特异结合戊型肝炎病毒3、4型的抗体及其用途

特异结合戊型肝炎病毒3、4型的抗体及其用途
【专利摘要】本发明涉及戊型肝炎病毒抗体，具体涉及能够特异性结合3、4型戊型肝炎病毒而与1型肝炎病毒不结合或弱结合的抗体，例如所述抗体为HEV-C3-1或HEV-C3-2。本发明还涉及与所述抗体特异性结合的3、4型戊型肝炎病毒的抗原表位。本发明还涉及包含所述抗体或抗原表位的试剂盒或检测试剂，以及所述抗体或抗原表位用于制备试剂盒或检测试剂的用途和用于制备预防或治疗戊型肝炎的药物的用途。
【专利说明】特异结合戊型肝炎病毒3、4型的抗体及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及戊型肝炎病毒抗体，具体涉及能够特异性结合3、4型戊型肝炎病毒而与I型肝炎病毒不结合或弱结合的抗体。本发明还涉及与所述抗体特异性结合的3、4型戊型肝炎病毒的抗原表位。本发明还涉及包含所述抗体或抗原表位的试剂盒或检测试剂、所述抗体或抗原表位用于制备试剂盒或检测试剂的用途以及用于制备预防或治疗戊型肝炎的药物的用途。
【背景技术】
[0002]20世纪50年代印度新德里发生了因饮用水污染造成的急性病毒性肝炎爆发。当时人们认为是由甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus，HAV)引起的，多年后的回顾性研究发现:患者血清内缺乏甲型肝炎病毒感染指标，提示有另一种能引起流行性急性肝炎的病原存在，人们把这种不明原因的病毒性肝炎命名为肠道非甲非乙型肝炎(entericallytransmitted non-A non-B hepatitis, ET-NANBH)。该病毒的首次病原学鉴定是 1983年 Balayan 等从一名志愿者的研究得到的(Balayan, M.S.et al., Intervirology, 1983，20(1):23-31)。利用免疫电镜技术在该志愿者的急性期粪便和康复期血清中发现一种直径约27nm (27~34nm)的无包膜病毒颗粒，并发现该病毒可成功感染食蟹猴。1990年Reyes等将ET-NANBH正式命名为戊型肝炎(戊肝，Hepatitis E，HE) (Reyes, G.R.etal.，Science, 1990，247 (4948): 1335-1339)，而相应的致病病原体则被命名为戊型肝炎病毒(戊肝病毒，ifeptatitis E Virus，HEV)。近年来，研究人员陆续从猪、鹿、猴等多种动物中发现了 HEV感染的证据，并发现动物HEV与人体HEV具有高度的基因相似性(LuL, Li C et al., Rev Med Virol, 2006, 16:5-36;曲立春，郭志儒 et al.,畜牧兽医科学,2006，22(8):26-29)。首例动物来源HEV于1997年被报道分离于美国的家猪身上(Meng，X.J.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A, 1997，94(18):9860-9865)，这为 HEV 的研究开拓了完全不同的视野，自此开始几乎所有以猪作为肉制品供应用家畜的国家都在猪身上分离到了 HEV(Meng, X.J.，Curr Top Microb1l Immunol, 2003, 278:185-216;ffilhelm, B.J.etal.,Epidem1l Infect, 2011，139 (8): 1127-1144)。日本研究人员还发现人类在食用含有HEV的鹿肉后感染了戊肝。这些证据均显示出戊肝是一种人畜共患病(Tei S，Kitajima Net al.，Lancet, 2003，362:371-373)，对人类健康构成巨大的威胁。
[0003]戊型肝炎病毒(HEV)引起的戊型肝炎在临床症状上与甲肝相似，但病死率较高，妊娠晚期病死率可高达15-25%。一直以来，戊肝在世界各地爆发不断。1986~1988年在我国新疆曾发生了一起累积发病11万余人、死亡近千人的戊肝大爆发，造成了极其严重的社会影响(庄辉，刘崇柏et al.,北京大学学报(医学版)，1992，24 (4): 281-284)。卫生部公布资料显示，我国近年戊肝发病迅速增长，2002年全年戊肝发病报告6830例，2003年上升为9655例，2004年上升为16436例，已经成为普遍流行、危害严重的疾病之一(http://www.moh.gov.cn/moh/main)。
[0004]HEV是一种无包膜的单股正链全长大约7.2kb的RNA病毒，主要通过消化道传播。Bradley等通过免疫电镜观察HEV为大小约27_34nm的二十面体对称结构球形病毒颗粒(Bradley, D.W.et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1987，84 (17):6277-6281)。HEV含3个部分重叠的开放读码框架(0RF)，其中0RF2编码660个氨基酸的多肽，为病毒主要结构蛋白，组成病毒衣壳，是病毒进入细胞时的关键蛋白(Panda SK, ThakralD et al.，Rev Med Virol, 2007, 17:151)。HEV 的 0RF2 与 ORFl 间隔 41 个核苷酸，全长1980bp，编码660个氨基酸的多肽p0RF2，为病毒的主要结构蛋白，p0RF2能通过非二硫键的方式自组装成病毒衣壳(capsid)。0RF2的翻译初始产物为一个82kD的前体蛋白(PP0RF2)，其蛋白N端(aal_aa36)存在一个典型的信号肽序列，通过信号肽识别蛋白(Signal peptide recognit1n protein, SRP)进入内质网(Endoplasmic reticulum,ER)，在进入过程中N端信号肽被剪切从而形成成熟的p0RF2蛋白(72kD)。信号肽之后是一个富含精氨酸的区域，这一强正电区被认为参与了病毒组装过程中基因组RNA的衣壳化(encapisidat1n)。目前已有多种表达系统能够表达0RF2编码的蛋白(Jameel, S.etal., J Virol.,1996, 70(1):207-216;Tyagi, S.et al., B1chem B1phys Res Commun, 200I, 284 (3): 614-621; Torresi, J.et al., J Gen Virol., 1999, 80(Pt5): 1185-1188; Panda,S.K.et al., J Clin Microb1l, 1995, 33 (10): 2653-2659; Torresi, J.et al., J Virol Methods, 1997, 69(1-2):81-91;McAtee, C.P.et al., J Chromatogr B B1med Appl, 1996, 685 (I): 91-104; Robinson, R.A.et al., Protein Expr Purif, 1998, 12(1): 75-84; Carl, M.et al., Clin Diagn Lab Immunol, 1994，I (2): 253-256),表达的 p0RF2 蛋白能够形成不为β -巯基乙醇解聚但可被沸水浴破坏的非共价同源二聚体(Zafrullah，M.et al.，JVirol., 1999, 73(5):4074-4082)，表明p0RF2能够形成同源二聚体，这种同源二聚体很可能是组成病毒衣壳的最基本单位。
[0005]HEV的衣壳蛋白基因相对稳定，但随着编码基因的进一步变异可能引起病毒表面抗原表位的变化，从而导致血清型的差异，因此科学家们用结构蛋白编码区(0RF2)进行了基因分型。即将0RF2区的核酸变异不超过20%的分离株归为一个基因型。根据这个标准，HEV至少可分为4个主要的基因型，其中1、3、4型为主要流行株，2型则只在墨西哥及非洲少数地区流行。
[0006]为了更好地特异性检测HEV-3和HEV-4病原体，找出针对HEV-3和HEV-4的特异性抗体，本发明人在获得戊型肝炎病毒0RF2中一系列具有优异抗原性的多肽片段(参见中国专利申请CNOO130634.0)的基础上，表达纯化HEV-3和HEV-4的同源多肽片段，并进一步获得了能分泌特异性结合3型和4型戊型肝炎病毒0RF2编码多肽和3型和4型戊型肝炎病毒的抗体。

【发明内容】

