曲妥珠单抗突变体IgG及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程及免疫【技术领域】，公开了曲妥珠单抗突变体IgG及其应用。本发明通过对曲妥珠单抗重链编码DNA进行点突变，获得8个曲妥珠单抗IgG突变体，其重链的编码DNA序列选自SEQ?ID?NO.2～SEQ?ID?NO.9中的任意一条。本发明曲妥珠单抗各个突变体瞬时表达得到的蛋白纯化产率同曲妥珠单抗均很高。各突变体IgG可以在不影响IgG产率和热稳定性的前提下对曲妥珠单抗的ADCC效应有不同程度的提高，同曲妥珠单抗一样，可在制备抗癌药物中应用。
【专利说明】曲妥珠单抗突变体I gG及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程及免疫【技术领域】，涉及曲妥珠单抗突变体IgG及其应用。
【背景技术】
[0002] 自0KT3的作为抗体药物在1986年的第一次面市，抗体药物开发在过去的25年 中取得了不可思议的进步。在2010年的十种最畅销的药物中有五个（Humira，Remicade， Enbrel, Rituxan和Avastin)是抗体药物或Fc融合蛋白。
[0003] Her2是EGFR家族的成员之一并被发现在25-30%的乳腺癌病人中有高表达[1]， 据此Her2被认为是针对乳腺癌进行靶向治疗的重要靶点。1990年，Genentech的Fendly 等从一系列鼠单抗中分离到单克隆抗体4D5,并发现这个抗体结合Her2的胞外域，抑制 有Her2超表达的肿瘤细胞的生长[2]。4D5于1992年被人源化，人源化后的抗体被命名 为 Trastuzumab [3]，商品名为 Herceptin。Herceptin 于 1998 年被 FDA 批准作为和 Taxol (paclitaxel)联合用药治疗Her2高表达的转移性乳腺癌的一线药物。Herceptin还被批 准用于经过一轮或多轮化疗后的转移性乳腺癌。在胃肠道癌症治疗方面，Herceptin还被 批准和化疗药物一起治疗胃和胃食管结合区的Her2高表达的扩散性肿瘤（http://WWW. herceptin. com/breast)〇
[0004] Herceptin的作用机理被认为包括如下几个方面：1) Herceptin可以通过加速受 体的内吞作用和降解而降低细胞表面Her2的水平[4]，Herceptin还可以通过诱导p27/ Cdk2复合物的形成抑制细胞周期的进展[5, 6]。Herceptin的第三种作用机制为诱导抗体 介导的细胞毒作用（ADCC)，这一作用是通过Herceptin的Fc段和骨髓细胞表面抗体受体的 Fc γ RIII和Fc γ RIIB调控的[5, 7]。除此之外Here印tin还被认为有抑制肿瘤新血管形 成[8]和肿瘤扩散[5]的作用。在这些作用机制中，诱导ADCC被认为在Herceptin的功效 中起着重要的作用。
[0005] 改变氨基酸序列可以被用来提高抗体诱导ADCC的能力。人IgG受体家族包含三 个成员？(^1?1(0)64)，？(^1?11(0)32)和？(^1?111(0)16)。186和不同的抗体受体结合 可以带来截然不同的反应。和激活性抗体受体的结合FcyRI，FcyRIIA，FcyRIIIA结合 会带来激活反应，导致对目标细胞细胞毒性的发生。和抑制性抗体受体，主要为Fc γ RIIB， 结合会带来抑制反应，抑制对目标细胞细胞毒性的发生[9] (Ravetch，Annual review of immunology2001)〇
[0006] 通过一个文库的筛选，Stavenhagen等获得了对Fc γ RIIIA和Fc γ IIA的结合能 力有显著提高的Fc突变体，这些突变体包括F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L，F243L/ R292P/Y300L/P396L，F243L/R292P, /Y300L。这些突变体在体外ADCC实验中显示出比野生 型Fc明显提高的诱导ADCC的能力。在动物实验中这些Fc突变体显示出在低浓度下优于 野生型抗体的抑制肿瘤生长的能力[10]。
[0007] 通过ELISA和AlphaScreen测试,Anderson等筛选了对抑制性抗体受体Fc γ RIIB 结合力下降或对激活性抗体受体Fc γ RIIΙΑ结合力上升的Fc突变体。这些变异的一部分 在体外实验中显示出比野生型含野生型Fc的抗体约高出10倍的诱导ADCC的能力[11]。
[0008] 在另一个尝试中，Tsuji等仅仅突变了 Fc上的一个位点295。细胞水平上的体外 结合实验显示这个突变体Fc比野生型Fc与CD16结合能力提高了八倍，而且最高结合从 80%提高到了 95%。在体外实验中，包含这个Fc突变体的抗体显示出比野生型Fc抗体高出 约1，〇〇〇倍的诱导ADCC的能力。除此之外，包含这个突变体的抗体在浓度低于0. 001 μ g/ ml (包含野生型Fc抗体作用的通常浓度）时仍然可以诱导ADCC反应[12]。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供曲妥珠单抗突变体IgG。
