. 根据权利要求1至158中任一项所述的方法，其中所述外源N-羟基琥珀酰亚胺对 所述双官能交联剂的摩尔比为约〇. 5至约1000。
【文档编号】A61K39/395GK104093425SQ201280068773
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年12月13日 优先权日:2011年12月13日
【发明者】刘芳, G·W·安普莱特, D·H·梅舒拉姆 申请人:伊缪诺金公司