[0007]本发明第一方面涉及抗体或其抗原结合部分，其能够特异性结合3、4型戊型肝炎病毒而与I型戊型肝炎病毒不结合或弱结合；
[0008]优选地，所述抗体或抗原结合部分所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第490位或4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第504位的天冬酰胺；
[0009] 更优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489位、4型0RF2蛋白第503位的苏氨酸，3型0RF2蛋白第524位、4型0RF2蛋白第538位的精氨酸，和3型0RF2蛋白第532位、4型0RF2蛋白第546位的酪氨酸；
[0010]特别优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489~532位氨基酸的多肽片段，或者包含4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第503~546位氨基酸的多肽片段。
[0011]在本发明的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，优选为单克隆抗体。
[0012]在本发明的具体实施方案中，所述单克隆抗体选自:
[0013]I)由保藏于中国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞系CCTCC-C201223所分泌的抗戊型肝炎病毒单克隆抗体HEV-C3-1 ；
[0014]2)由保藏于中国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞系CCTCC-C201231所分泌的抗戊型肝炎病毒单克隆抗体HEV-C3-2。
[0015]本发明第二方面涉及抗体或其抗原结合部分，其能够特异性结合3、4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白、3型0RF2蛋白的第368-606位或4型第382-620位氨基酸、3型0RF2蛋白的第394-606位或4型第408-620位氨基酸或这些蛋白变体而与I型戊型肝炎病毒与上述蛋白对应的蛋白或其变体不结合或弱结合；
[0016]优选地，所述抗体或抗原结合部分所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第490位或4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第504位的天冬酰胺，更优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489位、4型0RF2蛋白第503位的苏氨酸，3型0RF2蛋白第524位、4型0RF2蛋白第538位的精氨酸，和3型0RF2蛋白第532位、4型0RF2蛋白第546位的酪氨酸，特别优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489~532位氨基酸的多肽片段，或者包含4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第503~546位氨基酸的多肽片段；和/或
[0017]优选地，所述抗体结合I型戊型肝炎病毒0RF2蛋白、0RF2蛋白的第368-606位氨基酸、0RF2蛋白的第394-606位氨基酸或这些蛋白的变体的Kd值高于结合3、4型戊型肝炎病毒的上述蛋白或其变体的Kd值2倍以上，例如为2倍、4倍、8倍、16倍以上；在本发明的实施方案中，所述抗体结合I型戊型肝炎病毒、0RF2蛋白的第368-606位氨基酸、0RF2蛋白的第394-606氨基酸或这些蛋白的变体的Kd值高于结合3、4型戊型肝炎病毒的上述蛋白的Kd值20倍以上，例如为20-100倍；和/或
[0018]优选地，所述抗体结合3、4型戊型肝炎病毒的上述蛋白或其变体的Kd值小于I X 10-8Μ，例如小于 5 X 10-9Μ。
[0019]在本发明的实施方案中，所述3、4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示序列；所述3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白的第368-606位氨基酸为SEQ ID NO:5所示序列，4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白的第382-620位氨基酸为SEQID NO:6所示序列；所述3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白的第394-606位氨基酸为SEQ ID NO:9所示序列，4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白的第408-620位氨基酸为SEQ ID NO:8所示序列。
[0020]在本发明的实施方案中，所述I型戊型肝炎病毒0RF2蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示序列；所述I型戊型肝炎病毒0RF2蛋白的第368-606位氨基酸为SEQ ID NO:4所示序列；所述I型戊型肝炎病毒0RF2蛋白的第394-606位氨基酸为SEQ ID Ν0:7所示序列。[0021]在本发明的实施方案中，所述3、4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白变体是指3型0RF2蛋白第490位或4型第504位氨基酸为天冬酰胺，3型0RF2蛋白第489位、4型第503位为苏氨酸，3型0RF2蛋白第524位、4型第538位为精氨酸，和3型0RF2蛋白第532位、4型第546位为酪氨酸，其余氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示序列的同源性为85%以上，例如90%以上，例如95%以上，例如99%以上；所述3型0RF2蛋白的第368-606位、4型第382-620位氨基酸、3型0RF2蛋白的第394-606位、4型第408-620位氨基酸的变体是指与0RF2蛋白变体的对应位置为天冬酰胺、苏氨酸、精氨酸和酪氨酸，其余氨基酸序列与SEQ ID NO:5、6、8、9所示序列的同源性为85%以上，例如90%以上，例如95%以上，例如99%以上。
[0022]在本发明的实施方案中，所述I型戊型肝炎病毒0RF2蛋白变体是指该变体第490位氨基酸为甘氨酸或丙氨酸，其余氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示序列的同源性为85%以上，例如90%以上，例如95%以上，例如99%以上；所述0RF2蛋白的第368-606位氨基酸、0RF2蛋白的第394-606氨基酸的变体是指与0RF2蛋白变体的对应位置为甘氨酸或丙氨酸，其余氨基酸序列与SEQ ID NO:4、7所示序列的同源性为85%以上，例如90%以上，例如95%以上，例如99%以上。
[0023]在本发明的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，优选为单克隆抗体。
[0024]在本发明的具体实施方案中，所述单克隆抗体选自:
[0025]I)由保藏于中国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞系CCTCC-C201223所分泌的抗戊型肝炎病毒单克隆抗体HEV-C3-1 ； [0026]2)由保藏于中国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞系CCTCC-C201231所分泌的抗戊型肝炎病毒单克隆抗体HEV-C3-2。
[0027]本发明第三方面涉及抗体或其抗原结合部分，其所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第490位或4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第504位的天冬酰胺；