[0010] 本发明的另一目的是提供该突变体IgG的应用。
[0011] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0012] 曲妥珠单抗突变体IgG，其重链的编码DNA序列选自SEQ ID Ν(λ 2?SEQ ID N0. 9 中的任意一条；氨基酸序列选自SEQ ID NO. 11?SEQ ID NO. 18中的任意一条，其轻链同 Trastuzumab野生型，轻链编码DNA序列为SEQ ID19,蛋白质序列为SEQ ID20。
[0013] 表达曲妥珠单抗突变体IgG的重组表达质粒，含有本发明所述的SEQ ID N0. 2? SEQ ID NO. 9中的任意一条。
[0014] 曲妥珠单抗突变体IgG重链编码DNA序列，其中突变体llgG的重链编码序列为 SEQ ID N0. 2,突变体2IgG的重链编码序列为SEQ ID N0. 3,突变体3IgG的重链编码序列 为SEQIDN0.4，突变体4IgG的重链编码序列为SEQIDN0.5，突变体5IgG的重链编码序 列为SEQIDN0.6，突变体6IgG的重链编码序列为SEQIDN0.7，突变体7IgG的重链编码 序列为SEQ ID N0. 8,突变体8IgG的重链编码序列为SEQ ID N0. 9。
[0015] 曲妥珠单抗突变体IgG重链氨基酸序列，突变体1 IgG重链氨基酸序列为SEQ ID NO. 11，突变体2IgG重链氨基酸序列为SEQ ID NO. 12,突变体3IgG重链氨基酸序列为SEQ ID NO. 13,突变体4IgG重链氨基酸序列为SEQ ID NO. 14,突变体5IgG重链氨基酸序列为 SEQ ID N0. 15,突变体6IgG重链氨基酸序列为SEQ ID N0. 16,突变体7IgG重链氨基酸序列 为SEQ ID N0. 17,突变体8IgG重链氨基酸序列为SEQ ID N0. 18。
[0016] 所述的表达质粒优选将SEQ ID NO. 2?SEQ ID NO. 9中的任意一条DNA序列重组 到真核表达载体PTGE5中所得。
[0017] 含有曲妥珠单抗突变体IgG编码DNA的宿主细胞。
[0018] 所述的宿主细胞优选含有本发明所述重组表达质粒的HEK293 - 6E细胞。
[0019] 本发明所述的曲妥珠单抗突变体IgG在制备抗癌药物中的应用。
[0020] 本发明所述的曲妥珠单抗突变体IgG优选在制备抗乳腺癌和/或胃癌药物中的应 用。
[0021] 本发明所述重组表达质粒在制备抗癌药物中的应用。
[0022] 本发明所述重组表达质粒优选在制备抗乳腺癌和/或胃癌药物中的应用。
[0023] 本发明所述的曲妥珠单抗即Trastuzumab野生型。
[0024] 有益效果：
[0025] 本发明通过对曲妥珠单抗重链编码DNA进行点突变，获得8个曲妥珠单抗IgG突 变体。曲妥珠单抗各个突变体瞬时表达得到的蛋白纯化产率同曲妥珠单抗(即Trastuzumab 野生型)均很高。在PBMC细胞调节下，突变体1、2、3、6、7、8介导的ADCC效应都比曲妥珠单 抗（即Trastuzumab野生型）有所提高；在NK92/⑶16A细胞调节下，8个突变体介导的ADCC 效应都比曲妥珠单抗（即Trastuzumab野生型）有所提高。用圆二色谱测IgG热稳定性的 结果显示突变后IgG的热稳定性并无显著下降。因此，本发明曲妥珠单抗(即Trastuzumab 野生型）的几个突变体IgG可以在不影响IgG产率和热稳定性的前提下对曲妥珠单抗（即 Trastuzumab野生型）的ADCC效应有不同程度的提高，同曲妥珠单抗（即Trastuzumab野生 型）一样，可在制备抗乳腺癌和/或胃癌药物中应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图 1.突变体 2 的 SDS-PAGE (A)和 Western blot (B)电泳图。
[0027] Lane Μ为蛋白质Marker, Lanel为还原条件下的转染6天后的培养基上 清，Lane2为非还原条件下的转染6天后的培养基上清，Lane P为阳性对照Human IgGl, Kappa (Sigma, Cat. No. 15154) 〇
[0028] 图2.纯化后Trastuzumab的野生型和突变体的SDS-PAGE电泳图。
[0029] 图3. PBMC细胞调节的靶细胞凋亡随Trastuzumab的野生型和各个突变体浓度的 变化。其中平滑曲线为拟合后曲线。
