一种针对HBx的siRNA及其脂质体制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种针对HBx的siRNA，以及用于转送该siRNA的脂质体。含有siRNA质粒，阳离子脂98N12-5，胆固醇和PEG化磷脂。该脂质体不仅具有良好的体内外稳定性，可以很好地到达靶部分，而且获得了较高的转染效率，有利于其发挥其将siRNA运送细胞抑制乙肝病毒基因HBx表达的作用，另外，其还具有较低的毒性，有利于其应用于体内研究。
【专利说明】—种针对HBx的s i RNA及其脂质体制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药制剂领域，具体涉及一种针对HBx的siRNA，以及用于转送该siRNA的脂质体。
【背景技术】
[0002]RNA干扰(RNA interfering, RNAi)是指双链RNA进入细胞后诱导靶基因mRNA发生特异性降解，导致目标基因mRNA沉默的现象，是生物长期进化过程中形成的对病毒等外源物质的防御系统。长度为21-23nt的siRNA (Small interfering RNA,小干扰核酸)能够引发RNAi，可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，并具备的高效性、易合成及易操作的特点，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。
[0003]HBV (乙型肝炎病毒)可导致急慢性肝炎及肝细胞癌。目前全球范围内约3.5亿人携带有HBV，而其中每年约有100万死于HBV感染的慢性并发症，如肝硬化、肝癌或两者并存。虽然目前已有预防用疫苗供应，但是对于慢性感染者的治疗选择仍然有限。研究表明，现有药物多数具有较强毒性和抗药性，因此更多的研究把目光集中到安全有效的RNAi上。乙型肝炎病毒X基因编码的X蛋白(HBx)，是一种多功能病毒调节蛋白，具有广泛的基因转录调控作用，并能与宿主细胞的多种蛋白质直接作用，从而调苄基因表达及宿主细胞蛋白质功能，进而影响病毒的复制、宿主细胞信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡及癌变等。设计针对HBx的siRNA将为治疗乙肝病毒提供一个新的方向。 [0004]siRNA的制备方法可分为体外和体内两种。体外化学合成、体外转录及体外利用RNaseIII (核糖核酸酶III)将大片段的RNA切割成多个小片段siRNA。通过体外制备通常可以得到成熟有功能的siRNA，在体内可以直接起效，但缺点是不稳定易降解。体内表达通常使用表达载体，多为质粒和病毒，这种方法的优点是稳定，适用于体内长期研究，同时有利于体外大量扩增，缺点是需要利用体内的元件表达出目标siRNA，效率会受到一定影响。本发明的发明人采用构建siRNA表达质粒的方法体内制备siRNA。
[0005]目前制约siRNA临床应用的主要问题，一是如何将siRNA运送到靶部位。在体内及体外环境中存在大量的核酸酶，siRNA (或siRNA表达质粒)经过较长时间放置或是在体内运送的过程中即可被核酸酶完全降解，因此未经保护的siRNA (或siRNA表达质粒)很难到达靶部位发挥药效；二是如何得到较高的转染效率。转染RNA (RNA transfect1n)是将RNA分子导入细胞的过程。当siRNA运送到靶部位后，希望其可以有效地进入细胞以发挥其作用。
[0006]脂质体特有的性质使其成为siRNA的良好载体。脂质体按照其荷电性可分为中性脂质体，负电性脂质体和正电性脂质体，含碱基(胺基)脂质体例如十八胺等的脂质体荷正电。(《药物新剂型与新技术》第2版，陆彬主编，人民卫生出版社)
siRNA为水溶性荷负电分子，脂质体对普通药物的装载技术并不适用于siRNA。中国专利200710072417.9公开了通过将荷负电的siRNA先与带正电的鱼精蛋白形成复合物，再将该复合物装载到脂质体中的方法，提高了脂质体的包封率。美国专利US20030078225A1中采用脱水-再水化的方式载药，但包封率仅有50%左右。大多数研究则通过加入阳离子脂的方式提高siRNA脂质体的包封率。现常用的阳离子脂包括DOTAP (二油酰基三甲基磷酸铵)、BisH0P (1、2_ 二 (十六烷氧基)-3-甲基氨基丙烷)及DOTMA (N_[l_(2、3_ 二油酰氧基)丙基-N、N、N-三甲基氯化铵])，这些阳离子脂能实现较高的包封率。在体外细胞实验中，利用这些阳离子脂质体制备的脂质体均有较高的转染效率(CN102144973A，CN101045037B，CN101801344A, US6656498B1, US20060002991A1 )，但这些含阳离子脂的脂质体都有一定的毒性，在进行体内体外实验时对剂量和给药方式有严格的要求，在一定程度上限制了其临床应用的可能(钟英强，《siRNA靶向沉默hTERT基因对人胰腺癌的凋亡抑制基因bcl-2和环氧合酶-2基因表达的影响》，中华临床医师杂志，2010年04卷08期；邓益斌，《阳离子脂质体作为基因治疗药物载体在小鼠体内的毒性研究》，中国科技论文在线，2008 )。
[0007]98N12-5是一种新型阳离子脂，用于制备阳离子脂质体(Akinc，2008 ；Frank-Kamenetsky，2008)，麻省理工学院申请的中国专利200680029788.2公开了 98N12-5的结构如下
【权利要求】
1.一种 SiRNA 序列，如 SEQ ID N0.1 所示:
5’ - GGTCTTTGTACTAGGAGGC-3’ (SEQ ID N0.1)。
2.—种siRNA表达载体，其特征在于它能体内表达如SEQ ID N0.1所示的siRNA序列。
3.—种如权利要求2所述siRNA表达载体的制备方法，其特征在于含有如下步骤: ①初步筛选得到具有明显抑制HBx基因表达的如SEQ ID N0.1所示的siRNA序列，②构建HBx的siRNA表达质粒,③测序鉴定连接得到的pDual_oligo5质粒。
4.一种含有如权利要求2所述siRNA表达载体的脂质体，其特征在于含有siRNA质粒，阳离子脂98N12-5，胆固醇和PEG化磷脂。
5.一种如权利要求4所述脂质体，其特征在于98N12-5:PEG化磷脂:胆固醇:siRNA质粒的摩尔比为 42:8-12:46-50:10-35。
6.—种如权利要求4或5所述脂质体,其特征在于所述PEG化磷脂为mPEG-CeramideC8。
7.一种制备如权利要求4-6中任一项所述脂质体的制备方法，其特征在于含有如下步 骤: ①空白脂质体制备:称取阳离子脂98N12-5，胆固醇和PEG化磷脂，加入无水乙醇，加热至全部溶解，和缓冲液混合，水化，整粒，得到粒径合适的空白脂质体备用，②siRNA质粒溶液制备:取siRNA质粒的浓溶液，用乙酸钠缓冲液、无水乙醇稀释成siRNA质粒溶液，③载药:将空白脂质体和siRNA质粒溶液采用交叉流的方式等体积混合，制备出siRNA质粒脂质体，孵育，④透析:以蔗糖为透析液，对上述载药脂质体透析，⑤冻干。
【文档编号】A61K9/127GK104031917SQ201310070051
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年3月6日 优先权日:2013年3月6日
【发明者】李春雷, 王雅娟, 高玉清, 王彩霞, 倪蓓蓓, 王艳玲 申请人:石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司