[0028]优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489位、4型0RF2蛋白第503位的苏氨酸，3型0RF2蛋白第524位、4型0RF2蛋白第538位的精氨酸，和3型0RF2蛋白第532位、4型0RF2蛋白第546位的酪氨酸；
[0029]更优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489~532位氨基酸的多肽片段，或者包含4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第503~546位氨基酸的多肽片段。
[0030]在本发明的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，优选为单克隆抗体。
[0031]在本发明的具体实施方案中，所述单克隆抗体选自:
[0032]I)由保藏于中国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞系CCTCC-C201223所分泌的抗戊型肝炎病毒单克隆抗体HEV-C3-1 ；
[0033]2)由保藏于中国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞系CCTCC-C201231所分泌的抗戊型肝炎病毒单克隆抗体HEV-C3-2。
[0034]本发明第四方面涉及杂交瘤细胞株，其选自如下一组的杂交瘤细胞株:
[0035]I)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC-C201223的杂交瘤细胞株HEV-C3-1 ；
[0036]2)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC-C201231的杂交瘤细胞株HEV-C3-2。
[0037]本发明第五方面涉及能特异性结合3、4型戊型肝炎病毒衣壳蛋白的抗体或其抗原结合部分，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，其中，所述抗体能够封闭所述的3、4型戊型肝炎病毒衣壳蛋白与选自以下单克隆抗体相结合的活性的至少50%、例如至少60%、至少70%、至少80%、例如至少85%、至少90%、至少95%:
[0038]I)杂交瘤细胞株HEV-C3-1所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株HEV-C3-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC-C201223 ；
[0039]2)杂交瘤细胞株HEV-C3-2所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株HEV-C3-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC-C201231 ；
[0040]优选地，所述抗体与选自I)和2)的单克隆抗体具有相同的表位。
[0041]本发明第六方面涉3、4型戊型肝炎病毒的抗原表位，其能与权利要求1-4或6任一项的抗体或其抗原结合部分特异性结合并且至少包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第490位或4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第504位的天冬酰胺；
[0042]优选地，所述抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489位、4型0RF2蛋白第503位的苏氨酸，3型0RF2蛋白第524位、4型0RF2蛋白第538位的精氨酸，和3型0RF2蛋白第532位、4型0RF2蛋白第546位的酪氨酸；
[0043]更优选地，所述抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489~532位氨基酸的多肽片段，或者包含4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第503~546位氨基酸的多肽片段。
[0044]本发明第七方面涉及组合物，其包含本发明第一至第三方面或第五方面任一项的抗体或其抗原结合部分、或者本发明第六方面的抗原表位。
[0045]本发明第八方面涉及检测样品中3、4型戊型肝炎病毒的方法，其包括使用本发明第一至第三方面或第五方面任一项的抗体或其抗原结合部分的步骤。具体地，所述方法包括以下步骤:
[0046]I)将待测样品与本发明第一至第三方面或第五方面任一项的抗体或其抗原结合部分进行接触；
[0047]2)检测所述抗体与样品发生的反应，优选地，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。
[0048]优选地，所述抗体为单克隆抗体；
[0049]优选地，所述单克隆抗体附着在固相上，所述固相例如选自于如下一组:微滴定板、磁颗粒、胶乳颗粒和硝化纤维素膜；
[0050]优选地，所述单克隆抗体是按如此方向附着在所述固相上，其能够增加所述单克隆抗体与所述样品的结合效率。
[0051]优选地，所述单克隆抗体是通过其恒定区域而附着在所述固相上的。
[0052]优选地，所述的反应是通过酶显色、荧光或化学发光法进行测定的。
[0053]优选地,所述的单克隆抗体为Fab、Fab'、F(ab)2或Fv。
[0054]本发明第九方面涉本发明第一至第三方面或第五方面任一项的抗体或其抗原结合部分的用途，其用于检测3、4型戊型肝炎病毒在样品中的存在或其表达水平，或者用于制备试剂盒，所述试剂盒用于检测3、4型戊型肝炎病毒在样品中的存在或其表达水平。
[0055]本发明第十方面涉及试剂盒或检测试剂，其包含本发明第一至第三方面或第五方面任一项的抗体或其抗原结合部分、或者本发明第六方面的抗原表位，所述试剂盒或检测试剂用于检测3、4型戊型肝炎病毒或诊断戊型肝炎。
[0056]本发明第十一方面涉及本发明第一至第三方面或第五方面任一项的抗体或其抗原结合部分、或者本发明第六方面的抗原表位在制备试剂盒或检测试剂中的用途，所述试剂盒或检测试剂用于检测3、4型戊型肝炎病毒或诊断戊型肝炎。
[0057]本发明第十二方面涉及本发明第一至第三方面或第五方面任一项的抗体或其抗原结合部分、或者本发明第六方面的抗原表位在制备预防或治疗戊型肝炎的药物中的用途。
[0058]本发明第十三方面涉及一种制备抗体的方法，所述方法包括利用3、4型戊型肝炎病毒的抗原表位或包含该抗原表位的多肽或蛋白质进行免疫以获得抗体的步骤，所述3、4型戊型肝炎病毒的抗原表位至少包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第490位或4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第504位的天冬酰胺；
[0059]优选地，所述抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489位、4型0RF2蛋白第503位的苏氨酸，3型0RF2蛋白第524位、4型0RF2蛋白第538位的精氨酸，和3型0RF2蛋白第532位、4型0RF2 蛋白第546位的酪氨酸；
[0060]更优选地，所述抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489~532位氨基酸的多肽片段，或者包含4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第503~546位氨基酸的多肽片段。
[0061]发明详述
[0062]除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分子遗传学、核算化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