[0030] 图4. NK92/CD16A细胞调节的靶细胞凋亡随Trastuzumab的野生型和各个突变体 浓度的变化。其中平滑曲线为拟合后曲线。
[0031] 图5. Trastuzumab野生型和各个突变体在202nm和208nm的椭圆率随温度的变化 曲线。其中平滑曲线为用温度诱导的两态变性模型来拟合实验数据后得到的曲线。
【具体实施方式】
[0032] 以下结合附图及实施例对本发明作进一步的说明和解释。
[0033] 以下实施例中涉及的试剂及仪器：
[0034] 1、试剂
[0035] Freestyle293 培养基（Invitrogen，Carlsbad, CA，USA)
[0036] PEI(Polysciences, Eppelheim, Germany)
[0037] Goat Anti-Human IgG - HRP(GenScript，Cat. No. A00166)
[0038] Protein A Column(GE Healthcare, Cat. No. 17-0402-01)
[0039] Fetal Bovine Serum(Gibco, Invitrogen, Cat. No. 10437-036)
[0040] Penicilin-Streptomycin(Gibco, Invitrogen, Cat. No. 10378)
[0041] Phosphate-Buffered Saline(Gibco, Invitrogen Cat. No. 10010-023)
[0042] Phenol red free MEM 培养基（Invitrogen, Cat. No. 41061)
[0043] 96 孔板（Greiner, Cat. No. 655180)
[0044] Lebovitz，s L-15 培养基（Gibco, Invitrogen, Cat. No. 11415, Lot No. 862546)
[0045] pTGE5 真核表达载体（National Research Council of Canada, NRC)
[0046] 2、细胞系
[0047] HEK293-6E(National Research Council of Canada, NRC)
[0048] NK92/CD16A 细胞是 GenScript 生产的 NK92 细胞（ATCC, Cat. No. CRL-2407)的稳定 细胞系
[0049] MDA-MB-453 (ATCC, Cat. No. HTB-131)
[0050] 3、化验分析试剂盒
[0051] Quick Start? Bradford Protein Assay(Bio-Rad, Cat. No. 500-0201)
[0052] LDH 试剂盒(Roche, Cat. No. 11644793001)
[0053] ToxinSensor? Endotoxin Removal Kit (GenScript, Cat. No. L00338)
[0054] ToxinSensor? Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, Cat. No. L00350)
[0055] 4、仪器
[0056] AKTA purifierlOpurification system(GE Healthcare)
[0057] FlexStation3(Molecular Devices)
[0058] Jasco J-815CD spectrometer(Jasco Inc.)
[0059] 实施例1
[0060] 1. 1真核表达载体的构建
[0061] 分别合成八个突变体IgG的全长DNA以及Trastuzumab的野生型全长DNA序列， Trastuzumab的野生型重链DNA序列为SEQ ID NO. 1，突变体llgG的重链DNA序列为SEQ ID NO. 2，突变体2IgG的重链DNA序列为SEQ ID NO. 3，突变体3IgG的重链DNA序列为SEQ ID NO. 4，突变体4IgG的重链DNA序列为SEQ ID NO. 5，突变体5IgG的重链DNA序列为SEQ ID NO. 6，突变体6IgG的重链DNA序列为SEQ ID NO. 7，突变体7IgG的重链DNA序列为SEQ ID NO. 8，突变体8IgG的重链DNA序列为SEQ ID NO. 9，这些克隆的蛋白序列依次为SEQ ID10-18。Trastuzumab野生型及本文所描述的所有突变体的轻链均相同，其DNA序列为SEQ ID19,蛋白质序列为SEQ ID20。这些克隆在GenScript人工合成，经验证正确后，用重组的 方法插入到真核表达载体PTGE5中，得到用于表达各突变体全长IgG的各个表达质粒。。
[0062] 1. 2细胞培养和瞬时转染