[0063]本发明中的“抗体” 一词指任意一种免疫球蛋白，包括能结合特异性抗原的单抗、多抗、双特异性或多特异性抗体。一个完整的抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链含有一个可变区和第一、第二、第三等三个恒定区；每条轻链包含一个可变区和一个恒定区。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部含有两条重链的第二和第三恒定区，其通过二硫键结合形成。“Y”型结构的每条臂含有其中一条重链的第一恒定区和可变区，和一条轻链的可变区和恒定区。轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻链(L)的CDR包含LCDRU LCDR2、LCDR3，重链(H)的CDR包含HCDRl、HCDR2、HCDR3 (其由 Kabat 等人命名，见 Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, Fifth Edit1n(1991),第 1-3卷，NIH Publicat1n91_3242, Bethesda Md)。其中，三个CDR由构架区(FR)间隔开。构架区比CDR区更保守并形成一个架子状结构支撑超变区。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类，主要是:1gA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些类还进一步分成亚类，如 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 或 IgA2 等。
[0064]可以米用Kohler等在Nature256:495 (1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备单抗。首先将免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。免疫原预先藕联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制剂上，可能会有助于增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以利用福氏佐剂或MPL-TDM等。动物受免疫后，体内会有分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞产生。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞与骨髓瘤细胞并用合适的融合剂，如PEG,进行融合以获得杂交瘤细胞(Goding, MonoclonalAntibodies!Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press,1996)。
[0065]上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中最好含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT or HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。
[0066]优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养液敏感等能力。其中，骨髓瘤细 胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21 and MC-1l小鼠肿瘤衍生株(THE Salk Institute Cell Distribut1n Center, San Diego, Calif.USA),和 SP-2/0or X63_Ag8_653 细胞株(American Type Culture Collect1n, Rockville, Md.USA)。另外也有研究报道利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(K0Zb0r，J.1mmunol., 133:3001 (1984) ;Brodeur et al., Monoclonal Antibody Product1nTechniques and Applicat1ns, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)。
[0067]杂交瘤细胞生长的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性有免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，利用 Munson 等在 Anal.B1chem.107:220 (1980)描述的 Scatchard分析法可用来测定单抗的亲和力。
[0068]当杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性确定之后，目的细胞株可以通过(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, AcademicPress, 1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPM1-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。
[0069]利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。
[0070]本发明中的“抗体” 一词，除特指完整的免疫球蛋白外，也指免疫球蛋白的片段(如至少是免疫球蛋白分子的一个免疫活性区段)，如Fab、Fab'、F (ah' )2、Fv片段、单链抗体分子或由含有一个或多个CDR区的免疫球蛋白分子的任意片段形成的多特异性抗体。另外，本发明涉及的抗体也可以是由一个特定的人免疫球蛋白中的一个或多个CDR区结合一个或多个不同的人免疫球蛋白的构架区形成的抗体。
[0071]本发明的单抗可以是包含两条重链和两条轻链的传统的“Y”型结构状的抗体。另外，所述抗体也可以是保持了对血凝素蛋白亲和力的传统的“Y”型结构状的抗体上的Fab片段、Fab'、F(ab)2、Fv、或其它类型的部分片段，其结合血凝素蛋白的亲和力可以高于或低于传统的“Y”型结构状的抗体。
[0072]本发明的抗体片段可以利用水解完整的抗体分子获得(参见Morimotoet al.,J.B1chem.B1phys.Methods24:107-117(1992)and Brennan etal.，Science229:81 (1985))。另外，这些抗体片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed in Hudson, Curr.0pin.Tmmunol.11:548-557(1999) ;Little et al., Tmmunol.Today, 21:364-370 (2000))。比如，Fab’片段可以直接从E.coli细胞中获得或化学藕联形成 F(ab' ) 2 片段(Carter et al.，B1/Technology, 10:163-167 (1992))。再如，F (ab' ) 2片段可以用亮氨酸拉链GCN4连接获得。另外，Fv、Fab或F(ab' )2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备抗体片段的其它技术。
[0073]如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，ERCC1)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology, Ch.7 (Paul, ff., ed.,第 2 版,RavenPress, N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab' )2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。在本发明的实施方案中，所述抗原结合部分为抗体的Fab片段。
[0074]如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由Vi^PChI结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的\和Vh结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由Vh结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature 341:544-546(1989));术语“Fab片段”意指由八、VH、(^和ChI结构域组成的抗体片段；“Fab’ ”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段；术语“F(ab' )2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
[0075] 在一些情况下，抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如，scFv)，其中\和Vh结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird 等人,Science242:423-426 (1988)和 Huston 等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883 (1988))。此类 scFv 分子可具有一般结构=NH2-Vf 接头-Vh-COOH 或 NH2-Vh-接头-'-C00H。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由 Alfthan 等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi 等人(2001)，Eur.J.1mmunol.31:94-106，Hu 等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov 等人(1999)，J.Mol.B1l.293:41-56 和 Roovers等人(2001), Cancer Tmmunol.描述。
[0076]在一些情况下，抗体是双抗体，即，双价抗体，其中Vh和'结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993),和 Pol jak R.J.等人，Structure〗:1121-1123(1994))。
[0077]可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如单克隆抗体2E12)获得抗体的抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。
[0078]本发明所述抗体能够特异性结合3、4型戊型肝炎病毒。本发明的一个方面涉及能特异性结合3、4型戊型肝炎病毒衣壳蛋白而不结合或弱结合I型戊型肝炎病毒衣壳蛋白的抗体。在本发明的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
[0079]本发明所述抗3、4型戊型肝炎病毒单抗是由小鼠杂交瘤细胞株HEV-C3-1、HEV-C3-2所分泌的。这些单抗的名称以其相应的杂交瘤细胞株进行命名。也就是，这些抗3、4型戊型肝炎病毒单抗分别由杂交瘤细胞株HEV-C3-1、HEV-C3-2产生，并分别命名为HEV-C3-1、HEV-C3-2。单抗HEV-C3-1、HEV-C3-2能特异性结合3、4型戊型肝炎病毒衣壳蛋白。小鼠杂交瘤细胞株HEV-C3-1、HEV-C3-2已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，WuhanUniversity, Wuhan, China)进行保藏，保藏号分别是CCTCC-C201223 (杂交瘤细胞株HEV-C3-1，保藏时间2012年2月20日)，CCTCC-C201231 (杂交瘤细胞株HEV-C3-2，保藏时间2012年2月20日)。
[0080]在本发明的一个实施方案中，涉及一种可特异性结合如SEQ ID N0:5所示戊型肝炎病毒0RF2编码多肽而不结合如SEQ ID NO: 4所示戊型肝炎病毒0RF2编码多肽的单克隆抗体。在本发明一个具体实施方案中，所述单克隆抗体为有杂交瘤细胞系CCTCC-C201223所分泌的抗戊型肝炎病毒单克隆抗体HEV-C3-1 ;其能直接捕获3、4型HEV病毒颗粒，但并不捕获I型HEV病毒颗粒；其与HEV4型重组多肽L6E2的亲和常数约为1.89X 10_9，其Fab片段的亲和常数约为6.45X 10_9，其与HEVl型重组多肽NE2的亲和常数约为4.195X 10_8，其Fab片段的亲和力过弱无法检测。
[0081]在本发明又一实施方案中，所述单克隆抗体为有杂交瘤细胞系CCTCC-C201231所分泌的抗戊型肝炎病毒单克隆抗体HEV-C3-2 ;其能直接捕获3、4型HEV病毒颗粒，但并不捕获I型HEV病毒颗粒；其与HEV4型重组多肽L6E2的亲和常数约为2.984 X 10,，其Fab片段的亲和常数约为6.69 X 10_9，其与HEVl型重组多肽NE2的亲和常数约为3.75 X 10_8，其Fab片段的亲和力过弱无法检测。
[0082]本发明涉及抗体还包括能阻断单抗HEV-C3-1或HEV-C3-2结合3、4型戊型肝炎病毒衣壳蛋白的抗体，例如所述抗体为单克隆抗体。这些单抗结合的3、4型戊型肝炎病毒衣壳蛋白上的表位可以与单抗HEV-C3-1或HEV-C3-2所识别的表位相同。这些单抗所识别的表位也可以和单抗HEV-C3-1或HEV-C3-2所识别的表位在空间上有重叠。这样的单抗可以降低单抗HEV-C3-1或HEV-C3-2与3、4型戊型肝炎病毒衣壳蛋白的结合力至少50%，或至少60%,或优选至少70%,或更优选至少75%,或更优选至少80%,或更优选至少85%,或更优选至少90 %，或更优选95 %，或最优选99 %。
[0083]可以米用常规方法如Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)中描述的方法，测定某一未知单抗降低某一已知单抗结合3、4型戊型肝炎病毒衣壳蛋白的能力。例如，先把抗原预包被在微孔板上，然后把系列稀释的未标记的待测抗体和特定浓度的标记后的已知单抗共同加入上述预包被后的微孔板中孵育，洗涤后测定不同稀释度的待测抗体下已知抗体结合到板上的数量。待测抗体竞争已知抗体结合抗原的能力越强，已知抗体结合抗原的能力就越弱。通常，抗原是预包被在96孔微孔板上，并利用放射标记法或酶标记法测定未标记单抗阻断已标记单抗的能力。
[0084]本发明中的“抗原决定簇”(或称表位)指的是抗原分子中与抗体结合的那部分氨基酸或原子基团。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular B1logy,第 66 卷,G.E.Morris, Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在，当相互作用的点已确定时，根据相互作用的点确定构象表位的方法为本领域所公知。
[0085]在本发明的实施方案中，所述3、4型戊型肝炎病毒的抗原表位为构象型表位。
[0086]在本发明的具体实施方案中，所述3、4型戊型肝炎病毒的抗原表位与抗体HEV-C3-1和HEV-C3-2结合的位点包括3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第490位或4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第504位的天冬酰胺，3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489位、4型0RF2蛋白第503位的苏氨酸，3型0RF2蛋白第524位、4型0RF2蛋白第538位的精氨酸，和3型0RF2蛋白第532位、4型0RF2蛋白第546位的酪氨酸。