[0063] 在锥形瓶中用无血清Freesty 1 e293培养基培养HEK293-6E细胞（37°C，5%C02)。等 到细胞长到适宜浓度以后，在其中加入实施例1制备的各个表达质粒与PEI的混合物转染。 转染六天后，收集培养基上清，用SDS-PAGE，Western blot和ELISA检测各个IgG的表达 量。1.3IgG提纯
[0064]将 1. 2 获得的各 IgG 上样到 protein A 柱，用 AKTA purif ierlOpurif ication system从细胞裂解液中提纯目的蛋白。纯化后蛋白储存于PBS缓冲液（pH7. 4)中，之 后用ToxinSensor?试剂盒来去除蛋白中的内毒素。目的蛋白的纯度及分子量用非还原 SDS-PAGE 分析·蛋白浓度米用 Quick Start?Bradford Protein Assay 计算。
[0065] 以突变体2为例，在HEK293-6E细胞的培养基上清中，在还原条件下用SDS-PAGE 和western blot都能检测到约在55kDa和25kDa的明显条带,分别为抗体的重链和轻链， 在非还原条件下，能检测到约在160kDa的条带(如图1)，说明突变体2IgG抗体可以被成功 表达出来。
[0066] 瞬时表达得到的蛋白用protein A色谱柱的纯化后的纯度和产率如图2和表1所 示。各个抗体的产率都很高，除了 Trastuzumab野生型第二次制备的产率稍低（44. 5mg/l) 以外，其它抗体产率都在100mg/l以上，突变体2第一次制备的产率更是高达629mg/l。纯 化后的抗体的纯度较高，都在80%以上(突变体6除外，纯度大概60%)。
[0067] 表1. Trastuzumab野生型和突变体的纯化产率
[0068]
【权利要求】
1. 曲妥珠单抗突变体IgG，其特征在于其重链的编码DNA序列选自SEQ ID NO. 2?SEQ ID NO. 9中的任意一条。
2. 根据权利要求1所述的曲妥珠单抗突变体IgG，其特征在于其重链的氨基酸序列选 自 SEQ IDN0. 11 ?SEQ ID NO. 18 中的任意一条。
3. 曲妥珠单抗突变体IgG重链编码DNA序列，其特征在于突变体llgG的重链编码序列 为SEQ ID NO. 2,突变体2IgG的重链编码序列为SEQ ID NO. 3,突变体3IgG的重链编码序 列为SEQIDN0.4，突变体4IgG的重链编码序列为SEQIDN0.5，突变体5IgG的重链编码 序列为SEQIDN0.6，突变体6IgG的重链编码序列为SEQIDN0.7，突变体7IgG的重链编 码序列为SEQ ID NO. 8,突变体8IgG的重链编码序列为SEQ ID NO. 9。
4. 曲妥珠单抗突变体IgG重链氨基酸序列，其特征在于突变体llgG重链氨基酸序列 为SEQ ID NO. 11，突变体2IgG重链氨基酸序列为SEQ ID NO. 12,突变体3IgG重链氨基酸 序列为SEQ ID NO. 13,突变体4IgG重链氨基酸序列为SEQ ID NO. 14,突变体5IgG重链氨 基酸序列为SEQ ID NO. 15,突变体6IgG重链氨基酸序列为SEQ ID NO. 16,突变体7IgG重 链氨基酸序列为SEQ ID NO. 17,突变体8IgG重链氨基酸序列为SEQ ID NO. 18。
5. 表达曲妥珠单抗突变体IgG的重组表达质粒，其特征在于含有权利要求3中所述的 SEQ ID NO. 2 ?SEQ ID NO. 9 中的任意一条。
6. 根据权利要求5所述的表达曲妥珠单抗突变体IgG的重组表达质粒，其特征在于所 述的表达质粒是将SEQ ID NO. 2?SEQ ID NO. 9中的任意一条DNA序列重组到真核表达载 体PTGE5中所得。
7. 含有权利要求3中所述的曲妥珠单抗突变体IgG重链编码DNA序列的宿主细胞。
8. 根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求5所 述重组表达质粒的HEK293 - 6E细胞。
9. 权利要求1所述的曲妥珠单抗突变体IgG在制备抗癌药物中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于权利要求1所述的曲妥珠单抗突变体IgG 在制备抗乳腺癌和/或胃癌药物中的应用。
11. 权利要求5所述重组表达质粒在制备抗癌药物中的应用。
12. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于权利要求5所述重组表达质粒在制备抗 乳腺癌和/或胃癌药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK104045714SQ201310081620
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月14日 优先权日:2013年3月14日
【发明者】张剑冰, 武术, 杨帅 申请人:南京金斯瑞生物科技有限公司