[0087]在本发明的具体实施方案中，3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489~532位氨基酸或者4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第503~546位氨基酸，通过空间折叠，形成构象型表位。
[0088]在本发明的具体实施方案中，所述抗原表位还可以包括3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489~532位氨基酸或者4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第503~546位氨基酸左右两侧的数个氨基酸，以有利于多肽的正确折叠，例如分别包括左右两侧的各I个、2个、3个、4个、5个氨基酸。
[0089]可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞 争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原的结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请TO03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与单克隆抗体HEV-C3-1或HEV-C3-2竞争结合0RF2蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合部分。
[0090]如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以小于大约1Χ10-8Μ，例如小于大约IX 10-9Μ、IX 1-1ciM或IX 1-11M或更小的亲和力(Kd)结合抗原表位
[0091]如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的结合解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约1X10_8M，例如小于大约1X10_9M、I X 1^10M或IX 10_nM或更小的结合解离平衡常数(Kd)结合抗原，例如，使用表面等离子体共振术(SPR)在BIAC0RE仪中测定，或者利用BLI (B1-Layer Interferometry)技术,跟踪检测溶液中分子与生物传感器之间的结合、解离整个过程的变化，计算抗体与抗原的结合解离平衡常数。
[0092]本发明的另一方面涉及一种存在于如下的3、4型戊型肝炎病毒0RF2上而不存在于1、2型戊型肝炎病毒0RF2上的抗原决定簇，所述抗原决定簇:
[0093]I)可与单克隆抗体HEV-C3-1结合；暴露于3、4型戊型肝炎病毒颗粒的表面；具有构象依赖性，且戊型肝炎病毒0RF2多肽片段的二聚化有助于该抗原决定簇的正确形成或充分暴露；参与形成该抗原决定簇的关键氨基酸其位置为3型戊型肝炎病毒0RF2的490位或4型第504位上的天冬酰胺，3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489位、4型0RF2蛋白第503位的苏氨酸，3型0RF2蛋白第524位、4型0RF2蛋白第538位的精氨酸，和3型0RF2蛋白第532位、4型0RF2蛋白第546位的酪氨酸，或者
[0094]2)可与单克隆抗体HEV-C3-2结合；暴露于3、4型戊型肝炎病毒颗粒的表面；具有构象依赖性，且戊型肝炎病毒0RF2多肽片段的二聚化有助于该抗原决定簇的正确形成或充分暴露；参与形成该抗原决定簇的关键氨基酸其位置为3型戊型肝炎病毒0RF2的490位或4型第504位上的天冬酰胺，3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第489位、4型0RF2蛋白第503位的苏氨酸，3型0RF2蛋白第524位、4型0RF2蛋白第538位的精氨酸，和3型0RF2蛋白第532位、4型0RF2蛋白第546位的酪氨酸。
[0095]“序列相同百分比”或者“同源性” 一词指的是候选序列中的核酸或氨基酸分别与对应的核酸或多肽序列中核酸或氨基酸相同性的百分比。这里涉及到的与核酸序列或者多肽序列有关的术语“序列相似百分比”定义为候选核酸序列或氨基酸残基序列分别与目的核酸序列或氨基酸序列的相似百分比。对于某一个序列，将它和目的序列进行比对，必要时可跳过突变缺口，以达到最大的基因相似百分比，而不去考虑相似序列的任意保守性突变。本领域的多种比对方法可用于确定核酸或氨基酸序列的相似性，如可用的计算机软件包括BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)等。熟悉本领域技术的工作人员懂得给比对设定合适的测量参数，包括为使用最大可比性的一些运算法则达到而全长序列的比较。
[0096]本领域技术人员 知晓，能够形成类病毒颗粒(例如I型戊型肝炎病毒NE2多肽多聚体或3、4型戊型肝炎病毒L6E2多肽多聚体，或者0RF2蛋白，或者0RF2蛋白的第368-606位氨基酸)的多肽的氨基酸序列中可以包含一个或多个保守型的氨基酸替换、添加和/或删除，其仍能够保持形成类病毒颗粒的性质以及免疫原性。一般的，所述多肽片段中极性氨基酸可以被同为极性氨基酸的残基所替换而不至于改变其形成多聚体的能力，非极性氨基酸被同为非极性氨基酸的残基替换也不至于改变其形成多聚体的能力。
[0097]在本发明中，所述抗体或其抗原结合部分能够与病毒结合是指抗体或其抗原结合部分能够捕获病毒，所述不结合或弱结合是指不能捕获病毒。其中所述捕获病毒的检测方法为本领域所公知，例如可参考Narayanan Jothikumar, Theresa L.Cromeans, BettyH.Robertson, X.J.Mengdj Vincent R Hill.A broadly reactive one-step real-timeRT-PCR assay for rapid and sensitive detect1n of hepatitis E virus.Journal ofVirological Methods 131 (2006)65 - 71。
[0098]在本发明中，所述抗体或其抗原结合部分能够与蛋白结合是指抗体或其抗原结合部分与蛋白的亲和力常数(Kd)小于大约1X10_8M，例如小于大约I X KT9MUXKTkiM或I X 1-11M,所述不结合或弱结合是指抗体或其抗原结合部分以大于大约I X 1-8M,例如大于大约1X10_7M、1X10_6M或1X10_5M或更大的亲和力常数(Kd)结合抗原表位。
[0099]在本发明中，所述戊型肝炎病毒0RF2蛋白与衣壳蛋白的含义相同，其氨基酸序列例如为序列SEQ ID NO:1、2、3所不的序列。
[0100]在本发明中，1、3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白的长度相同，为660个氨基酸，4型戊型肝炎病毒0RF2蛋白的后660个氨基酸与1、3型0RF2蛋白对应，因此在对氨基酸的位置进行描述时，与1、3型戊型肝炎病毒不同。
[0101]在本发明中，所述I型、3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白的第368-606位氨基酸、4型第382-620位氨基酸在表达纯化过程中可形成类病毒颗粒，并具有良好的中和表位活性、免疫原性和免疫保护性，用透射电镜和原子力显微镜对其分析，发现该类病毒颗粒呈直径
13.5-23.0nm的规整的球状颗粒，其具体分子量不明确。
[0102]在本发明中，所述I型、3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白的第394-606位氨基酸、4型第408-620位氨基酸在表达纯化过程中可形成以二聚体为基本结构的多种聚合体形式，NE2及L6E2抗原良好再现了 HEV病毒衣壳表面的主要空间结构特征，包括至少2个中和位点和免疫优势表位(参见李少伟.戊型肝炎病毒衣壳蛋白体外组装相关结构域的研究.厦门大学博士毕业论文，2003)。
[0103]在本发明中，所述抗体与抗原之间的Kd值通过Octet RED96蛋白质相互作用工作站测定，其利用BLI (B1-Layer Interferometry)技术,能跟踪检测溶液中分子与生物传感器之间的结合、解离整个过程的变化，计算抗体与抗原的结合解离平衡常数。
[0104]发明的有益效果
[0105]本发明提供了可特异性结合3、4型戊型肝炎病毒而不与I型戊型肝炎病毒结合的抗体，以及与所述抗体结合的抗原表位。利用本发明的抗体和抗原表位可检测3、4型戊型肝炎病毒或其抗体的存在，可用于戊型肝炎的诊断和治疗。
[0106]保藏声明
[0107]小鼠杂交瘤细胞株HEV-C3-l、HEV-C3-2已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学，武汉，中国)进行保藏，保藏号分别是CCTCC-C201223(杂交瘤细胞株HEV-C3-1，保藏时间2012年2月20日)，CCTCC-C201231 (杂交瘤细胞株HEV-C3-2，保藏时间2012年2月20日)。
【专利附图】

【附图说明】
[0108] 图1单抗与不同型戊型肝炎病毒的结合检测
[0109]图2抗体结合表位构象性分析的Western blot检测
【具体实施方式】
[0110]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在本发明中，氨基酸的位置编号均以戊型肝炎病毒的0RF2蛋白为基准。
[0111]实施例1:抗HEV衣壳蛋白P239单克隆抗体的制备
[0112]不同型HEV衣壳蛋白抗原的制备:
[0113]HEV分为4个主要的基因型，其中基因1、3、4型为主要流行株，2型HEV在墨西哥爆发过一次，并存有一株代表性毒株，此外只有少量发现。分别于HEV1、3型病毒中调取0RF2a.a.368-606段、4型病毒中调取0RF2a.a.382-620段的表达基因，将其构建在表达载体上，利用大肠杆菌表达系统，制备了 1、3、4型HEV来源的p239蛋白，分别命名为p239 (I)、p239(3)、p239(4)，其氨基酸序列分别如 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6 所示。
[0114]小白鼠:6周龄雌性Balb/c鼠为上海斯莱克实验动物有限责任公司公司购买。[0115]杂交瘤的制备:
[0116]使用标准的体内免疫方式和PEG融合方法获得单克隆抗体，详细方法参见EdHarlow et al., “Antibodies A Laboratory Manual，，，Cold Spring Harbor Laboratory1988.简要过程如下:
[0117]小鼠免疫:将上述p239(3)、p239(4)与福氏完全佐剂(CFA)等体积混合乳化，经四肢及头背的皮下多点注射，每只每次注射lmg/ml蛋白300ul。首次免疫后15d和29d，分别用同样剂量的HEV衣壳蛋白抗原p239 (3)和p239(4)加弗氏不完全佐剂(IFA)进行加强免疫。第二次加强免疫后采血用间接ELISA法检测血清中抗体和p239 (3)和p239 (4)的反应滴度，当滴度达到1:100000后，取小鼠脾脏做融合。融合前72hr再次加强免疫。制备10块融合板。
[0118]融合:取血清中抗体和p239(3)和p239 (4)的反应滴度最高的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0相融合。先把脾脏研磨得到脾细胞悬液，然后与细胞数低十倍的处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合，经PEG1500作用Imin将两种细胞融合一起，然后把融合细胞液10ml分装到10块96孔板中培养。融合培养基为含HAT和20% FBS的RPMI1640完全筛选培养基。抗原特异性克隆通过间接ELISA法筛选，筛选与p239 (3)和p239(4)具有强反应性，而与p239(l)弱反应性的单克隆抗体细胞株。经3次克隆化后，得到稳定的单克隆抗体细胞株。
[0119]杂交瘤的筛选:融合后细胞在96孔细胞板上培养10天后，吸取细胞上清做与HEV衣壳蛋白抗原的反应滴度检测，筛选与p239(3)和p239(4)具有强反应性，而与p239 (I)弱反应的单克隆抗体细胞株。阳性孔继续克隆化，直至细胞株所分泌的抗体能够稳定地特异与HEV衣壳蛋白p239(3)和p239 (4)反应为止。筛选到两株杂交瘤细胞株HEV-C3-1、HEV-C3-2。
[0120]筛选结果:获得两株特异性反应单克隆抗体HEV-C3-1、HEV-C3-2。
[0121]本发明所述抗3、4型戊型肝炎病毒单抗是由小鼠杂交瘤细胞株HEV-C3-1、HEV-C3-2所分泌的。这些单抗的名称以其相应的杂交瘤细胞株进行命名。也就是，这些抗3、4型戊型肝炎病毒单抗分别由杂交瘤细胞株HEV-C3-1、HEV-C3-2产生，并分别命名为HEV-C3-1、HEV-C3-2。单抗HEV-C3-1、HEV-C3-2能特异性结合3、4型戊型肝炎病毒衣壳蛋白。小鼠杂交瘤细胞株HEV-C3-l、HEV-C3-2已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学，武汉，中国)进行保藏，保藏号分别是CCTCC-C201223(杂交瘤细胞株HEV-C3-1，保藏时间2012年2月20日)，CCTCC-C201231 (杂交瘤细胞株HEV-C3-2，保藏时间2012年2月20 曰)。
[0122]杂交瘤的培养:稳定的杂交瘤单克隆抗体细胞株先在二氧化碳培养箱中扩增培养，经96孔转移至24孔，再转移至50ml细胞瓶经扩增培养。然后收集细胞瓶内的细胞注射到小鼠腹腔内，7 - 10天后从小鼠腹腔中吸取腹水。
[0123]单克隆抗体的纯化:
[0124]腹水先用50 %的硫酸铵沉淀处理，然后对PB，pH7.4透析，之后用DEAE柱在HPLC下纯化，得到纯化后的单克隆抗体，经SDS-PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体纯度。
[0125]单克隆抗体与不同型HEV衣壳蛋白特异性反应验证:
[0126]采用间接ELISA方法进行验证，包被重组抗原p239(l)、p239(3)、、p239 (4)每孔lOOng，将待检抗体稀释至I μ g/ml作为原始滴度加入100 μ L，并且10倍梯度稀释，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgGl:5000稀释加入100 μ L作为检测二抗，ELISA读值大于0.1为检测阳性，分析抗体与不同型抗原的反应滴度，比较特异性抗体分别与不同型HEV衣壳蛋白特异性反应性，结果如表1，列出HEV-C3-UHEV-C3-2与ρ239(1)、ρ239(3)、ρ239(4)的反应滴度，可见两株单抗均具有很好的特异性，与Ρ239 (I)无反应或弱反应；而对ρ239(3)和p239 (4)的反应性较强，至抗原加入量为0.01ng时依然能够检测出。
[0127]表1单抗与不同型HEV衣壳蛋白特异反应性
[0128]
【权利要求】
1.抗体或其抗原结合部分，其能够特异性结合3、4型戊型肝炎病毒而与I型戊型肝炎病毒不结合或弱结合； 优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第490位或4型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第504位的天冬酰胺； 更优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第489位、4型ORF2蛋白第503位的苏氨酸，3型ORF2蛋白第524位、4型ORF2蛋白第538位的精氨酸，和3型ORF2蛋白第532位、4型ORF2蛋白第546位的酪氨酸； 特别优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第489~532位氨基酸的多肽片段，或者包含4型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第503~546位氨基酸的多肽片段。
2.抗体或其抗原结合部分，其能够特异性结合3、4型戊型肝炎病毒ORF2蛋白、3型ORF2蛋白的第368-606位或4型第382-620位氨基酸、3型ORF2蛋白的第394-606位或4型第408-620位氨基酸、或这些蛋白的变体，而与I型戊型肝炎病毒与上述蛋白对应的蛋白或其变体不结合或弱结合； 优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第490位或4型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第504位的天冬酰胺，更优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第489位、4型ORF2蛋白第503位的苏氨酸，3型ORF2蛋白第524位、4型ORF2蛋白第538位的精氨酸，和3型ORF2蛋白第532位、4型ORF2蛋白第546位的酪氨酸，特别优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第489~532位氨基酸的多肽片段，或者包含4型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第503~546位氨基酸的多肽片段；和/或 优选地，所述抗体结合I型戊型肝炎病毒ORF2蛋白、ORF2蛋白的第368-606位氨基酸、ORF2蛋白的第394-606位氨基酸、或这些蛋白的变体的Kd值高于结合3、4型戊型肝炎病毒的上述蛋白或其变体的Kd值2倍以上，例如为2倍、4倍、8倍、16倍以上；和/或 优选地，所述抗体结合3、4型戊型肝炎病毒的上述蛋白或这些蛋白的变体的Kd值小于I X 10-8Μ，例如小于 5 X 10-9Μ。
3.抗体或其抗原结合部分，其所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第490位或4型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第504位的天冬酰胺； 优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第489位、4型ORF2蛋白第503位的苏氨酸，3型ORF2蛋白第524位、4型ORF2蛋白第538位的精氨酸，和3型ORF2蛋白第532位、4型ORF2蛋白第546位的酪氨酸； 更优选地，所述抗体所结合的抗原表位包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第489~532位氨基酸的多肽片段，或者包含4型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第503~546位氨基酸的多肽片段。
4.权利要求1-3任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体选自: 1)由保藏于中国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞系CCTCC-C201223所分泌的抗戊型肝炎病毒单克隆抗体HEV-C3-1 ； 2)由保藏于中国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞系CCTCC-C201231所分泌的抗戊型肝炎病毒单克隆抗体HEV-C3-2。
5.杂交瘤细胞株，其选自如下一组的杂交瘤细胞株: 。1)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC-C201223的杂交瘤细胞株HEV-C3-1 ； 。 2)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC-C201231的杂交瘤细胞株HEV-C3-2。
6.能特异性结合3、4型戊型肝炎病毒衣壳蛋白的抗体或其抗原结合部分，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，其中，所述抗体能够封闭所述的3、4型戊型肝炎病毒衣壳蛋白与选自以下单克隆抗体相结合的活性的至少50%、例如至少60%、至少70%、至少80%、例如至少85%、至少90%、至少95%: 。1)杂交瘤细胞株HEV-C3-1所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株HEV-C3-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC-C201223 ； 。2)杂交瘤细胞株HEV-C3-2所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株HEV-C3-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC-C201231 ； 优选地，所述抗体与选自I)和2)的单克隆抗体具有相同的表位。
7.3、4型戊型肝炎病毒的抗原表位，其能与权利要求1-4或6任一项的抗体或其抗原结合部分特异性结合，并且至少包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第490位或4型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第504位的天冬酰胺； 优选地，所述抗原表位包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第489位、4型ORF2蛋白第503位的苏氨酸，3型ORF2蛋白第524位、4型ORF2蛋白第538位的精氨酸，和3型ORF2蛋白第532位、4型ORF2蛋白第546位的酪氨酸； 更优选地，所述抗原表位包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第489~532位氨基酸的多肽片段，或者包含4型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第503~546位氨基酸的多肽片段。
8.组合物，其包含权利要求1-4或6任一项的抗体或其抗原结合部分、或者权利要求7的抗原表位。
9.检测样品中3、4型戊型肝炎病毒的方法，其包括使用权利要求1-4或6任一项的抗体或其抗原结合部分的步骤。
10.权利要求1-4或6任一项的抗体或其抗原结合部分的用途，其用于检测3、4型戊型肝炎病毒在样品中的存在或其表达水平，或者用于制备试剂盒，所述试剂盒用于检测3、4型戊型肝炎病毒在样品中的存在或其表达水平。
11.试剂盒或检测试剂，其包含权利要求1-4或6任一项的抗体或其抗原结合部分或权利要求7的抗原表位，所述试剂盒或检测试剂用于检测3、4型戊型肝炎病毒或诊断戊型肝炎。
12.权利要求1-4或6任一项的抗体或其抗原结合部分或权利要求7的抗原表位在制备试剂盒或检测试剂中的用途，所述试剂盒或检测试剂用于检测3、4型戊型肝炎病毒或诊断戊型肝炎。
13.权利要求1-4或6任一项的抗体或其抗原结合部分或权利要求7的抗原表位在制备预防或治疗戊型肝炎的药物中的用途。
14.一种制备抗体的方法，所述方法包括利用3、4型戊型肝炎病毒的抗原表位或包含该抗原表位的多肽或蛋白质进行免疫以获得抗体的步骤，所述3、4型戊型肝炎病毒的抗原表位至少包含3型戊型肝炎病毒0RF2蛋白第490位或4型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第504位的天冬酰胺； 优选地，所述抗原表位包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第489位、4型ORF2蛋白第503位的苏氨酸，3型ORF2蛋白第524位、4型ORF2蛋白第538位的精氨酸，和3型ORF2蛋白第532位、4型ORF2蛋白第546位的酪氨酸； 更优选地，所述抗原表位包含3型戊型肝炎病毒ORF2蛋白第489~532位氨基酸的多肽片段，或者包含4型戊 型肝炎病毒ORF2蛋白第503~546位氨基酸的多肽片段。
【文档编号】A61K39/42GK104031144SQ201310069913
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年3月5日 优先权日:2013年3月5日
【发明者】郑子峥, 唐自闽, 赵敏, 李晓静, 温桂平, 李婧娴, 张军, 夏宁邵 申请人:厦门大学, 厦门万泰沧海生物技术有限公司